WO2014000119A1

WO2014000119A1 - 一种抗快速性心律失常的制剂及其制备方法

Info

Publication number: WO2014000119A1
Application number: PCT/CN2012/000867
Authority: WO
Inventors: 陈可冀; 杜守颖; 马晓昌
Original assignee: 佛山市顺德区合生源医药研发有限公司
Priority date: 2012-06-25
Filing date: 2012-06-25
Publication date: 2014-01-03
Also published as: US20130344175A1; ZA201304737B; EP2679233B1; JP6436618B2; US8993007B2; EP2679233A1; JP2014005282A; CN103764158A; CA2820388A1; CN103764158B; KR20140000658A

Abstract

一种抗快速心律失常的延胡索提取物，该提取物由如下方法制成：延胡索粗粉，用乙醇提取，滤液减压浓缩得流浸膏，取处理好的D101树脂，将制备得到的流浸膏上柱，去离子水除杂，乙醇洗脱，回收乙醇，浓缩得延胡索提取物干膏。

Description

一种抗快速性心律失常的制剂及其制备方法技术领域

本发明涉及一种中药制剂及其制备方法，特别涉及一种抗快速性心律失常的的制剂及其制备方法。

背景技术

快速性心律失常是急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI ) 急性期死亡的重要原因之一。虽然溶栓或介入治疗对挽救濒死心肌或改善心肌供血有效，但对其并发症心律失常不能获得满意的效果。对于绝大多数的心律失常，药物治疗是基础和首选的治疗方法，现临床常用的药物其存在一定的副作用和治疗局限性，因此，研究开发疗效迅速、安全可靠、作用独特的抗快速性心律失常的新型药物非常必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗快速性心律失常的制剂及其制备方法。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种延胡索提取物，延胡索粗粉 100重量份，用 600-1000体积份 60- 80%乙醇提取 1-3次，合并滤液，减压浓缩至相对密度为 0. 2--0. 5g/mL 的流浸膏；取处理好的 D101 树脂，取制备得到的流浸膏上柱，流速 0. 2—0. 5 mL/min, 去离子水除杂，流速 0. 2-0. 5 mL/min, 60-90%乙醇洗脱，流速 0. 4- -0. 8 mL/min，浓缩得延胡索提取物干膏。

本发明优选如下技术方案

延胡索粗粉 100 重量份，用 800 体积份 70%乙醇提取 2次，合并滤液，减压浓缩至 0. 3g/mL流浸膏；取处理好的 D101树脂，取制备得到的流浸膏上柱，流速 0. 4 mL/min, 去离子水除杂，流速 0. 4 mL/min， 80%乙醇洗脱 8倍柱体积，流速 0. 6 mL/min，回收乙醇，浓缩得延胡索提取物干膏。

按照常规方法加入常规辅料，将延胡索干膏制成临床可接受的剂型，包括但不限于丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液体制剂或注射剂等。

本发明 D101型大孔吸附树脂径高比为 1 : 4-8；流浸膏上样液调节 ρΗ1-2，使沉淀溶散。优选 D101型大孔吸附树脂径高比 1 : 7, 流浸膏上样液调节 pHl. 5。本发明所述重量份和体积份的关系为 g/ml的关系。

延胡索为常用中药，其性温，味苦辛，入心、肝、脾、肺经，具有活血、利气、止痛的功效，能治一身上下诸痛，用于胸痹、真心痛的治疗。本发明前期试验从复方中筛选出延胡索单味药治疗快速性心律失常取得肯定的疗效，本发明根据延胡索提取物极性的差别，制备水提取部位，醇提取部位，生物碱萃取有机相部位，生物碱萃取水相部位，大孔树脂富集部位，原药材细粉，延胡索乙素原料药七个不同的药效筛选部位，进行药效筛选试验。优选出药效最佳的部位进行精制。

附图说明

图 1 大孔吸附树脂对巴马汀的静态最大吸附量和解析量效果比较

图 2 大孔吸附树脂对巴马汀的静态解析率效果比较

图 3 大孔吸附树脂对延胡索乙素的静态最大吸附量和解析量效果比较

图 4 大孔吸附树脂对延胡索乙素的静态解析率效果比较

图 5 不同浓度的上样液中两种成分过树脂柱后纯度比较

图 6 不同浓度的上样液中两种成分过树脂柱后转移率比较

图 7 HPD300型树脂泄露曲线

图 8 D101型树脂泄露曲线

图 9 HPD300型树脂乙醇洗脱浓度的考察 -洗脱量比较

图 10 HPD300型树脂乙醇洗脱浓度的考察 -转移率比较

图 11 D101型树脂乙醇洗脱浓度的考察 -洗脱量比较

图 12 HPD300型树脂乙醇洗脱体积的考察（n=2 )

图 13 D101型树脂乙醇洗脱体积的考察（n=2)

图 14 HPD300型树脂碱性乙醇洗脱体积的考察（n=2 )

图 15 HPD300型树脂用碱水活化后各成分累积洗脱率

图 16 D101树脂径高比洗脱率考察

图 17 D101树脂径高比纯度考察

图 18 药材筛选部位制备示意图

实验例一：药效筛选部位的制备

1 仪器和材料

1. 1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪（SPD- 20AVWD 检测器，四元低压梯度泵，柱温箱，自动进样器；日本岛津公司， LCSolution色谱工作站）； Dikma Diamonsil C18柱（4. 6mmX 250mm， 5 m; 柱号： 8132893) ; ETTLER AE 240 型电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）； Sartorius BS110S型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）； YP10002 型电子天平（上海越平科学仪器有限公司）。 1. 2材料

