KR20140000658A

KR20140000658A - 항-빈맥성 부정맥을 위한 조제용 물질 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20140000658A
Application number: KR1020130073136A
Authority: KR
Inventors: 케지 첸; 슈잉 두; 샤오창 마
Original assignee: 화신규안 오브 차이니즈 메디신 리서치 앤드 디벨롭먼트 컴퍼니 리미티드 인 순더 디스트릭트 오브 포산
Priority date: 2012-06-25
Filing date: 2013-06-25
Publication date: 2014-01-03
Also published as: CN103764158B; CN103764158A; JP2014005282A; US20130344175A1; JP6436618B2; CA2820388A1; EP2679233A1; WO2014000119A1; US8993007B2; ZA201304737B; EP2679233B1

Abstract

본 발명은 항-빈맥성(anti-tachyarrhythmia) 부정맥을 위한 현호색 추출물에 관한 것으로, 상기 추출물은 하기의 방법에 의해 제조된다: 미가공의 현호색 가루 100 중량부를 60 내지 80% 에탄올 600 내지 1000 부피부로 1 내지 3회 추출하고, 상기 추출물을 여과하여 혼합한 뒤, 상기 혼합물을 0.2 내지 0.5 g/mL의 상대밀도의 유동엑스(fluidextract)로 감압하여 농축하고, 가공된 101 수지(resin)를 취하여, 상기 유동엑스를 0.2 내지 0.5 mL/분의 유속으로 제조하고, 탈염수(deionized water) 0.2 내지 0.5 mL/분의 유속으로 불순물(impurity)을 제거하며, 상기 유동엑스를 0.4 내지 0.8 mL/분의 유속으로 60 내지 90%의 에탄올로 용출하고, 상기 용출물을 현호색 추출 건조 페이스트(dry paste)로 제조하기 위해 농축하였다. 상기 현호색 추출물은 종래 부속품(conventional accessories)을 추가하는 일반적인 방법에 따라 추출물은 임상적으로 허용가능한(clinically acceptable) 알약(pills), 캡슐(capsules), 과립제(granules), 정제(tablets), 경구액(oral liquid) 또는 주사액(injection)으로 제조된다. 상기 추출물은 항-빈맥성 부정맥의 치료에 현저한 효과를 나타낸다.

Description

항-빈맥성 부정맥을 위한 조제용 물질 및 이의 제조방법{A preparation used for anti-tachyarrhythmia and its preparation method}

본 발명은 중국 전통의약(traditional Chinese medicine) 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 항-빈맥성(anti-tachyarrhythmia) 부정맥을 위한 조제용 물질 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

급성 심근경색(acute myocardial infarction; AMI) 급성기(acute phase)에 있어서, 빈맥성(tachyarrhythmia) 부정맥은 사망의 주요 원인 중 하나이다. 임종 전의 심근경색 회복(myocardial salvage) 또는 심근 혈액공급(myocardial blood supply)을 위한 혈전용해(thrombolytic) 또는 중개치료(interventional therapy)가 가능하지만, 그 합병증 부정맥(complications arrhythmia)에 대해서는 만족스러운 효과를 얻지 못한다. 대부분 부정맥에 대해서 약물치료가 기반이 되고, 바람직한 치료방법이며, 현재 임상에서 주로 사용하는 약물은 약간의 부작용과 치료에의 제한이 있어, 항-빈맥성 부정맥에 특이적인 역할을 하는, 빠르고, 안전하며, 신뢰할 수 있는 새로운 약물의 연구 및 개발이 필요하다.

본 발명의 목적은 항-빈맥성(anti-tachyarrhythmia) 부정맥을 위한 조제용 물질 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기의 기술적 단계를 통해 달성하는 것을 목적으로 한다:

1) 현호색(Rhizoma Corydalis) 추출물의 한 종류로, 미가공의 현호색 가루 100 중량부를 60 내지 80% 에탄올 600 내지 1000 부피부로 1 내지 3회 추출하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 추출물을 여과하여 혼합하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 혼합물을 0.2 내지 0.5 g/mL의 상대밀도의 유동엑스(fluidextract)로 감압하여 농축하는 단계;

4) 가공된 101 수지(resin)를 취하고, 상기 단계 3)의 유동엑스를 0.2 내지 0.5 mL/분의 유속으로 제조하고, 탈염수(deionized water) 0.2 내지 0.5 mL/분의 유속으로 불순물(impurity)을 제거하는 단계;

5) 상기 단계 4)의 유동엑스를 0.4 내지 0.8 mL/분의 유속으로 60 내지 90%의 에탄올로 용출하는 단계;

6) 상기 단계 5)의 용출물을 현호색 추출 건조 페이스트(dry paste)로 제조하기 위해 농축하는 단계.

바람직하게, 본 발명은 하기의 기술적 단계를 포함하는 방법으로 달성된다:

1) 미가공의 현호색 가루 100 중량부를 70% 에탄올 800 부피부로 2회 추출하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 추출물을 여과하여 혼합하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 혼합물을 0.3 g/mL의 상대밀도의 유동엑스로 감압하여 농축하는 단계;

4) 가공된 101 수지를 취하고, 상기 단계 3)의 유동엑스를 0.4 mL/분의 유속으로 제조하고, 탈염수 0.4 mL/분의 유속으로 불순물을 제거하는 단계;

5) 상기 단계 4)의 유동엑스를 0.6 mL/분의 유속으로 80%의 에탄올 8배 부피로 용출하는 단계;

6) 상기 단계 5)의 용출물을 현호색 추출 건조 페이스트로 제조하기 위해 농축하는 단계.

