CN115844906A - 芍药内酯苷在制备治疗气道炎症性疾病的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了芍药内酯苷在制备治疗气道炎症性疾病的药物中的应用。本发明公开了芍药内酯苷的医药新用途，通过分别对erastin诱导的两种人气道上皮细胞系(Beas‑2B、HBE)的铁死亡模型进行芍药内酯苷干预，证明了芍药内酯苷可以有效缓解erastin诱导的气道上皮细胞死亡，能够显著减少erastin诱导的气道上皮细胞脂质过氧化、脂质过氧化产物积累及细胞内的二价铁离子水平。进一步证明了芍药内酯苷可以有效缓解气道上皮细胞铁死亡。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种芍药内酯苷在制备治疗气道炎症性疾病的药物中的应用。
背景技术
铁死亡是一种新型的铁依赖性的细胞死亡方式，是以细胞内铁离子累积为起点，脂质过氧化、脂质过氧化产物累积为关键驱动事件，细胞死亡为终点的细胞程序性死亡方式。其在细胞形态学改变，基因调控及生理生化特征等方面都与自噬、凋亡、坏死等存在显著差异。铁死亡的分子调控机制主要包括铁离子代谢，脂质过氧化反应(脂质代谢)及谷胱甘肽(GSH)代谢(抗氧化代谢)三方面。铁离子是铁死亡发生的重要因素，游离二价铁氧化性极强，富氧环境下可以与不同类型的磷脂氢过氧化物和脂质氢过氧化物发生芬顿(Fenton)反应，产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)。另一方面，介导脂质过氧化反应的一些酶发挥作用需要亚铁离子作为辅因子参与反应。脂质过氧化是铁死亡的核心驱动环节。脂质过氧化是指脂质在自由基、脂质过氧化酶的作用下发生氧化反应，脂质碳链氧化、断裂并产生脂质自由基、脂质氢过氧化物及活性醛等终产物(如丙二醛、4-羟基壬烯醛)，这些物质具有细胞毒性，最终导致细胞损伤坏死。GSH的耗竭会导致谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase,GPX4)失活，增加脂质过氧化反应。而GPX4被认为是关键的抗氧化酶，可直接清除脂质双层中的氢过氧化物并防止脂质ROS的堆积。其他一些已知的抗氧化通路机制如FSPI/CQ10/NAAPH通路等也是通过调控GSH等进而对铁死亡起调控作用。目前已经证实铁死亡在多种疾病中发挥重要作用，如各类癌症、神经推行性疾病、急性肾损伤、哮喘等。
气道上皮细胞发生损伤及死亡导致气道上皮完整性被破坏是诱发哮喘、慢阻肺等气道炎症性疾病相关病理特征出现的重要因素。而现有的关于气道上皮细胞损伤与哮喘、慢阻肺等气道炎症性疾病发病机制的研究并不能完全阐明哮喘、慢阻肺等气道炎症性疾病的复杂病理机制，越来越多研究表明气道上皮细胞铁死亡在哮喘、慢阻肺等气道炎症性疾病的发展进程中起重要作用。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供芍药内酯苷在制备治疗气道炎症性疾病的药物中的应用，尤其是在制备缓解气道上皮细胞铁死亡药物中的应用，可以有效缓解气道上皮细胞铁死亡。
所述芍药内酯苷的化学结构式如下：
本发明提供了芍药内酯苷在制备治疗气道炎症性疾病的药物中的应用。
可选的，所述治疗包括：保护气道上皮细胞活性、缓解气道上皮细胞铁死亡、抑制过氧化物水平、抑制亚铁离子水平中的一种或多种。
可选的，所述过氧化物包括脂质ROS和/或MDA。
可选的，所述气道上皮细胞包括人气道上皮细胞Beas-2B、人气道上皮细胞HBE中的一种或多种。
可选的，所述气道炎症性疾病包括由细胞铁死亡导致的气道炎症性疾病。
可选的，所述细胞铁死亡为erastin诱导的细胞铁死亡。
可选的，所述细胞铁死亡为erastin诱导的人气道上皮细胞Beas-2B和/或人气道上皮细胞HBE铁死亡。
可选的，所述气道炎症性疾病包括哮喘、慢阻肺中的一种或多种。
具体的，本发明提供了芍药内酯苷在制备缓解气道上皮细胞死亡的药物中的应用。
本发明还提供了芍药内酯苷在制备缓解气道上皮细胞铁死亡药物中的应用。
本发明还提供了芍药内酯苷在制备抑制气道上皮细胞脂质过氧化的药物中的应用。
本发明还提供了芍药内酯苷在制备降低气道上皮细胞亚铁离子含量的药物中的应用。
本发明用芍药内酯苷干预爱拉斯汀(erastin)诱导的气道上皮细胞(人正常肺(支气管)上皮细胞Beas-2B及HBE)铁死亡模型，发现：1.芍药内酯苷可以显著改善erastin引起的气道上皮细胞死亡：2.芍药内酯苷能够显著减少erastin诱导的气道上皮细胞脂质过氧化产物积累；3.芍药内酯苷可以显著降低erastin诱导的气道上皮细胞内的二价铁离子水平。由此证明芍药内酯苷可以有效缓解气道上皮细胞铁死亡。