101型大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司，药用级别）；延胡索乙素（郑州荔诺生物科技有限公司）

1. 2. 1试剂

乙醇（北京化工厂分析纯），三氯甲垸（北京化工厂分析纯），盐酸（北京化工厂分析纯），氨水（汕头市西陇化工厂有限公司分析纯）

1. 2. 2对照品

延胡索乙素对照（批号： 110726-200409)购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用

2方法与结果

2. 1 醇提取物的制备（5号样品）

延胡索粗粉 100 g, 用 800 mL80%乙醇提取 2次，合并滤液，减压浓缩得 120 mL流浸膏，干燥，得固体醇提取物。

2. 2 D101树脂富集产物 ( 1号样品）

取处理好的 D101树脂 10 m 装入内径为 1. 0 cm的玻璃柱中，水洗至无醇味，按方法 2. 1制备得到的流浸膏 6. 0 mL上柱，流速 3. 5 mL/h, 去离子水除杂，流速 3. 5 mL/h, 80%乙醇洗脱 36 mL, 流速 3 mL/min，浓缩得干膏，为大孔树脂富集产物。

2. 3脂溶性生物碱萃取物及水溶性生物碱部位制备（2-3号样品）

取 200 g延胡索粉末，加入 1600 mL80%乙醇，回流 1. 5 h, 提取两次，过滤得滤液，减压浓缩成稠膏，体积约为 200 mL, 用 1. 0 mol/L的盐酸调 pH=l， 5 °C下静置 24 h，滤过并洗涤沉淀，滤液加水至 400 mL, 用氨水调节 pH值 pH=10, 最后调节体积得 500 mL 总液体，用二氯甲垸（300 mLX 2 )萃取两次，合并有机相，减压回收溶剂得脂溶性生物碱部分（3号样品）；萃取后水的水液，浓缩，干燥得水溶性生物碱（2号样品）

2. 4水提取部位制备（4号样品）

延胡索乙素粗粉 100 g，用 800 mL水煎煮 1. 5 h，煎煮 2次，纱布过滤，滤液浓缩至 400 mL, 干燥得到干浸膏为水提取部位。延胡索药材筛选部位制备见示意图 18。

表 1 药效筛选试验药物分组

"Έ^ 延胡索乙素含量

¥ D101柱洗脱物 4. 25%

2号萃取水相（水溶性生物碱部分） 0

3号萃取有机相（脂溶性生物碱部分） 11. 18%

号水提干浸膏 0. 204% 5号醇提干浸膏 7. 30%

6号延胡索乙素原料药 92. 3%

7号延胡索药材细粉 0. 12%

实验例二药效筛选试验（样品同实验例一）

1 实验材料

1. 1实验动物

CD小鼠 90只，雄性，体重 28-30 _g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为 SCXk (京) 2006-0009.

1. 2药品

1. 3试剂

FeCl₃. 6H₂0 (北京化工厂生产， A. R. )，红四氮唑（北京化工厂生产，批号： 950221 )。

1. 4仪器

TT实体显微镜（北京电光科学仪器厂），恒温水浴振荡器 SHZ-22型（江苏大仓医疗器械厂），电子分析天平（日本岛津， AEG- 220型）。

2 实验方法

2. 1试验分组

动物随机分为 9组，每组 10只：模型组（生理盐水 10 mL/kg),对照药胺碘酮 78 mg/kg 组， 1号药 18. 2 mg/kg， 2号药 157. 6 mg/kg组， 3号药 9. 1 mg/kg组， 4号药 462 mg/kg 组， 5号药 139 mg/kg组， 6号药 1. 16 mg/kg组， 7号药 1. 3 g/kg组。给药前各药均以生理盐水配至所需浓度，给药途径为十二指肠，给药量为 10 mL/kg。

2. 2手术方法

动物以戊巴比妥钠腹腔麻醉（60 mg/kg), 开腹，十二指肠给入生理盐水或药物，关腹；给药后 45分钟，连接生理记录仪（PowerLab) 记录标准 II导联心电图，尾静脉注入 CaCl₂ ( 180 m/kg, 10 mg/raL, 10 秒内匀速给入），观察是否诱发心律失常心电图，记录心律失常持续时间；结果进行统计学处理。

2. 3 评分标准及试验结果

观察是否诱发心律失常心电图，记录心律失常持续时间；结果进行统计学处理。统计结果见表 2:

表 2 药效筛选结果

序号持续时间

1 62 0 108 103 95 110 226 79 155

2 164 86 110 54 140 110 100 130 190

3 161 88 40 82 56 130 89 80 195

4 123 120 65 83 20 140 180 70 92

5 130 60 110 71 165 55 130 70 220

6 105 106 120 63 57 92 190 79 60

7 120 76 52 80 114 73 86 100 76

8 74 53 75 82 119 77 139 47 101

9 96 104 87 165 130 202 189 181 150

10 196 99 120 57 33 90 120 104 102 平均 123.1 79.2 88.7 84.0 92.9 107.9 144.9 94.0 134.1 值

SD 41.7 34.7 29.3 31.9 48.8 42.1 48.6 38.0 55.4 t值 2.5565 2.1335 2.3520 1.4862 0.8110 1.0757 1.6297 0.5012