종래의 첨가제(conventional excipients)를 추가하기 위한 종래 방법에 따르면, 현호색 건조 추출물은 임상학적으로 허용가능한 복용량(clinically acceptable dosage)으로 알약(pills), 캡슐(capsules), 과립제(granules), 정제(tablets), 경구액(oral liquid) 또는 주사(injection)를 포함하여 제조되나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 D101 거대 다공성 수지(macroporous resin)에 있어서, 상기 D101 거대 다공성 수지의 직경 및 높이의 비율은 1 : 4 내지 8이고; 유동엑스(fluidextract)의 샘플용액(sample solution)은 pH 1 내지 2이며, 침전물(precipitate)은 녹고, 흩어졌다. 바람직하게는, D101 거대 다공성 수지에 있어서, 상기 D101 거대 다공성 수지의 직경 및 높이의 비율은 1 : 7이고, 유동엑스의 샘플용액은 pH 1.5이다. 본 발명에서, 무게 및 부피의 관계는 g/ml 관계이다.

중국 전통의약(traditional Chinese medicine)에 있어서, 현호색은 일반적으로 사용되고, 이는 따뜻하고(warm), 쓴 아린맛(bitter acrid taste)으로, 심장, 간, 비장, 폐에서의 혈액순환(blood circulation)을 활성화시키며, 키(qi)를 조절하고, 진통효과(analgesic effect)가 있어, 모든 종류의 통증을 치료하고, 가슴이 답답한 통증(pectoral stuffiness pain) 및 급성 상복부통(acute epigastralgia)의 치료에 사용된다. 처방전(prescription)으로부터 선별된 단일 허브로서 현호색은 본 발명의 초기 단계에 있어서, 긍정적 효과를 달성했다. 본 발명의 현호색 추출물의 극성의 차이(polar differences)에 따라, 물추출물(water extract), 알콜 extract(alcohol extract), 유기상(organic phase) 및 알칼리 추출물 부분의 수상부분(aqueous phase portion), 거대 다공성 수지 풍부한 부분(enrichment parts), 원래의 가루 분말(original medicinal powder), 의학적 선별 시험을 위해 사용된 테트라하이드로팔마틴(tetrahydropalmatine's)의 원료물질(raw material)로부터 선별된 7개 다른 의학적 부분(medical part)으로 제조된다.

본 발명은 현호색 추출물을 유효성분으로 함유하는 빈맥성 부정맥 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

도 1은 팔마틴의 최대 정적흡착(Palmatin's maximun static adsorption) 및 탈착 우량효과(desorption amount effect)를 위한 거대 다공성 수지(macroporous resin)를 비교한 도이다.
도 2는 팔마틴의 정적 탈착률 효과를 위한 거대 다공성 수지를 비교한 도이다.
도 3은 테트라하이드로팔마틴의 최대 정적흡착(tetrahydropalmatine's maximun static adsorption) 및 탈착 우량효과를 위한 거대 다공성 수지를 비교한 도이다.
도 4는 테트라하이드로팔마틴의 정적 탈착률 효과를 위한 거대 다공성 수지를 비교한 도이다.
도 5는 각각 다른 농도의 샘플 첨가액에 있어서, 수지 컬럼(resin column)을 통과한 두 구성요소(components)의 순도를 비교한 도이다.
도 6은 각각 다른 농도의 샘플 첨가액에 있어서, 수지 컬럼을 통과한 구성요소의 이동율(transfer rate)을 비교한 도이다.
도 7은 HPD300 수지 누설곡선(leaking curve)을 나타내는 도이다.
도 8은 D101 수지 누설곡선을 나타내는 도이다.
도 9는 용출용적(elution volume)과 비교하여 HPD300 수지의 에탄올 용출농도(elution concentration)를 관찰한 도이다.
도 10은 이동율과 비교하여 HPD300 수지의 에탄올 용출농도를 관찰한 도이다.
도 11은 용출용적과 비교하여 D101 수지의 에탄올 용출농도를 관찰한 도이다.
도 12는 HPD300 수지의 에탄올 용출용적을 관찰한 도이다(n=2).
도 13은 D101 수지의 에탄올 용출용적을 관찰한 도이다(n=2).
도 14는 HPD300 수지의 알칼리성 에탄올 용출용적을 관찰한 도이다(n=2).
도 15는 HPD300 수지를 알칼리성을 사용하여 활성화시킨 후, 각 성분요소의 누적된(cumulative) 용출율(elution rate)을 나타내는 도이다.
도 16은 D101 수지의 직경에 대한 높이 비율 및 용출율을 관찰한 도이다.
도 17은 D101 수지의 직경에 대한 높이 및 순도를 관찰한 도이다.
도 18은 선별된(screened) 부분 약제의 제조를 위한 개략도이다.
도 19는 플로차트(flowchart) 단계를 나타내는 도이다.

