CN114561318A - 一株鼠乳杆菌及其在治疗ii型糖尿病中的应用 - Google Patents

一株鼠乳杆菌及其在治疗ii型糖尿病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株鼠乳杆菌及其在治疗II型糖尿病中的应用,属于生物医药领域。本发明提供是鼠乳杆菌,能够显著降低体重增长量、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)和胰岛素抵抗指数,明显改善腺组织病理损伤,上调胰岛素信号通路相关基因表达。本发明提供的鼠乳杆菌能够有效治疗II型糖尿病,为潜在的益生菌,具有广阔的前景。

Description

一株鼠乳杆菌及其在治疗II型糖尿病中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体的说,涉及一株鼠乳杆菌及其在治疗II型糖尿病中的应 用。
背景技术
II型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)是由于体内胰岛素分泌相对不足、靶细胞 对胰岛素敏感性降低,导致机体内糖、脂肪、蛋白质、水和电解质的代谢紊乱型疾病。在过 去的几十年里,糖尿病的发病率在全球范围内逐年增高,其在中国不同地区的患病率可高达 8.3%到12.7%,糖尿病患者90%以上为T2DM,T2DM的诊断、预防和治疗已成为一个紧迫 的研究课题。
肠道微生物组被认为是II型糖尿病病理生理学中一种新的、潜在的驱动因素,也是一个 潜在的II型糖尿病治疗新靶点。肠联系,选择特定肠道细菌菌株通过改善肠道微生物平衡和 改变微生物的道微生物的改变与疾病发展有着密切组成来有益地影响宿主,是目前治疗II型 糖尿病一种很有前景的治疗方法。
发明内容
本发明目的在于提供一株鼠乳杆菌及其在治疗II型糖尿病中的应用。
为实现上述目的,本发明提供了一株鼠乳杆菌,其保藏编号为CICC 23140,2008年10 月31日保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
该鼠乳杆菌为活细胞形式,是从小鼠肠道分离获得。
本发明还提供了如上述所述的鼠乳杆菌在制备治疗或改善II型糖尿病药物中的应用。
本发明还提供了如上述所述的鼠乳杆菌在制备改善II型糖尿病导致的体重增长或降脂药 物中的应用。本发明提供的菌株在减轻GK大鼠体重增长量实例中,该鼠乳杆菌治疗后大鼠 体重增长量显著降低,证实该鼠乳杆菌具有良好的降脂功效。
本发明还提供了如上述所述的鼠乳杆菌在制备改善II型糖尿病导致的血糖升高或降血糖 药物中的应用。在对血糖指标测定实例中,鼠乳杆菌能够明显降低GK大鼠血糖、胰岛素、 胰岛素敏感性。证实该鼠乳杆菌具有降血糖的效果。
本发明还提供了如上述所述的鼠乳杆菌在制备治疗或减轻II型糖尿病导致的胰腺组织病 理损伤或促进胰腺组织胰岛数目增多药物中的应用。在胰腺组织病理学检测实例中,鼠乳杆 菌治疗后胰腺组织胰岛数目增多,胰岛形状规则,无炎症产生。
本发明还提供了如上述所述的鼠乳杆菌在制备提高糖脂代谢相关基因表达药物中的应用。 在胰岛素信号通路基因表达测定实例中,鼠乳杆菌能够上调AMPK、P13K和AKT的表达。
另外,本发明提供了一种治疗II型糖尿病的药物组合物,包括鼠乳杆菌,其保藏编号为 CICC 23140,鼠乳杆菌作为药物组合物中的其中一种活性成分。
本发明的有益效果:
本发明提供的鼠乳杆菌显著降低体重增长量,改善II型糖尿病的空腹血糖(FBG)、空 腹胰岛素(FINS)和胰岛素抵抗指数,减轻胰腺组织病理损伤以及激活胰岛素信号通路基因 表达,效果显著,为潜在的益生菌,具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是鼠乳杆菌对GK大鼠体重增长率的影响;*表示与模型组相比差异显著(P<0.05), **表示与GK组相比差异极显著(P<0.01),LM,鼠乳杆菌治疗组;GK,模型组。
图2是鼠乳杆菌对GK大鼠FBG、FINS、HOMA-IR的影响;*表示与GK组相比差异显 著(P<0.05),**表示与GK组相比差异极显著(P<0.01);LM,鼠乳杆菌治疗组;GK,模 型组。
图3是鼠乳杆菌对GK大鼠胰腺组织切片的影响;LM,鼠乳杆菌治疗组;GK,模型组。