2.5 结论

模型组为阴性对照组，胺碘酮组为阳性组，最后以发生心率失常持续时间短者为优。由结果可知， 4、 5、 7号样品药效较差或没有药效； 3、 6号样品的药效中等； 1 号和 2 号样品药效和阳性组比较接近。由药效结果可知，延胡索中无论脂溶性生物碱成分和还是水溶性生物碱成分均对快速性心率失常有一定作用，在这七个组分中，大孔树脂柱洗脱成分既包含脂溶性生物碱，也包含水溶性生物碱，药效突出。

实验例三延胡索大孔吸附树脂富集纯化工艺

1 仪器和材料

1.1仪器

LC-20AT 高效液相色谱仪（SPD- 20AWD 检测器，四元低压梯度泵，柱温箱，自动进样器；日本岛津公司， LCSolution 色谱工作站）； METTLER AE 240 型电子分析天平 (上海梅特勒 -托利多仪器有限公司）； SartoriusBSllOS 型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 材料

1.2.1 试剂

甲醇（Fisher公司，色谱纯）；乙腈（迈瑞达公司色谱纯）；磷酸（天津市光复精细化工研究所，色谱纯）；醋酸（Fisher 公司，色谱纯）；三乙胺（天津市光复精细化工研究所，分析纯）；纯净水（杭州娃哈哈有限公司）；氢氧化钠（天津市光复精细化工研究所，分析纯）；盐酸（北京化工厂，分析纯）

1. 2. 2对照品

脱氢紫堇碱（批号： 042-30751 和光纯药工业株式会社)；

延胡索乙素（批号： 110726-201011，中国药品生物制品检定所，供含量测定盐酸巴马汀（批号： 732-9002，中国药品生物制品检定所，供含量测定用）

2 大孔吸附树脂类型的性极极 *极极极极筛选

性 w ¾性lj一一 - - 采用静态吸附法，通过测定最大吸附量与解析率来筛选最合适的大孔吸附树月取了八种型号的大孔吸附树脂，具体数据如表 3: 表 3八种型号的大孔吸附树脂:

ϋ ϋ ϋ 比表面 (mVg) 平均孔径 (A° ) ΓΈ

1 D101 400 100-110

2 HPD300 800-870 50-55

3 X-5 500、600 290〜300

4 AB-8 480-520 130-140

5 HPD722 485-530 130-140

6 HPD400 500-550 75—80

7 HPD750 650—700 85—90

8 ADS-7 取上述处理好的树脂各 5 mL，置具塞三角瓶中，除去表面水分，精密加入浓缩至 0. 3 g生药 / mL的延胡索提取液 200 mL，振摇，放置 24小时，抽滤，并用 30 mL蒸馏水洗涤开 s s s ® ® 树脂，合并抽滤液及水洗液定容于 250 mL容量瓶中，摇匀，高效液相测定乙素含量，计算最大吸附量。平行操作两份。取上述水洗后的大孔吸附树脂，加 95%乙醇 200 mL，浸泡 24 h，抽滤，并用 95%乙醇 30 mL洗涤树脂，合并乙醇液，定容于 250 mL容量瓶中，摇匀，高效液相测定含量，计算解析率。最大吸附量 = [ (初始溶液浓度一吸附后溶液浓度） X吸附液体积 /树脂体积] (mg/mL树脂) 解析率 = [ (洗脱液浓度 X洗脱液体积) / (比吸附量 X树脂体积) ] X 100%

表 4大孔吸附树脂对巴马汀的静态吸附解吸附效果比较树脂类型数值型号最大吸附量解析率 (％) 最大吸附量 X解吸率

(mg/mL)

非极性 D101 2. 0797 98. 4748 2. 0480

X-5 1. 9862 97. 8411 1. 9433

HPD300 2. 682 94. 0186 2. 5216

弱极性 AB-8 2. 2104 94. 9575 2. 0989 HPD722 2. 1297 96. 9996 2. 0658 中极性 HPD750 2. 2188 88. 9986 1. 9747

HPD400 1. 7822 102. 3005 1. 8232

极性 ADS-7 0. 4087 90. 3156 0. 3691 由实验结果可知， HPD300对于季胺型生物碱的吸附远远高于其他类型树脂，其解吸附量也很高，但其解析率在这八种树脂中排名靠后。

D101型树脂对于季铵型生物碱的吸附量和解析量不算最大，但是它的解析率较高。表 5 大孔吸附树脂对延胡索乙素的静态吸附解吸附效果比较树脂类型数值型号最大吸附量解析率 (%) 最大吸附量 X解吸率

(rag/mL )

非极性 D101 4. 3776 98. 9378 4. 3311

X- 5 3. 9202 96. 1614 3. 7697

HPD300 4. 3214 94. 2223 4. 0718

弱极性 AB-8 4. 0115 96. 72 3. 88

HPD722 4. 1363 89. 9138 3. 7191 中极性 HPD750 4. 1496 100. 093 4. 1535

HPD400 3. 6653 101. 9065 3. 7351 极性 ADS-7 2. 6578 95. 9967 2. 5514 由实验结果可知， HPD300对于延胡索乙素的吸附量较高，解析量和解析率不高； D101 型树脂对延胡索乙素的吸附量、解析量和解析率均较高。