基于此，本发明提供了用于治疗气道炎症性疾病的药物组合物，包括作为活性成分的芍药内酯苷，以及药物学上可接受的载体。
具体的，本发明提供了用于缓解气道上皮细胞铁死亡的药物组合物，包括作为活性成分的芍药内酯苷，以及药物学上可接受的载体。
与现有技术相比，本发明提供了芍药内酯苷在制备治疗气道炎症性疾病的药物中的应用。
本发明公开了芍药内酯苷的医药新用途，通过分别对erastin诱导的两种人气道上皮细胞系(Beas-2B、HBE)的铁死亡模型进行芍药内酯苷干预，证明了芍药内酯苷可以有效缓解erastin诱导的气道上皮细胞死亡，能够显著减少erastin诱导的气道上皮细胞脂质过氧化、脂质过氧化产物积累及细胞内的二价铁离子水平。进一步证明了芍药内酯苷可以有效缓解气道上皮细胞铁死亡。
附图说明
图1是芍药内酯苷对erastin诱导的Beas-2B细胞死亡的作用测试图；
图2是芍药内酯苷对erastin诱导的Beas-2B细胞脂质过氧化作用测试图；
图3是芍药内酯苷对erastin诱导的Beas-2B细胞内亚铁离子含量的作用测试图；
图4是芍药内酯苷对erastin诱导的HBE细胞死亡作用测试图；
图5是芍药内酯苷对erastin诱导的HBE细胞脂质过氧化作用测试图；
图6是芍药内酯苷对erastin诱导的HBE细胞内亚铁离子含量作用的测试图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的芍药内酯苷在制备缓解气道上皮细胞铁死亡药物中的应用进行详细描述。
实施例1芍药内酯苷对人气道上皮细胞Beas-2B铁死亡的药效作用研究
一、材料与方法
1.细胞系
人正常肺(支气管)上皮细胞(Beas-2B)，购自美国模式培养物集存库(AmericanType Culture Collection，ATCC)。用添加了商品化生长因子(5mL)、100U/mL青霉素和100μg/mL的链霉素的BEpiCM培养基，在37℃、CO2体积分数5％、完全饱和湿度条件下进行培养。
2.细胞活性检测
将Beas-2B以20000个每孔的密度接种于96孔板中。24h后，细胞融合至75％，进行不同药物(芍药内酯苷10μM/Fer-1 2μM/DFO 5μM)预处理1h后加入erastin(10μM)共同处理24h。到达干预时间点后，每孔加入10μL Cell Counting Kit-8细胞计数试剂(CCK8)检测试剂，37℃培养箱内孵育2h，使用酶标仪检测450nm处每孔吸光度值，根据公式计算细胞活力。
3.脂质活性氧检测
使用荧光探针BODIPYTM 581/591 C11检测活细胞内的脂质ROS含量。将Beas-2B以40000个每孔的密度接种于8孔的胶室载玻片，培养24h后进行相应药物干预。处理结束后，加入10μM BODIPYTM 581/591 C11染料，37度，5％CO2培养箱内孵育30min，PBS清洗3遍后进行荧光成像。
4.脂质过氧化产物丙二醛(MDA)检测
将细胞悬液收集至离心管内，300xg离心5min后去除上清，PBS重悬，相同条件离心去除上清。加入100μL Antioxidant PBS solution，吹打混匀。再加入100μL LysisBuffer，振荡混匀后室温静置5min。取部分裂解液BCA法检测蛋白浓度后向剩余样本内加入250μL工作液，振荡混匀，95℃孵育15min。冰浴5min后以10000xg离心10min。取100ul上清加入96孔黑板，荧光酶标仪检测荧光强度(Ex/Em:540/590nm)。根据MDA标准曲线计算样本中MDA含量，并通过BCA得到的蛋白质含量进行校正。
5.亚铁离子检测
使用荧光探针FerroOrange检测活细胞内2价铁离子含量。将Beas-2B以40000个每孔的密度接种于8孔胶室载玻片，培养24h后进行相应药物干预。到达干预时间后，每孔加入100xHoechast活细胞染料，37度，5％CO2培养箱孵育10min，HBSS洗涤2遍。加入含有FerroOrange(1μM)的培养基，37度，5％CO2培养箱内孵育30min。荧光显微镜下成像。
二、实验结果
1.芍药内酯苷对erastin诱导的Beas-2B细胞死亡的作用
Erastin是一种常用的铁死亡诱导剂。CCK8实验结果提示，erastin(10μM)可以显著降低Beas-2B细胞活力，造成细胞死亡。而芍药内酯苷及铁死亡抑制剂DFO、Fer-1均可逆转erastin造成的Beas-2B死亡，且药物本身对细胞无毒性/增殖作用，光学显微镜下观察各组细胞密度变化也符合该结果(见附图1)。
图1是芍药内酯苷对erastin诱导的Beas-2B细胞死亡的作用测试图，其中，A图是CCK8实验测得的各组细胞活力值；B图是镜下各组细胞密度变化。