图4是鼠乳杆菌对GK大鼠糖脂代谢相关基因的影响;*表示与GK组相比差异显著(P<0.05),**表示与GK组相比差异极显著(P<0.01);LM,鼠乳杆菌治疗组;GK,模型 组。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,下面将对本发明的优选实施例进 行详细的说明,以方便技术人员理解。
选用7-9周龄雄性GK大鼠,购自上海斯莱克实验动物中心,符合《检测和校准实验室 能力认可准则在实验动物检测领域的应用说明》(CNAS-CL58)有关要求。
鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,菌种保藏编 号为:CICC 23140。
培养基配方及饲料配方:
MRS肉汤培养基:酪蛋白酶消化物10.0g,牛肉膏粉10.0g,酵母膏粉4.0g,柠檬酸三铵 2.0g,乙酸钠5.0g,硫酸镁0.2g,硫酸锰0.05g磷酸氢二甲2.0g,葡萄糖20.0g,吐温-801.08g;
标准饲料配方:基础饲料60%,猪油13.0%,蛋黄粉10.0%,胆固醇1.5%,胆盐0.5%, 食盐4.0%,白砂糖11.0%。
【实施例1】鼠乳杆菌能够降低GK大鼠体重增长量
1动物实验
GK大鼠基础饲料适应性喂养7d后,根据体重、TG、TC、HDL、LDL和FBG无显著性 差异随机分成鼠乳杆菌治疗组(LM)和GK模型组,每组8只大鼠,所有GK大鼠均饲喂标准 饲料和饮用蒸馏水。适应期7d结束后进入为期8周的干预期,治疗组以每只大鼠1x109CFU/mL 的剂量灌胃LM,每天给予1mL菌悬液灌胃。GK模型组灌胃等量的无菌生理盐水。
2鼠乳杆菌培养
活化菌种,进行传代恢复活力,将鼠乳杆菌接种于MRS肉汤培养基在恒温培养箱中37℃ 培养24小时。将培养好的菌株在4℃,4600g条件下离心10min;所得沉淀用PBS洗涤两次, 用菌落计数方法调整LM悬液浓度在1x109CFU/mL。
3生长指标的检测
每日观察大鼠活动情况及皮毛状况,记录动物死亡情况,每两天称量大鼠体重。
4实验结果
图1结果显示LM组体重增长量显著低于GK组,说明给予鼠乳杆菌处理后能够显著降 低GK大鼠的体重。
【实施例2】鼠乳杆菌降低GK大鼠血糖水平
1动物实验
GK大鼠基础饲料适应性喂养7d后,根据体重、TG、TC、HDL、LDL和FBG无显著性 差异随机分成LM治疗组和GK模型组、每组8只大鼠,所有GK大鼠均饲喂标准饲料和饮 用蒸馏水。适应期7d结束后进入为期8周的干预期,治疗组以每只大鼠1x109CFU/mL的剂 量灌胃LM,每天给予1mL菌悬液灌胃,GK模型组灌胃等量的无菌生理盐水。
2鼠乳杆菌培养
活化菌种,进行传代恢复活力,将鼠乳杆菌接种于MRS肉汤培养基在恒温培养箱中37℃ 培养24小时。将培养好的菌株在4℃,4600g条件下离心10min;所得沉淀用PBS洗涤两次, 用菌落计数方法调整LM悬液浓度在1x109CFU/mL。
3大鼠血清中血糖含量的测定
乙醚麻醉、眼眶采血,根据迈克生物股份有限公司提供的FBG测定试剂盒,采用日立 3100全自动生化分析仪测定。检测GK大鼠血清中空腹胰岛素使用上海酶联生物科技有限公 司提供的大鼠酶联免疫分析试剂盒,按照使用说明书,采用ELX808酶标仪(美国博腾公司) 在450nm处显色测定,胰岛素抵抗指数根据(FBGxFINS)/22.5计算。
4实验结果
图2结果显示给予鼠乳杆菌处理能够显著降低GK大鼠的空腹血糖和胰岛素浓度,并且 通过给予鼠乳杆菌后,LM组大鼠HOMA-IR也显著降低到接近正常水平,提示鼠乳杆菌可以 改善GK大鼠II型糖尿病的作用。
【实施例3】鼠乳杆菌减轻胰腺组织病理损伤
1动物实验
GK大鼠基础饲料适应性喂养7d后,根据体重、TG、TC、HDL、LDL和FBG无显著性 差异随机分成LM治疗组和GK模型组、每组8只大鼠,所有GK大鼠均饲喂标准饲料和饮 用蒸馏水。适应期7d结束后进入为期8周的干预期,治疗组以每只大鼠1x109CFU/mL的剂 量灌胃LM,每天给予1mL菌悬液灌胃,GK模型组灌胃等量的无菌生理盐水。
2鼠乳杆菌培养
活化菌种,进行传代恢复活力,将鼠乳杆菌接种于MRS肉汤培养基在恒温培养箱中37℃ 培养24小时。将培养好的菌株在4℃,4600g条件下离心10min;所得沉淀用PBS洗涤两次, 用菌落计数方法调整LM悬液浓度在1x109CFU/mL。