从吸附量、解析量和解析率三方面考虑， HPD300型树脂和 D101型树脂均有各自的优势，因此在接下来的实验中，将这两种树脂进行对比试验。

3 上柱液浓度考察

取一定量的提取液，浓缩成 0. 15g生药 /mL， 0. 3g生药 /mL， 0. 5g生药 /mL，三个浓度，体积为 100 raL, 50 raL, 30 mL, 分别上在 10 mL大孔树脂柱，水洗三倍柱体积，用 95%乙醇洗脱三倍柱体积。将洗脱液进液相测定相关成分的含量，并计算转移率及纯度。结果如表 6 ：

表 6 上柱液浓度考察结果

转移率纯度

浓度

延胡索乙素巴马汀延胡索乙素巴马汀

0. 15g/mL 63. 26% 87. 67% 2. 83% 2. 63%

0. 3g/mL 69. 83% 92. 97% 2. 77% 2. 42%

0. 5g/mL 66. 30% 94. 03% 2. 77% 2. 51% 综合考虑转移率，纯度和离心沉淀量，最终选择 0. 3g/mL的浓度作为上柱液的浓度。

4 上样液 pH的考察将延胡索醇提取液浓缩至 0. 3g生药 /mL，用浓盐酸依次调节 pH分别为 6 (不调 pH)、 5、 4、 3、 1. 5，每一个 pH点超声 20min，放置 1 h，观察沉淀溶散情况。发现 pH在 1. 5 的时候，沉淀能溶散不结成块，因此确定上柱液 pH值为 1. 5。

5 大孔吸附树脂的预处理及装柱

将待筛选的树脂用 95%乙醇回流处理，至回流液在试管中加水稀释不浑浊，紫外分光光度法测定乙醇回流液吸收值小于 0. 1，将处理好的树脂装于层析柱中临用前用蒸馏水冲洗色谱柱，直至流出液用酒精计测量乙醇含量为 0，备用。平行操作两份。

6 上柱液的制备

称取延胡索药材粗粉， 8倍量 80%乙醇回流提取 2次，每次 1 h，提取液过滤，合并滤液，减压浓缩至 0. 3 g生药 /mL。高效液相色谱法测定上柱液中延胡索乙素和巴马汀的含里，备用

7 最大上样量考察

7. 1 HPD300型树脂最大上样量考察

取处理好的 HPD300型大孔树脂 20 raL, 装于 2根层析柱，取 pH为 1. 5的上样液以 0. 4 mL/min流速上样，每一倍柱体积收集一次，测定其中脱氢紫堇碱、巴马汀、延胡索乙素的含量，绘制泄露曲线。结果如图 7: 表 7 HPD300型树脂最大上样量的考察（n=2 )

上样倍数泄露量 /ug

脱氢紫堇碱巴马汀

1 0. 4117 0

2 1. 2890 0

3 1. 2576 0

4 1. 4980 0

5 1. 6046 0. 2132

6 1. 4731 0. 2489

7 1. 6860 0. 1981

8 2. 4267 0. 7056

9 5. 9836 2. 4892

10 7. 4632 3. 6978 11 15. 5734 8. 7385

12 20. 6402 11. 7724

13 78. 4829 45. 6343

14 211. 8286 116. 2819

15 351. 4834 188. 1947

从泄露曲线可知，从第 7倍柱体积的时候，脱氢紫堇碱开始泄露，为了保证上样时不易泄漏，确定最大上样量为 6倍柱体积，即 1. 8g生药 /mL树脂。

7. 2 最大上样量的考察

取处理好的 D101型大孔树脂 lO mL, 装于 2根层析柱（ 12腿 I. D. )，取上样液以 0. 4 mL/min流速上样，每一倍柱体积收集一次，并须 Ϊ定其中脱氢紫堇碱、巴马汀、延胡索乙素的含量，绘制泄露曲线。结果见表 8和图 8: 表 8 D101型树脂最大上样量的考察（n=2)

泄漏量 / u g

上样体积（BV)

巴马汀脱氢紫堇碱延胡索乙素

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

6 0 0 0

7 0 0 0

8 0 0. 001 0

9 0. 008 0. 005 0

10 0. 053 0. 037 0

11 0. 133 0. 129 0

12 0. 373 0. 269 0

13 0. 974 0. 878 0

14 1. 201 1. 043 0

15 1. 625 1. 512 0 从泄露曲线可知，巴马汀从第 9倍柱体积开始泄露，脱氢紫堇碱从第 8倍柱体积幵始泄露，延胡索乙素一直没有泄露，为了保证上样时各成分不泄漏，确定最大上样量为 7 倍柱体积，即 2. lg生药 /mL树脂。

8 上样流速考察 8. 1 HPD300型树脂上样速度考察

取处理好的 HPD300型大孔树脂 10 mL，装于同一型号的层析柱，精密吸取上样液 60 mL, 分别以 0. 4 mL/min， 0. 6 mL/min, 0. 8 mL/min的流速进行动态吸附，测定上样流出液，结果 0. 4 mL/min和 0. 6 mL/min的流速上样 6倍柱体积无泄露，用 0. 8 mL/min的流速上样第五倍柱体积开始泄露，因此，最终选择 0. 6 mL/min为上样流速。

8. 2 D101型树脂上样速度考察

取处理好的 D101型大孔树脂 10 mL, 装于 2根层析柱（ 12mml. D. ), 精密吸取上样液 70 mL, 分别以 0. 4 mL/min, 0. 6 mL/min, 0. 8 mL/min进行动态吸附，每一倍柱体积收集一次，并测定其中脱氢紫堇碱、巴马汀、延胡索乙素的含量，发现当以 0. 4 mL/min的速度上样时，上样液无泄露，因此，选择 0. 4 mL/min的速度为上样流速。