注：Con：正常对照组；Era10：模型组；Era10/Alb 10：芍药内酯苷干预组；Era10/Fer-1 2：铁死亡抑制剂Fer-1干预组；Era10/DFO 5：铁死亡抑制剂DFO干预组。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs Con；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001vs Era10。
2.芍药内酯苷对erastin诱导的Beas-2B细胞脂质过氧化的作用
脂质过氧化是细胞发生铁死亡的主要特征之一，脂质过氧化产物堆积是铁死亡的驱动环节。用荧光探针BODIPYTM 581/591 C11指示Beas-2B脂质ROS的变化水平，结果提示：erastin处理后脂质ROS堆积增加，芍药内酯苷和铁死亡抑制剂可以有效清除细胞内堆积的脂质ROS。MDA是脂质过氧化的终产物，其含量可反映细胞膜脂质发生过氧化程度。实验结果说明，erastin处理后Beas-2B细胞MDA含量显著增加，脂质过氧化反应加剧，芍药内酯苷及铁死亡抑制剂Fer-1、DFO均可有效降低Beas-2B细胞MDA水平，减轻其脂质过氧化产物反应(见附图2)。
图2是芍药内酯苷对erastin诱导的Beas-2B细胞脂质过氧化作用测试图，其中，A、B图分别为各组具有代表性的脂质ROS荧光图及相应半定量分析结果。C图为脂质过氧化产物MDA结果图。
注：Con：正常对照组；Era10：模型组；Era10/Alb 10：芍药内酯苷干预组；Era10/Fer-1 2：铁死亡抑制剂Fer-1干预组；Era10/DFO 5：铁死亡抑制剂DFO干预组。CH:氢过氧化枯烯(Cumene hydroperoxide，CH)组，为脂质ROS染色阳性对照组。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs Con；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001vs Era10。
3.芍药内酯苷对erastin诱导的Beas-2B细胞内二价铁离子含量的作用
铁死亡是一种铁离子依赖性的细胞程序性死亡方式，不稳定铁离子池可介导fenton反应的发生，而二价铁对铁死亡发生具有重要意义。通过荧光探针FerroOrange检测活细胞内二价铁离子含量。实验结果说明，erastin可以显著增加Beas-2B细胞内亚铁离子含量，芍药内酯苷及铁死亡抑制剂DFO(铁螯合剂)，Fer-1均可有效降低细胞内的亚铁离子水平(见附图3)。
图3是芍药内酯苷对erastin诱导的Beas-2B细胞内亚铁离子含量的作用测试图，其中，A、B图分别为各组具有代表性的亚铁离子染色荧光图及相应半定量分析结果。
注：Con：正常对照组；Era10：模型组；Era10/Alb 10：芍药内酯苷干预组；Era10/Fer-1 2：铁死亡抑制剂Fer-1干预组；Era10/DFO 5：铁死亡抑制剂DFO干预组。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs Con；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001vs Era10。
实施例2芍药内酯苷对人气道上皮细胞HBE铁死亡的药效作用研究
一、材料与方法
1.细胞系
人支气管上皮样细胞(HBE),购自ATCC。用添加了商品化生长因子(5mL)、100U/mL青霉素和100μg/mL的链霉素的KM培养基，在37℃、5％CO2、完全饱和湿度条件下进行常规培养。
2.乳酸脱氢酶释放检测
检测细胞释放的乳酸脱氢酶Lactate dehydrogenase(LDH)含量以评估细胞损伤程度。将HBE以8000个每孔的密度接种于96孔板中，培养24h后进行药物干预。在干预时间到达1h前，将10％的LDH释放溶液加入最大酶活性组。到达药物干预时间后，分别取各孔上清80μL加入到一新的96孔板中，加入40μL工作液，轻敲混匀。于水平摇床上缓慢摇动，室温避光孵育30min，然后使用酶标仪检测490nm处吸光度。
3.脂质活性氧检测
操作同实验例1相应部分。
4.脂质过氧化产物丙二醛(MDA)检测
操作同实验例1相应部分。
5.亚铁离子检测
操作同实验例1相应部分。
二、实验结果
1.芍药内酯苷对erastin诱导的HBE细胞死亡的作用