3组织病理学检查
将大鼠脱颈椎处死,解剖,摘取胰腺称重后,并固定于10%的甲醛溶液中,脱水,石蜡 包埋,切片,HE(苏木精-伊红染色)染色,显微镜镜检,图像采集分析。
4实验结果
图3结果显示,GK组大鼠胰腺组织中广泛胰岛形状不规则,伴有结缔组织增生,多见淋 巴细胞浸润,通过给予鼠乳杆菌后,大鼠胰岛形状规则,未见明显炎症产生,提示鼠乳杆菌 能够减轻GK大鼠胰腺组织病理损伤程度。
【实施例4】鼠乳杆菌能够激活胰岛素信号通路
1动物实验
GK大鼠基础饲料适应性喂养7d后,根据体重、TG、TC、HDL、LDL和FBG无显著性 差异随机分成Lactobacillus murinus治疗组和GK模型组、每组8只大鼠,所有GK大鼠均饲 喂标准饲料和饮用蒸馏水。适应期7d结束后进入为期8周的干预期,治疗组以每只大鼠1x109CFU/mL的剂量灌胃LM,每天给予1mL菌悬液灌胃,GK模型组灌胃等量的无菌生理 盐水。
2鼠乳杆菌培养
Lactobacillus murinus购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,培养条件为:LM接种于 MRS肉汤培养基在WPL-65BE恒温培养箱中37℃培养24小时。将培养好的菌株在4℃,4600 g条件下离心10min;所得沉淀用PBS洗涤两次,用菌落计数方法调整LM悬液浓度在1x109 CFU/mL。
3实时荧光定量PCR检测糖脂代谢相关基因
在治疗结束时提取肝脏总RNA。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗两次,清洗后用trzolUniversal Regent试剂盒分离总RNA,用超微量核酸测定仪在260nm和280nm处测定RNA 的浓度和纯度,利用FastKing RT KiT生成cDNA。在实时荧光定量PCR步骤中,将cDNA 用SuperRealPreMIX Plus(SYBR Green)进行实时荧光定量PCR。采用ABI 7500Fast real-time PCR系统(Applied Biosystems,USA),在20μL反应体积中进行40个循环的实时定量PCR。 引物序列见表1。
表1引物序列
基因 上游引物 下游引物
腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK) GAAGATTCGCAGTTTAGATG ATGTGCCTGTGACAGTAGTC
磷脂酰肌醇激酶(PI3K) CAGTAGGCAACCGTGAA CTGCTATGAGGCGAGTT
苏氨酸激酶(AKT) GAGGAGCGGGAAGAGTG GTGCCCTTGCCCAGTAG
4实验结果
研究结果显示LM组腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、磷脂酰肌醇激酶(P13K)和苏氨酸激 酶(AKT)基因的表达水平与GK组相比显著上调,说明鼠乳杆菌能够激活糖脂代谢相关基因表 达,改善GK大鼠的胰岛素抵抗(图4)。
最后说明的是,以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一株鼠乳杆菌,其特征在于:所述鼠乳杆菌的保藏编号为CICC 23140。
2.根据权利要求1所述的一株鼠乳杆菌,其特征在于:所述鼠乳杆菌为活细胞形式。
3.权利要求1或2所述的鼠乳杆菌在制备治疗或改善II型糖尿病药物中的应用。
4.权利要求1或2所述的鼠乳杆菌在制备改善II型糖尿病导致的体重增长或降脂药物中的应用。
5.权利要求1或2所述的鼠乳杆菌在制备改善II型糖尿病导致的血糖升高或降血糖药物中的应用。
6.权利要求1或2所述的鼠乳杆菌在制备治疗或减轻II型糖尿病导致的胰腺组织病理损伤或促进胰腺组织胰岛数目增多药物中的应用。
7.权利要求1或2所述的鼠乳杆菌在制备提高糖脂代谢相关基因表达药物中的应用。
8.治疗II型糖尿病的药物组合物,其特征在于:鼠乳杆菌作为其中一种活性成分;鼠乳杆菌的保藏编号为CICC 23140。
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