9 乙醇洗脱浓度的考察

9. 1 HPD300型树脂乙醇洗脱浓度的考察

取处理好的 HPD300型大孔树脂 10 mL装于 2根层析柱（12minl. D. )，精密吸取上样液 60 mL, 以 0. 6 mL/min的速度进行动态上样，水洗三倍柱体积（0. 6 mL/min) 后，依次用 20%、 40%、 60%、 80%、 95%的乙醇各洗脱 3倍柱体积，流速为 0. 6mL/min，分别测定各浓度醇洗液中延胡索乙素和巴马汀的含量和出膏量，计算洗脱率和纯度。

另取取处理好的 HPD300型大孔树脂 10 mL装于 2根层析柱（12瞧1. D. ), 精密吸取上样液 60 mL, 以 0. 6 mL/min的速度进行动态上样，水洗三倍柱体积（0. 6 mL/min) 后，直接用 95%的乙醇洗脱 3倍柱体积，流速为 0. 6 mL/min, 测定醇洗液中延胡索乙素和巴马汀的含量和出膏量，计算洗脱率和纯度。

从图中可以看出，经过乙醇梯度洗脱，水溶性生物碱和脂溶性生物碱在不同的醇浓度下被洗脱，水溶性生物碱在 40%醇下可被洗脱，脂溶性生物碱在 95%醇下被洗脱，直接用 95%的乙醇，可同时将二者洗脱，因此，醇洗脱浓度定为 95%乙醇。

9. 2 D101型树脂乙醇洗脱浓度的考察

取处理好的大孔树脂 10 mL装于同一型号层析柱中，精密吸取上样液 70 mL，以 0. 4 mL/min进行动态上样吸附，水洗 4倍柱体积，洗脱流速 0. 4 mL/min, 再依次用 20%、 40%、 60%、 80%、 95%的乙醇各洗脱 3倍柱体积，洗脱流速为 0. 4 mL/min, 分别测定各浓度醇洗脱液中三种成分的含量，结果如下图 11 :

从图中可以看到，水溶性生物碱在低浓度的醇中即可洗脱，而延胡索乙素为叔胺型水不溶生物碱，在 80%的乙醇中洗脱率达到最大，综合考虑，决定选择 80%的乙醇作为洗脱溶剂。

10 乙醇洗脱体积的考察

10.1 HPD300型树脂乙醇洗脱体积的考察

取处理好的大孔树脂 10 mL，装于同一型号的层析柱中，精密吸取上样液 60 mL，以 0.6 mL/min进行动态上样吸附，水洗 3倍柱体积，用 95%乙醇洗脱 15BV, 计算脱氢紫堇碱，巴马汀和延胡索乙素的累积洗脱率。表 9 HPD300型树脂乙醇洗脱体积的考察（n=2)

洗脱倍数脱紫％巴马汀％延胡索乙素

1BV 39.05 55.53 16.59

2BV 64.67 87.72 52.08

3BV 72.16 92.72 70.51

4BV 73.15 94.07 80.75

5BV 73.67 94.78 87.4

6BV 73.97 95.19 91.01

7BV 74.26 95.55 93.65

匿 74.61 95.96 95.42

9BV 74.81 96.22 96.58

10BV 74.95 96.42 97.46

11BV 75.01 96.6 98.04

12BV 75.06 96.64 98.45

13BV 75.09 96.7 98.75

14BV 75.12 96.72 98.99

15BV 75.16 96.72 99.27 从实验结果图 12可知，使用 95%乙醇洗脱，巴马汀在 6BV时洗脱率可以达到 95%以上，延胡索乙素在 8BV时可以达到 95%以上，脱氢紫堇碱的洗脱率最终为 78%

10.2 D101型树脂乙醇洗脱体积的考察

取处理好的大孔树脂 10 mL装于同一型号层析柱中，精密吸取上样液 70 mL，以 0.4 mL/miri进行动态上样吸附，水洗 4倍柱体积，洗脱流速 0.4 mL/min, 再依次用 80%的乙醇洗脱 10倍柱体积，洗脱流速为 0.6 mL/min, 每 10 mL收集洗脱液一次，分别测定各体积醇洗脱液中三种成分的含量和出膏量。结果如表 10 和图 13: 表 10 D101型树脂乙醇洗脱体积的考察（n=2)

累积洗脱率 /%

洗脱倍数

巴马汀紫堇碱乙素

1 67.38 59.38 35.84

2 96.99 92.445 67.27

3 98.37 94.145 78.175

4 98.785 94.66 85.695

5 98.975 94.885 91.55

6 99.11 95.02 95.42

7 99.195 95.105 98.18

8 99.26 95.155 100.115

9 99.26% 95.18 101.325

10 99.27 95.205 102.05 从结果图 13可知，当洗脱体积达到 8倍柱体积时，三种成分的洗脱率均在 95%以上，因此，最终确定洗脱体积为 8倍柱体积。

11 HPD300型树脂工艺条件改进

应用 HPD300型树脂，脱氢紫堇碱的洗脱率较低，为此，通过改善上样和洗脱条件，优化对脱氢紫堇碱的洗脱率。

11.1使用碱性乙醇洗脱

取处理好的大孔树月 1旨 10mL，装于同一型号的层析柱中，精密吸取上样液 60 mL，以

0.6 mL/min进行动态上样吸附，水洗 3倍柱体积。

取 95%乙醇 120 m 加入 NaOH，调节 pH值到 8.5，洗脱流速为 0.6 mL/min，洗脱体积 12BV, 接收洗脱液， ¾则定三个成分的累积洗脱率。表 11 HPD300型树脂碱性乙醇洗脱体积的考察（_n=2)