细胞发生死亡时造成的细胞膜结构破坏会导致胞浆内的LDH释放至培养液中，通过检测释放的LDH含量可以对细胞毒性进行定量分析。LDH释放实验结果提示，erastin处理后HBE的LDH释放显著增加，芍药内酯苷及铁死亡抑制剂Fer-1均可逆转这一结果，且药物本身对细胞无毒性作用。显微镜下观察各组细胞密度变化与这一结果相符(见附图4)。
图4是芍药内酯苷对erastin诱导的HBE细胞死亡作用测试图，其中，A图是各组LDH释放结果图；B图是镜下各组细胞密度变化图。
注：Con：正常对照组；Era10：模型组；Era10/Alb 10：芍药内酯苷干预组；Era10/Fer-1 2：铁死亡抑制剂Fer-1干预组。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs Con；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001vs Era10。
2.芍药内酯苷对erastin诱导的HBE细胞脂质过氧化的作用
实验结果提示，erastin处理后HBE细胞脂质过氧化反应加剧，脂质过氧化产物大量堆积，芍药内酯苷及铁死亡抑制剂Fer-1、DFO可以有效减缓脂质过氧化反应的发生，清除脂质过氧化产物(见附图5)。
图5是芍药内酯苷对erastin诱导的HBE细胞脂质过氧化作用测试图。A图为各组具有代表性的脂质ROS荧光图。B图为MDA结果图。
注：Con：正常对照组；Era10：模型组；Era10/Alb 10：芍药内酯苷干预组；Era10/Fer-1 2：铁死亡抑制剂Fer-1干预组；Era10/DFO 5：铁死亡抑制剂DFO干预组；CH:氢过氧化枯烯(Cumene hydroperoxide，CH)组，为脂质ROS染色阳性对照组。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs Con；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001vs Era10。
3.芍药内酯苷对erastin诱导的HBE细胞内二价铁离子含量的作用
实验结果说明，erastin干预使HBE细胞内亚铁离子显著增加，而芍药内酯苷及铁死亡抑制剂Fer-1、DFO有效降低了细胞内的亚铁离子含量(见附图6)。
图6是芍药内酯苷对erastin诱导的HBE细胞内亚铁离子含量作用的测试图。A、B图分别为各组具有代表性的亚铁离子染色荧光图及相应半定量分析结果。
注：Con：正常对照组；Era10：模型组；Era10/Alb 10：芍药内酯苷干预组；Era10/Fer-1 2：铁死亡抑制剂Fer-1干预组；Era10/DFO 5：铁死亡抑制剂DFO干预组。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs Con；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001vs Era10。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.芍药内酯苷在制备治疗气道炎症性疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗包括：保护气道上皮细胞活性、缓解气道上皮细胞铁死亡、抑制过氧化物水平、抑制亚铁离子水平中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述过氧化物包括脂质ROS和/或MDA。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述气道上皮细胞包括人气道上皮细胞Beas-2B、人气道上皮细胞HBE中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述气道炎症性疾病包括由细胞铁死亡导致的气道炎症性疾病。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细胞铁死亡为erastin诱导的细胞铁死亡。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞铁死亡为erastin诱导的人气道上皮细胞Beas-2B和/或人气道上皮细胞HBE铁死亡。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述气道炎症性疾病包括哮喘、慢阻肺中的一种或多种。
9.用于治疗气道炎症性疾病的药物组合物，其特征在于，包括作为活性成分的芍药内酯苷，以及药物学上可接受的载体。
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