실시예 1: 약제의 선별된 부위 제조

1. 기기 및 재료

1.1 기기

LC-20AT 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatograph)[SPD-20AVWD 탐지기(detector), 4원수 저압 구배 펌프(quaternionic low pressure gradient pump), 컬럼 배양기(column incubator), 자동견본기(autosampler); 일본 시마즈사, LCSolution 크로마토그래피 작업실(chromatography workstation]; 딕마 디아몬실(Dikma Diamonsil) C18 컬럼(4.6 ㎜ x 250 ㎜, 5 ㎛; 컬럼 번호: 8132893); METTLER AE 240 형 전자분석저울(electronic analytical balance)(북경 사토리우스 과학기기 유한공사); YP10002 형 전자저울

1.2 재료

101 거대 다공성 수지(macroporous resin)(창저우 바오캉 흡착제 기술공사, 의약 등급); 테트라하이드로팔마틴(정주 리누오 생물기술 유한공사, Zhengzhou Linuo Biological Technology Co., Ltd.)

1.2.1 시약

에탄올(북경 화학 플랜트, 분석 등급), 클로로포름(chloroform)(북경 화학 플랜트, 분석 등급), 염산(hydorchloric acid)(북경 화학 플랜트, 분석 등급), 암모니아(ammonia)(산토우 시롱 화학 유한회사, 분석 등급)

1.2.2 대조군

테트라하이드로팔마틴 대조군[배치 번호(batch number): 110726-200409]은 용도를 결정(deter분ation)하기 위하여 중국 의약품 생물학적 제제 연구소(China pharmaceutical biological analysis institute)에서 구입하였다.

2. 방법 및 결과

2.1 알콜 추출물의 제조(샘플 번호 5)

미가공의(crude) 현호색(Rhizoma Corydalis) 가루 100 g은 80% 에탄올 800 ㎖로 2번 추출되었고, 상기 추출물을 여과하였으며, 유동엑스(fluidextract) 120 ㎖를 얻기 위해 감압농축하였고, 고체의 알콜 추출물을 얻기 위해 건조되었다.

2.2 D101 수지(resin)에 의해 농축된 생산물(샘플 번호 1)

D101 수지 10 ㎖을 다루어 내부직경(inner diameter)이 1.0 ㎝인 유리 컬럼에 로딩하고(loaded), 알콜향이 사라질 때까지 물로 세척하였으며, 6.0 ㎖ 유동엑스를 취하여 3.5 ㎖/h의 유속으로 상기 실시예 2.1의 수지 컬럼으로 제조하였고, 탈염수로 불순물을 제거하였으며, 3 ㎖/분의 유속으로 80% 에탄올로 용출하였고, 거대 다공성 수지 농축된 생산물로써 건조 페이스트(dry paste)로 농축되었다.

2.3 지용성(fat-soluble) 및 수용성(soluble) 알칼로이드(alkaloid) 추출물의 제조(샘플 번호 2 및 3)

미가공의 현호색 가루 200 g은 80% 에탄올 1600 ㎖로 2번 추출되었고, 1.5 시간 동안 환류시켰으며, 여과물을 수득하기 위해 여과하였고, 약 200 ㎖의 두꺼운 페이스트에 감압 농축하였으며, 1.0 mol/L의 염산으로 pH 1로 적정하였고, 5℃에서 24시간동안 방치하였으며, 침전물(precipitate)은 여과 및 세척되었고, 상기 여과물에 400 ㎖까지 물을 첨가하였으며, 암모니아수(ammonia water)로 pH = 10으로 적정하였고, 전체 액체가 최종적으로 500 ㎖가 되도록 맞추었으며, 염화메틸렌(emthylene chloride, 300 ㎖ x 2)으로 추출하고, 유기상(organic phases)과 혼합하였으며, 지용성 알칼로이드(샘플 번호 3)를 위해 감압 농축한 용액(solvent)을 회복하였다(recovered); 추출 후 액체상(aqueous phase)은 농축되고, 수용성(water-soluble) 알칼로이드(샘플 번호 2)를 위해 건조하였다.

2.4 물 추출물의 제조(샘플 번호 4)

미가공의 현호색 가루 100 g은 물 800 ㎖와 함께 1.5시간 동안 2번 끓였다. 거즈로 여과 후, 상기 여과물은 400 ㎖로 농축되었으며, 물 추출물 부분으로 건조 추출물을 수득하기 위하여 건조되었다. 현호색 허브(herbs) 스크리닝 부분(portion)의 wpwhsms 도 18에 나타내었다.

효험 스크리닝 테스트(Efficacy screening test) 약물군

코드	이름	테트라하이드로팔마틴의 함량
No.1	D101 컬럼 용출	4.25%
No.2	수상(수성 알칼로이드 부분)	0
No.3	유기상(지용성 알칼로이드 부분)	11.18%
No.4	건조 물 추출물	0.204%
No.5	건조 에탄올 추출물	7.30%
No.6	테트라하이드로팔마틴 API	92.3%
No.7	현호색 가루	0.12%

실시예 2: 약효 선별 시험( 실시예 1과 같은 샘플들)

1. 실험 재료

1.1 실험 동물

90 CD 마우스, 수컷, 체중 28 - 30 g[북경유통이화실험동물기술유한회사, 허가증번호 SCXk（Beijing）2006-0009].

1.2 약품

1.3 시약

FeCl₃.6H₂0(북경화공회사, A.R.), 3페닐4졸륨염화물(triphenyltetrazolium chloride)(북경화공회사, A.R. 배치 번호: 950221).

1.4 기기

TT 입체현미경북경광전과학기기회사), SHZ-22 항온수욕발진기(강소대창의료기계회사), 전자분석저울(AEG-220, 시마즈사, 일본).