洗脱体积脱氢紫堇碱巴马汀延胡索乙素

1BV 46.01 52.66 6.81

2BV 68.44 70.27 42.34

3BV 72.83 74.27 68.25

4BV 75.26 76.74 81.25

5BV 76.92 78.64 90.21

6BV 78.12 80.18 95.31

7BV 78.98 81.49 98.48

8BV 79.63 82.62 100.58

9BV 80.12 83.54 102.01

10BV 80.52 84.31 103

11BV 80.84 84.97 103.74 12BV 81. 11 85. 54 104. 28 从实验结果表 11和图 14来看，将乙醇调成碱性以后，对脱氢紫堇碱的洗脱率提高有所帮助，但是效果不明显，洗脱率仅在 80%左右，而巴马汀的洗脱率有所下降。

11. 2氢氧化钠溶液活化大孔树脂柱

取处理好的大孔树脂 10 mL，装于同一型号的层析柱中，精密吸取上样液 60 mL, 以 0. 6 mL/min进行动态上样吸附，水洗 3倍柱体积。

再用 0. 1 raol/L的 NaOH溶液洗脱 3BV，洗脱流速为 0. 6 mL/min, 放置 1 h，用 95% 乙醇洗脱 10BV, 计算三种成分的累积洗脱率。表 12 HPD300型树脂碱水活化后乙醇洗脱体积的考察（_n=2 )

平均洗脱率％

脱紫巴马汀乙素

碱水洗 1 0. 03 0 0

碱水洗 2 0. 1 0 0

碱水洗 3 0. 18 0 0

1 13. 25 7. 385 9. 305

2 30. 025 24. 46 44. 725

3 41. 74 38. 325 66. 78

4 48. 035 46. 69 80. 025

5 52. 315 53. 11 87. 445

6 55. 11 57. 76 99. 31

7 57. 085 61. 55 L01. 9

8 58. 385 64. 3 103. 485

9 59. 425 66. 665 104. 575

10 60. 08 68. 475 105. 33 从实验结果表 10和图 15可知，使用碱水活化后，季胺碱成分的洗脱率均下降，脱氢紫堇碱累积洗脱率在 60%，巴马汀累积洗脱率在 68%左右，延胡索乙素的洗脱在 10BV 时可以完全洗脱。

由于脱氢紫堇碱洗脱率不高，考虑是树脂型号选择不当。综合考虑，决定采用 D101 树脂为富集树脂。

12 D101树脂水洗流速及体积

取处理好的 D101型大孔树脂 10 mL, 装于 2根层析柱（12瞧1. D. ), 精密吸取上样液 70 mL, 分别以 0. 4 mL/min的上样流速进行动态吸附，然后用蒸馏水以 0. 4 mL/min 洗至 Molish反应呈阴性。 Molish反应：取 ImL清洗液，加两滴 Molish试剂，摇匀。倾斜试管，沿管壁小心加入 ImL浓硫酸，切勿摇动，小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜色变化。结果发现水洗至 4倍柱体积时，清洗液接近无色， Molish反应呈阴性，生物碱反应试剂测定水洗液中无生物碱泄漏，故确定水洗体积为 4BV。

13 乙醇洗脱速度的考察

取处理好的大孔树脂 10 mL装于同一型号层析柱中，精密吸取上样液 70 mL，以 0.4 mL/min进行动态上样吸附，水洗 4倍柱体积，洗脱流速 0.4 mL/rnin, 再依次用 80%的乙醇洗脱 10倍柱体积，洗脱流速为 0.6 mL/min和 0.8 mL/min, 分别测定各浓度醇洗脱液中三种成分的含量和出膏量。计算洗脱率和出膏率。结果如下表：

D101型树脂乙醇洗脱速度的考察（n=2)

醇洗脱流速洗脱率纯度

出膏率 .

(mL/min) 脱氢紫堇碱巴马汀延胡索乙素脱氢紫堇碱巴马汀延胡索乙素

0.6 92.27 86.94 101.16 1.41% 14.81 2.77 4.17

0.8 92.13 86.50 97.90 1.36% 15.39 2.87 3.69 三种成分的洗脱率中比较，流速为 0.6 mL/min组较高，而出膏率略大，本着洗脱完全的原则，选择流速为 0.6 mL/min

14径高比的考察

分别取处理好的树脂 6.8 mL， 10mL， 12.2mL装于同一型号层析柱，使径高比为 1: 5， 1： 7， 1： 9，分别精密吸取上样液 47.6mL， 70mL和 85.4mL，以 0.4 mL/rain上样，水洗 3倍柱体积， (0.4 mL/min), 80%乙醇洗脱八倍柱体积， (0.6 mL/min), 测定洗脱液中脱氢紫堇碱、巴马汀和延胡索乙素的含量和出膏率，计算洗脱率和纯度。

D101型树脂径高比的考察（n=2)

洗脱率纯度

径高比

脱氢紫堇碱巴马汀延胡索乙素脱氢紫堇碱巴马汀延胡索乙素

1:5 85.71 96.32 81.09 11.2 2.32 3.24

1:7 91.18 101.55 90.24 11.49 2.36 3.48

1:9 95.69 99.64 86.21 11.47 2.2 3.15 从结果可以看出，径高比对结果的影响较小，考虑到实际生产的需要，选择确定的径高比为 1:7。 15 小试验证试验

按上述大孔吸附树脂富集纯化工艺制备三批样品，测定总生物碱含量。

表 15 大孔树脂树脂工艺验证

质量 Ang 浓度吸光度含量 /% 对照品 5.7 0.228 1.0446

样品 1 6.3 0.126 0.4026 69.74 样品 2 5.6 0.112 0.3464 67.51 样品 3 5.64 0.1128 0.3456 66.87 平均 68.04 从实验结果图 16、图 17可知，该纯化工艺稳定可行。

大孔吸附树脂工艺总结： D101型大孔吸附树脂，上样液浓度为 0.3 g/mL，调节上样液 PH1.5使沉淀溶散，径高比 1: 7，上样量 2.1 g生药 /mL树脂，水洗除杂体积 4BV, 流速 0.4 mL/min，乙醇洗脱浓度为 80%，洗脱流速为 0.6 mL/min，洗脱体积为 8BV。

具体实施方式

实施例 1:

延胡索粗粉 100 g，用 800ml70%乙醇提取 2次，合并滤液，减压浓缩至 0.3g/mL流浸膏；取处理好的 D101树脂，取制备得到的流浸膏上柱，流速 0.4mL/min，去离子水除杂，流速 0.4 mL/min， 80%乙醇洗脱 8倍柱体积，流速 0.6 mL/min，回收乙醇，浓缩得延胡索提取物干膏。实施例 2

一种延胡索提取物，延胡索粗粉 100g，用 700ml, 70%乙醇提取 3次，合并滤液，减压浓缩至相对密度为 0.5g/mL的流浸膏；取处理好的 D101树脂，取制备得到的流浸膏上柱，流速 0.2mL/min，去离子水除杂，流速 0.5mL/min， 60%乙醇洗脱，流速 0.8mL/min，浓缩得延胡索提取物干膏。实施例 3

延胡索粗粉 100 g，用 800ml70%乙醇提取 2次，合并滤液，减压浓缩至 0.3g/mL流浸膏；取处理好的 D101树脂，树脂径高比 1: 7，流浸膏上样液调节 pH2，使沉淀溶散；取制备得到的流浸膏上柱，流速 0.4 mL/min，去离子水除杂，流速 0.4 mL/min， 80%乙醇洗脱 8倍柱体积，流速 0.6 mL/min，回收乙醇，浓缩得延胡索提取物干膏。按照常规方法加入常规辅料，将延胡索干膏制成滴丸。实施例 4

一种延胡索提取物，延胡索粗粉 100g，用 700ml，70%乙醇提取 3次，合并滤液，减压浓缩至相对密度为 0. 5g/mL的流浸膏；取处理好的 D101树脂，树脂径高比为 1 : 8，流浸膏上样液调节 pHl. 5，使沉淀溶散；取制备得到的流浸膏上柱，流速 0. 2 mL/min，去离子水除杂，流速 0. 5 mL/min, 60%乙醇洗脱，流速 0. 8 mL/rain, 浓缩得延胡索提取物千膏。按照常规方法加入常规辅料，将延胡索干膏制成胶囊剂。实施例 5:

延胡索粗粉 100 g，用 1000ml80%乙醇提取 2次，合并滤液，减压浓缩至 0. 3g/mL流浸膏；取处理好的 D101树脂，取制备得到的流浸膏上柱，流速 0. 4 mL/min，去离子水除杂，流速 0. 4 mL/min， 80%乙醇洗脱 8倍柱体积，流速 0. 6 mL/min，回收乙醇，浓缩得延胡索提取物干膏。按照常规方法加入常规辅料，将延胡索干膏制成片剂。实施例 6

一种延胡索提取物，延胡索粗粉 100g，用 700ml， 70%乙醇提取 3次，合并滤液，减压浓缩至相对密度为 0. 5g/mL的流浸膏；取处理好的 D101树脂，取制备得到的流浸膏上柱，流速 0. 2 mL/min, 去离子水除杂，流速 0. 5 mL/min, 60%乙醇洗脱，流速 0. 8 mL/min，浓缩得延胡索提取物干膏。按照常规方法加入常规辅料，将延胡索干膏制成口服液体制剂。实施例 7

延胡索粗粉 100 g，用 800ml 70%乙醇提取 2次，合并滤液，减压浓缩至 0. 3g/mL流浸膏；取处理好的 D101树脂，树脂径高比 1 : 7，流浸膏上样液调节 pH2，使沉淀溶散；取制备得到的流浸膏上柱，流速 0. 4 mL/min，去离子水除杂，流速 0. 4 mL/min， 80%乙醇洗脱 8倍柱体积，流速 0. 6 mL/min, 回收乙醇，浓缩得延胡索提取物干膏。按照常规方法加入常规辅料，将延胡索干膏制成颗粒剂。实施例 8

一种延胡索提取物，延胡索粗粉 100g，用 700ml，70%乙醇提取 3次，合并滤液，减压浓縮至相对密度为 0. 5g/mL的流浸膏；取处理好的 D101树脂，树脂径高比为 1 : 8，流浸膏上样液调节 pHl. 5，使沉淀溶散；取制备得到的流浸膏上柱，流速 0. 2 mL/min, 去离子水除杂，流速 0. 5 mL/min， 60%乙醇洗脱，流速 0. 8 mL/min，浓缩得延胡索提取物干膏。按照常规方法加入常规辅料，将延胡索干膏制成注射剂。