2 실험 방법

2.1 실험군

동물은 무작위로 9 군으로 나눴고, 각 군마다 10 마리의 쥐로 구성하였다: 모델군(10 mL/kg 생리식염수), 78 mg/kg 아미오다론(amiodarone) 약물 대조군, 18.2 mg/kg NO.1 약물군, 157.6 mg/kg NO.2 약물군, 9.1 mg/kg NO.3 약물군, 462 mg/kg NO.4 약물군, 139 mg/kg NO.5 약물군, 1.16 mg/kg NO.6 약물군, 1.3 g/kg NO.7 약물군. 약물 투여 전 각 약물은 생리 식염수로 필요 농도를 조절하였고 약물 투여 경로는 십이지장이며, 10 mL/kg의 농도로 투여하였다.

2.2 수술방법

동물은 펜토바비탈나트륨(soeium pentobarbital)으로 복강마취 하였고, 복강막을 개복한 후, 십이지장으로 생리식염수 또는 약물을 투여하고 봉합하였다; 약물 투여 45분 후에 심전도 검사 기록 표준 Ⅱ 기록기(PowerLab)를 연결하고, 꼬리 정맥에 CaCl₂(180 m/kg, 10 mg/mL, 10초간 등속 투여)를 투여한 후, 부정맥의 심전도가 유발되는지 관찰하고, 부정맥 지속기간을 기록하였으며, 그 결과를 통계 분석하였다.

2.3 평점 표준 및 실험 결과

부정맥 유발 여부를 확인하기 위하여 심전도를 관찰하고, 심실 부정맥 지속시간을 기록하고, 결과를 통계 분석하였다. 통계 결과는 표 2를 참조한다.

2.5 결론

모델군은 음성 대조군이고, 아미오다론 약물군은 양성 대조군이며 짧은 부정맥 지속시간을 보이는 군이 우수한 것이다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 4, 5, 및 7번 샘플의 약물 효과가 나쁘거나 약물 효과가 없고, 3, 및 6번 샘플의 약물 효과는 중간이며, 1, 및 2번 샘플의 약물 효과는 양성 대조군과 비슷하다는 것을 확인하였다. 약력학 결과를 통해 지용성 알칼로이드 및 수용성 알칼로이드 성분의 현호색 모두 빈맥성(tachyarrhythmia)에 영향을 미치며, 7개의 군 중 거대 다공성 수지 컬럼 용출 구성물에 지용성 알칼로이드뿐만 아니라 수용성 알칼로이드도 포함되어 있으며 현저한 약효가 있음을 확인하였다.

실시예 3: 거대 다공성 수지에 의한 현호색 분리 및 정제

1. 기기 및 재료

1.1 기기

LC-20AT 고효율 액상 크로마토그래프(HPLC)（SPD-20AVWD 테스트기, 쿼터너리 저압 그레디언트 펌프, 조절기，자동 샘플 진입기; 일본 시마즈사，LCSolution 크로마토그래피 작업실）； METTLER AE 240 형 전자분석저울（상해 메이터러-퉈리둬 기기 유한회사）； Sartorius BS110S형 전자분석저울（북경 사토리우스 과학기기 유한회사）.

1.2 재료

1.2.1 시약

메틸알콜(methanol)(Fisher사, HPLC 등급);아세트니트릴(acetonitrile)(마이루이다사, HPLC 등급);인산(천진시 광복정 세화공연구소, HPLC 등급);초산(Fisher사, HPLC 등급);트리에틸아민(triethyla분e)(천진시 광복정 세화공 연구소, 애널리티칼);정제수(항주 와하하 유한회사);수산화나트륨(sodium hydroxide)(천진시 광복정 세화공 연구소, AR);염산(북경화공회사, AR)

1.2.2 대조군

탈수소의 현호색(dehycrocorydaline)(배치 번호：042-30751 화광 준약 공업주식회사);

테트라하이드로팔마틴(tetrahydropalmatine)(배치 번호：110726-201011，중국 약품 생물제품 검정소, 함량 측정용)

염산, 마틴(배치 번호：732-9002, 중국 약품 생물제품 검정소, 함량 측정용)

2. 2가지 유형의 거대 다공성 수지의 선별

정적 흡착법을 이용해, 최대 흡착량과 탈착률 측정을 통해 가장 적합한 거대 다공성 흡착 수지를 선별하였다. 8종의 거대 다공성 흡착 수지를 선택하였고, 구체적인 데이터는 표 3과 같다.

각각의 상기 처리된 수지 5 mL를 스토퍼가 구비된 원추형 플라스크(flask)에 넣고 표면 수분을 제거한 후, 0.3 g 생약/mL로 농축된 현호색 추출물 200 mL를 첨가하여 흔들어 24시간 방치하였다. 그 후, 추출 여과하고 30 mL 증류수로 수지를 세척하고, 여과액을 섞은 후 수세액을 250 mL 용량 플라스크에 넣고 흔들고 HPLC로 테트라하이드로팔마틴 함량을 측정하고 최대 흡착량을 계산한다. 2개의 샘플은 평행적으로 진행되었다.

상기 거대 다공성 수지를 세척 후 95% 에탄올 200 mL를 첨가하여 24시간 동안 침포한 후 여과하고 95% 에탄올 30 mL로 수지를 세척하였으며, 에탄올 용액을 섞어 250 mL 용량 플라스크에 담아 흔든 후 HPLC로 함량을 측정하고 탈착률을 계산하였다.

실험 결과를 통해 HPD300의 4기 아민형 알칼로이드에 대한 흡착이 다른 유형의 수지보다 현저히 높고, 또한, 흡착력도 높지만, 탈착률은 8종의 수지 중 하위를 차지하고 있음을 확인하였다.

D101 수지의 4기 아민형 알칼로이드의 흡착량 및 탈착량은 최대는 아니지만 탈착률은 높은 것을 확인하였다.

실험 결과를 통해 HPD300의 테트라하이드로팔마틴에 대한 흡착량은 높은 반면, 탈착률은 높지 않음을 확인하였다; D101 수지의 테트라하이드로팔마틴에 대한 흡착량 및 탈착량 모두 높음을 확인하였다.

흡착량, 탈착량 및 탈착률을 고려했을 때, HPD300 수지 및 D101 수지는 각각의 장점이 있으므로, 하기와 같이 2가지 수지에 대한 비교 실험을 진행하였다.

3. 컬럼 용액의 농도 조사

일정량의 추출액을 0.15 g 생약/mL, 0.3 g 생약/mL，및 0.5 g 생약/mL의 3가지 농도, 및 100 mL，50 mL，30 mL의 부피로 농축하고, 10 mL 거대 다공성 수지 컬럼에 통과시키고, 3배의 컬럼 부피로 수세한 후 3배 컬럼 부피의 95%의 에탄올로 용리하였다. 용리액은 성분 함량을 측정하고, 이동률 및 순도를 계산한다. 결과는 표 6과 같다:

이동율, 순도 및 원심 침전량을 고려하여 0.3 g/mL 농도를 컬럼 용액의 최종 농도로 선택하였다.

4. 샘플 용액의 pH 조사

현호색 알코올 추출액을 0.3 g 생약/mL로 농축시키고 염산으로 pH를 각각 6（pH 조절 안함）, 5, 4, 3, 및 1.5로 조절한 후 20분 동안 초음파 처리하여, 1시간 동안 방치한 후 침전 용해 상태를 관찰하였다. pH 1.5에서 침전이 용해되고 덩어리가 지지 않음을 확인함으로써, 컬럼 용액의 pH를 1.5로 선택하였다.

5. 거대 다공성 수지의 선처리 및 패킹(packing)

선별 수지를 95% 에탄올 환류액으로 선처리하고, 혼탁해지지 않을 때까지 시험관에 물을 넣어 희석하여 환류 처리한 후, 자외선 분광광도계 법으로 에탄올 환류액 흡수치가 0.1보다 작음을 확인하였다. 그 후, 처리된 수지를 액상 크로마토그래피 컬럼에 넣고, 알코올 밀도계를 이용해 상기 컬럼 유출액의 에탄올 함량이 0이 될 때까지 증류수로 세척하여 준비한다. 상기 작업은 두 번 반복한다.

6. 컬럼 용액 제조

약초 현호색 줄기 분말의 무게를 측정하고, 각 회당 1시간씩 8배 양의 80% 에탄올로 2회 환류 추출하였으며, 추출액을 여과한 후 여과액을 0.3 g 생약/mL로 감압농축시킨다. HPLC를 이용해 컬럼 용액의 테트라하이드로팔마틴과 팔마틴의 함량을 측정하고 준비해둔다.

7. 샘플 용액의 최대 샘플 부피 조사

7.1 HPD300 수지의 최대 샘플 부피 조사

처리된 HPD300 거대 다공성 수지 20 mL를 2개의 크로마토그래피 칼럼에 넣고 pH 1.5 샘플 용액을 0.4 mL/분의 유속으로 첨가한 후, 매번 컬럼 부피와 동일한 부피로 한 번씩 수집하고, 탈수소의 현호색(dehydrocorydaline), 팔마틴, 테트라하이드로팔마틴의 함량을 측정하고 누설 곡선을 제작하였다. 결과는 표 7과 같다:

누설곡선을 통해 탈수소의 현호색은 컬럼의 7 배 부피에서부터 누설되기 시작하는 것을 확인하였다. 따라서, 샘플 첨가 시 누설을 방지하기 위한 최대 샘플 첨가량을 컬럼의 6배 부피인 1.8 g 생약/mL 수지로 결정하였다.

7.2 샘플의 최대량 조사

10 mL의 처리된 D101 거대 다공성 수지를 2개의 크로마토그래피 컬럼（12 mmI.D.）에 넣고, 샘플 용액을 0.4 mL/분의 유속으로 첨가한 후 매번 컬럼 부피와 동일한 부피로 한 번씩 수집하고, 탈수소의 현호색, 팔마틴, 테트라하이드로팔마틴의 함량을 측정하고 누설 곡선을 제작하였다. 결과는 표 8 및 도 8과 같다.

누설곡선을 통해 팔마틴은 컬럼의 9배 부피에서부터 누설되기 시작하고, 탈수소의 현호색은 컬럼의 8배 부피에서부터 누설되기 시작하는 반면, 테트라하이드로팔마틴은 누설되지 않음을 확인하였다. 샘플 첨가시 각 성분이 누설하는 것을 방지하기 위해 최대 샘플 부피는 컬럼의 7배 부피인 2.1 g 생약/mL 수지로 결정하였다.