Claims

权利要求

1、一种抗快速性心律失常的延胡索提取物，其特征在于该提取物由如下方法制成：延胡索粗粉 100重量份，用 600-1000体积份 60-80%乙醇提取 1-3次，合并滤液，减压浓缩至相对密度为 0.2--0.5g/mL的流浸膏；取处理好的 D101树脂，取制备得到的流浸膏上柱，流速 0.2-0.5 mlJmin, 去离子水除杂，流速 0.2-0.5 mlJmin, 60-90%乙醇洗脱，流速 0.4--0.8 mL/min, 浓缩得延胡索提取物干膏。

2、如权利要求 1所述的延胡索提取物，其特征在于该提取物由如下方法制成- 延胡索粗粉 100重量份，用 800体积份 70%乙醇提取 2次，合并滤液，减压浓缩至

0.3g/mL流浸膏；取处理好的 D101树脂，取制备得到的流浸膏上柱，流速 0.4 mL/min，去离子水除杂，流速 0.4 mL/min, 80%乙醇洗脱 8倍柱体积，流速 0.6 mL/min，回收乙醇，浓缩得延胡索提取物干膏。

3、如权利要求 1或 2所述的延胡索提取物，其特征在于其中所述的 D101型大孔吸附树脂径高比为 1 : 4-8。

4、如权利要求 3所述的延胡索提取物，其特征在于其中所述的 D101型大孔吸附树脂径高比 1 : 7。

5、如权利要求 1、 2或 4所述的延胡索提取物，其特征在于其中所述大孔吸附树脂流浸膏上样液调节流浸膏上样液调节 ρΗ1-2。

6、如权利要求 3所述的延胡索提取物，其特征在于其中所述大孔吸附树脂流浸膏上样液调节流浸膏上样液调节 ρΗ1-2。

7、如权利要求 5所述的延胡索提取物，其特征在于其中所述大孔吸附树脂流浸膏上样液调节 pH1.5。

8、如权利要求 6所述的延胡索提取物，其特征在于其中所述大孔吸附树脂流浸膏上样液调节 pH1.5。

9、如权利要求 1、 2、 4、 6、 7或 8所述的延胡索提取物，其特征在于该提取物按照常规方法加入常规辅料，制成临床可接受的丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液体制剂或注射剂。

10、如权利要求 3所述的延胡索提取物，其特征在于该提取物按照常规方法加入常规辅料，制成临床可接受的丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液体制剂或注射剂。

11、如权利要求 5所述的延胡索提取物，其特征在于该提取物按照常规方法加入常规辅料，制成临床可接受的丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液体制剂或注射剂。

12、一种抗快速性心律失常的延胡索提取物的制备方法，其特征在于该方法：延胡索粗粉 100重量份，用 600-1000体积份 60-80%乙醇提取 1-3次，合并滤液，减压浓缩至相对密度为 0.2 0.5g/mL的流浸膏；取处理好的 D101树脂，取制备得到的流浸膏上柱，流速 0.2 0.5 mL/min，去离子水除杂，流速 0.2-0.5 mL/min， 60-90%乙醇洗脱，流速 0.4-0.8 mL/min, 浓缩得延胡索提取物干膏。

13、如权利要求 12所述的延胡索提取物的制备方法，其特征在于该方法为：延胡索粗粉 100重量份，用 800 体积份 70%乙醇提取 2次，合并滤液，减压浓缩至 0.3g/mL流浸膏；取处理好的 D101树脂，取制备得到的流浸膏上柱，流速 0.4 mL/min, 去离子水除杂，流速 0.4 mL/min， 80%乙醇洗脱 8倍柱体积，流速 0.6 mL/min，回收乙醇，浓缩得延胡索提取物干膏。

、如权利要求 12或 13所述的延胡索提取物的制备方法，其特征在于其中所述的 D101 型大孔吸附树脂径高比为 1 : 4-8。

15、如权利要求 14所述的延胡索提取物的制备方法，其特征在于该方法中所述的 D101 型大孔吸附树脂径高比 1 : 7。

16、如权利要求 12、 13或 15所述的延胡索提取物，其特征在于其中所述大孔吸附树脂流浸膏上样液调节流浸膏上样液调节 ρΗ1-2。

17、如权利要求 14所述的延胡索提取物的制备方法，其特征在于该方法中所述大孔吸附树脂流浸膏上样液调节流浸膏上样液调节 ρΗ1-2。

18、如权利要求 16所述的延胡索提取物的制备方法，其特征在于该方法中所述大孔吸附树脂流浸膏上样液调节 pH1.5。

19、如权利要求 17所述的延胡索提取物的制备方法，其特征在于该方法中所述大孔吸附树脂流浸膏上样液调节 pH1.5。

20、如权利要求 12、 13、 15、 17、 18或 19所述的延胡索提取物的制备方法，其特征在于该方法中提取物按照常规方法加入常规辅料，制成临床可接受的丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液体制剂或注射剂。

21、如权利要求 14所述的延胡索提取物的制备方法，其特征在于该方法中提取物按照常规方法加入常规辅料，制成临床可接受的丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液体制剂或注射剂。

22、如权利要求 16所述的延胡索提取物的制备方法，其特征在于该方法中提取物按照常规方法加入常规辅料，制成临床可接受的丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液体制剂或注射剂。

23、如权利要求 1-2、 4、 6-8、 10-11 中任一所述的所述的延胡索提取物在制备治疗快速性心律失常的药物中的应用。