8. 샘플 첨가 유속 조사

8.1 HPD300 수지의 샘플 첨가 유속 조사

10 mL의 처리된 HPD300 거대 다공성 수지를 동일 유형의 크로마토그래피 컬럼에 넣고, 60 mL의 샘플 용액을 각각 0.4 mL/분，0.6 mL/분，및 0.8 mL/분의 유속으로 정확하게 다이나믹하게 흡착한 후 샘플의 유출 결과를 측정한다. 컬럼의 6배 부피에서 0.4 mL/분 및 0.6 mL/분의 유속으로 샘플을 첨가한 경우, 누설현상이 없었으며 컬럼의 5배 부피에서 0.8 mL/분의 유속으로 샘플 첨가한 경우 누설되기 시작함을 확인함으로써, 샘플 첨가 유속을 0.6 mL/분으로 결정하였다

8.2 D101 수지의 샘플 첨가 유속 조사

10 mL의 처리된 D101 거대 다공성 수지를 2 개의 크로마토그래피 컬럼(12 mmI.D.)에 넣고, 70 mL의 샘플 용액을 각각 0.4 mL/분，0.6 mL/분，및 0.8 mL/분의 유속으로 정확히 다이나믹하게 흡착한 후 컬럼 부피와 동일한 부피마다 한 번씩 수집하고, 샘플의 탈수소의 현호색, 팔마틴, 현호색 테트라하이드로팔마틴의 함량을 측정하였다. 0.4 mL/분의 유속에서 샘플이 누설되지 않음을 확인함으로써, 샘플 첨가 유속을 0.4 mL/분으로 결정하였다.

9. 에탄올 용출의 농도의 조사

9.1 HPD300 수지에 의한 에탄올 용출 농도 조사

HPD300 거대 다공성 수지(macroporous resin)의 10 ml을 두개의 크로마토그래피(chromatography) 컬럼[columns(12mmI.D.)]에 투입하고, 샘플 용액(sample solution)의 60 mL을 정확하게 그리고, 0.6 mL/분의 유속과 함께 다이나믹하게 적제되게(loaded dynamicly), 세개 컬럼 부피(volume)(0.6 mL/분)를 세척하고, 용출의 20%, 40%, 60%, 80%, 및 95% 에탄올을 함께 세 개 컬럼 부피를 연속적으로 세척하고, 유속은 0.6 mL/분, 테트라하이드로팔마틴(tetrahydropalmatine) 및 팔마틴의 내용 및 페이스트 부피를 각각의 알코올 용출에서 용리율 및 순도(purity)를 계산하기 위해 측정하였다.

또한, HPD300 거대다공성 수지의 10 ml을 두개 크로마토그래피 컬럼(12mmI.D.)에 투입하고, 샘플 용액의 60 mL을 정확하게 그리고, 다이나믹하게 적제(dynamicly loaded)되게 0.6 mL/분의 유속(flow rate), 세개 컬럼 부피(0.6 mL/분)를 세척, 용출의 3 개 컬럼 부피를 95 % 에탄올로 세척, 유도는 0.6 mL/분, 테트라하이드로팔마틴(tetrahydropalmatine) 및 팔마틴(Bamatin)의 내용 및 페이스트 부피를 각각의 알코올 용출에서 용리율(elution rate) 및 순도(purity)를 계산하기 위해 측정하였다.

도에서 나타낸 바와 같이, 수용성(water-soluble) 알카로이드(alkaloid) 및 지용성(fat-soluble)은 에탄올 그래디언트(gradient) 용출 후 알코올의 각기 다른 농도에서 용출되고, 수용성 알카로이드는 40% 알코올과 함께 용출, 지용성 알카로이드는 95% 알코올과 함께 용출, 및 두 가지 모두 95% 에탄올과 함께 바로 용출 될수 있으므로, 알코올 용출로 95% 에탄올을 선택하였다.

9.2 D101 수지로 인한 에탄올 용출의 농도의 조사

D101 거대다공성 수지의 10 ml을 크로마토그래피 컬럼의 동일 모델에 투입하고, 샘플 용액 70 mL을 정확하게 그리고, 0.4 mL/분의 유속과 함께 역학적(dynamicly)으로 흡수한 후, 네개 컬럼 부피를 세척하고, 유속은 0.4 mL/분 그런다음, 20%, 40%, 60%, 80%, 및 95% 에탄올로 연속적으로 용출의 세개 컬럼 부피를 세척하고, 유속은 0.4 mL/분, 세 개 구성의 내용물을 각 알코올 용출에서 측정하였다. 결과는 도 11과 같다:

도에서 나타낸 바와 같이, 수용성 알카로이드는 알코올의 농도가 낮을 때 용출될 수 있고, 및 삼차 아민 형태 불용성(water insoluble) 알카로이드, 테트라하이드로팔마틴(tetrahydropalmatine) 용출율은 80% 에탄올에서 최대로 도달하였으므로, 전체적으로 간주할 때, 80% 에탄올을 용리액으로 선택하기로 결정하였다.

10. 에탄올 용출 부피의 조사

10.1 HPD300 수지 에탄올 용출 부피의 조사

거대다공성 수지의 10 ml을 크로마토그래피 컬럼의 동일 모델에 투입하고, 샘플 용액 60 mL을 정확하게 그리고, 0.6 mL/분의 유속과 함께 다이나믹하게(dynamicly) 흡수한 후, 세 개 컬럼 부피를 세척하고, 및 그런 다음, 95% 에탄올 15 BV로 용출하고, 탈수소의 현호색(dehydrocorydaline), 팔마틴 및 테트라하이드로팔마틴의 누적된 용출률을 계산한다.

HPD300형 수지 에탄올 용리 부피 고찰（n=2）

용리배수	탈수소의 현호색%	팔마틴%	테트라하이드로팔마틴%
1BV	39.05	55.53	16.59
2BV	64.67	87.72	52.08
3BV	72.16	92.72	70.51
4BV	73.15	94.07	80.75
5BV	73.67	94.78	87.4
6BV	73.97	95.19	91.01
7BV	74.26	95.55	93.65
8BV	74.61	95.96	95.42
9BV	74.81	96.22	96.58
10BV	74.95	96.42	97.46
11BV	75.01	96.6	98.04
12BV	75.06	96.64	98.45
13BV	75.09	96.7	98.75
14BV	75.12	96.72	98.99
15BV	75.16	96.72	99.27

실험 결과 도 12와 같이 6 BV 팔마틴의 용출율은 95% 에탄올 용출을 사용하여 95%이상 도달할 수 있고, 8 BV 테트라하이드로팔마틴(tetrahydropamatin)은 95% 이상 도달했으며, 탈수소의 현호색 용출율은 전부 78%이였다.

거대 다공성 수지의 10 ml을 크로마토그래피 컬럼의 동일 모델에 투입하고, 샘플 용액 70 mL을 정확하게 그리고, 0.6 mL/분의 유속과 함께 다이나믹하게 흡수하고, 네개 컬럼 부피를 세척, 및 그런 다음, 80% 에탄올 10 BV와 함께 용출, 10 ml 용리액을 각각 한번 수집하여, 각 알코올 용출 부피의 내용 및 구성 요소의 세 종류의 페이스트 부피를 측정하였다. 결과는 표 10 및 도 13과 같다.

D101 수지에서 에탄올 용출 부피의 조사(n=2)

용출의 배수	용출율 누적(%)
	팔마틴	탈수소의 현호색	테트라하이드로팔마틴
1	67.38	59.38	35.84
2	96.99	92.445	67.27
3	98.37	94.145	78.175
4	98.785	94.66	85.695
5	98.975	94.885	91.55
6	99.11	95.02	95.42
7	99.195	95.105	98.18
8	99.26	95.155	100.115
9	99.26	95.18	101.325
10	99.27	95.205	102.05

실험 결과 도 13과 같이, 용출 부피가 8배 컬럼 부피일 때 95%에 도달하고, 따라서, 용출 부피를 8배 컬럼 부피로 선택하기로 결정하였다.

11. HPD 300 수지의 기술 향상

HPD 300 수지의 사용하는 경우, 탈수소의 현호색 용출율(elution rate)은 낮고, 따라서, 로딩(loading) 및 용출 조건(condition)을 개선하여, 탈수소의 현호색의 용출율을 최적화했다.

11.1 알칼리 에탄올을 사용하여 용출

거대다공성 수지의 10 ml을 크로마토그래피 컬럼의 동일 모델에 투입하고, 샘플 용액 60 mL을 정확하게 그리고, 0.6 mL/분의 유속과 함께 역학적(dynamicly)으로 흡수한 후, 세 개 컬럼 부피를 세척하고, 및 그런 다음, 95% 에탄올 120 mL, 수산화나트륨(NaOH)을 pH 값 8.5로 조정하여 첨가하고, 용출 유속은 0.6 mL/분, 용출 부피 12 BV, 용리액 수집, 세 가지 구성 요소의 누적 용출율을 결정하였다.

HPD 300 수지에서 알칼린 에탄올 용출 부피의 조사(n=2)

용출의 배수	탈수소의 현호색	팔마틴	테트라하이드로팔마틴
1BV	46.01	52.66	6.81
2BV	68.44	70.27	42.34
3BV	72.83	74.27	68.25
4BV	75.26	76.74	81.25
5BV	76.92	78.64	90.21
6BV	78.12	80.18	95.31
7BV	78.98	81.49	98.48
8BV	79.63	82.62	100.58
9BV	80.12	83.54	102.01
10BV	80.52	84.31	103
11BV	80.84	84.97	103.74
12BV	81.11	85.54	104.28

실험 결과 표 11 및 도 14와 같이, 팔마틴의 용출율은 감소하였지만, 에탄올이 알칼리화되어 현호색 용출율이 증가하였고, 효과는 명확하지 않았으며, 용출율은 유일하게 약 80 %로 나타났다.

11.2 수산화 나트륨 용액에 의한 거대 다공성 수지 컬럼 활성화

거대다공성 수지의 10 ml을 크로마토그래피 컬럼의 동일 모델에 투입하고, 샘플 용액 60 mL을 정확하게 그리고, 0.6 mL/분의 유속과 함께 역학적(dynamicly)으로 흡수한 후, 세 개 컬럼 부피를 세척하였다.

그런 다음, 0.1 mol/L 수한화나트륨 용액 120 mL, 용출 부피 3 BV, 용출 유속은 0.6 mL/분, 1 시간 방치 후, 용리액을 받고, 세 가지 구성물들 95% 에탄올 용출액 부피 10 BV의 누적(cumulative) 용출율의 결정, 세 가지 구성물들의 누적 용출율을 계산하였다.

알칼리 용액에 의한 HPD300에서 알칼린 에탄올 용출 부피 활성화의 조사(n=2)

	평균 용출율 %
	탈수소의 현호색	팔마틴	테트라하이드로팔마틴
알카리용액 1로 세척	0.03	0	0
알카리용액 2으로 세척	0.1	0	0
알카리용액 3으로 세척	0.18	0	0
1	13.25	7.385	9.305
2	30.025	24.46	44.725
3	41.74	38.325	66.78
4	48.035	46.69	80.025
5	52.315	53.11	87.445
6	55.11	57.76	99.31
7	57.085	61.55	101.9
8	58.385	64.3	103.485
9	59.425	66.665	104.575
10	60.08	68.475	105.33

실험 결과 표 10 및 도 15와 같이, 사차 아민 기본 구성 요소의 용출율은 알칼린 활성화로 인해 저감되었고, 탈수소의 현호색의 누적 용출액 60%, 팔마틴의 누적 용출액은 약 68 %, 테트라하이드로팔마틴은 10 BV에서 용출 될 수 있다.

탈수소의 현호색 용출율이 높지 않은 이유는, 수지의 종류 선택이 부적절하게 사료되었기 때문이다. 전체적으로 간주해 볼 때, 이것은 용리액과 같은 80% 에탄올로 선택하여 결정하는 것이 좋다.

12. 세척 유속 및 D101 수지의 부피

D101 거대다공성 수지의 10 ml을 두 개 크로마토그래피 컬럼에 투입하고, 샘플 용액의 70 mL을 정확하게 그리고, 0.6 mL/분의 유속과 함께 다이나믹하게 적제 되게하고, 그런 다음, 몰리쉬 반응(Molish reaction)이 네거티브(negetive)로 될 때까지 증류수(distilled water)로 세척한다. 몰리쉬 반응: 1 mL 세척액을 취하여, 몰리쉬 반응물질(Molish reagent)의 두 방울을 첨가하고, 쉐이크(shake) 한다. 황산 농도의 1 mL을 첨가할 때 시험관을 기울여 관벽에 따라 흔들리지 않게 조심스럽게 첨가하고, 조심스럽게 세운 후, 조심스럽게 두 레이어(layer)의 교차점 표면의 색 변화를 관찰하였다.

그 결과, 물의 컬럼 부피로 4번 세척하고, 세척액이 무색에 가까워졌으며, 몰리쉬 반응물질은 네거티브로 나타내었고, 유체 알칼로이드 시약에 있는 알칼로이드의 물 결정의 누설이 없으므로, 물 부피는 4 BV로 결정하였다.

13. 에탄올 용출 속도의 조사

거대 다공성 수지의 10 ml을 크로마토그래피 컬럼의 동일 모델에 투입하고, 샘플 용액의 70 mL을 정확하게 그리고, 0.4 mL/분의 유속과 함께 다이나믹하게 흡수한 후, 네 개 컬럼 부피를 세척하고, 유속은 0.4 mL/분, 및 그런 다음, 80% 에탄올 10 배 컬럼 부피와 함께 연속적으로 용출, 유속은 0.6 mL/분 및 0.8 mL/분, 세 가지 구성 요소의 내용은 각 알코올 용출로 측정하였다. 용출율 및 추출율을 계산하였다. 결과는 하기의 표와 같다.

D101 수지의 에탄올 용출 속도의 조사(n=2)

에탄올 용출 속도 （mL/분）	용출율			추출율	순도
에탄올 용출 속도 （mL/분）	탈수소의 현호색	팔마틴	테트로하이드로팔마틴	추출율	탈수소의 현호색	팔마틴	테트라하이드로팔마틴
0.6	92.27	86.94	101.16	1.41%	14.81	2.77	4.17
0.8	92.13	86.50	97.90	1.36%	15.39	2.87	3.69

세 가지 구성 요소의 용출 속도의 비교, 0.6 mL/분의 유속 그룹(group)은 높으며, 및 추출율은 약간 컸으며, 용출 완전의 원칙에 따라 유속을 0.6 mL/분으로 선택하였다.

14. 직경 높이 비율의 조사

거대 다공성 수지 6.8 ml, 10 ml, 및 12.2 ml을 각각 크로마토그래피 컬럼의 동일 모델에 투입하고, 직경 높이 비율을 각각 1:5, 1:7, 1:9, 각각 샘플 용액 47.6 ml, 70 ml, 및 85.4 ml을 정확하게 그리고, 0.4 mL/분의 유속과 함께 다이나믹하게 흡수한 후, 세 개 컬럼 부피를 세척하고(0.4 mL/분), 80% 에탄올 10 배 컬럼 부피와 함께 연속적으로 용출(0.6 mL/분), 탈수소의 현호색, 팔마틴 및 테트라하이드로팔마틴의 내용 및 추출율을 각 알코올 용출에서 측정하였고, 용출율 및 순도를 계산하였다.

D101 수지의 직경 높이 비율의 조사 (n=2)

직경 높이비율	용출율			순도
직경 높이비율	탈수소의 현호색	팔마틴	테트로하이드로팔마틴	탈수소의 현호색	팔마틴	테트라하이드로팔마틴
1:5	85.71	96.32	81.09	11.2	2.32	3.24
1:7	91.18	101.55	90.24	11.49	2.36	3.48
1:9	95.69	99.64	86.21	11.47	2.2	3.15

상기 결과는, 직경 높이 비율이 결과에 대한 영향이 비교적 적으며, 실제 생산의 수요를 고려하여 1:7의 직경 높이 비율을 선택함을 나타낸다.

15. 실험실 시험

상기 거대 다공성 흡착 수지의 준비를 위한 정제 공정의 농축에 따라, 샘플의 세 가지 배치를 준비하였고, 총 알칼로이드의 양을 측정하였다.

거대 다공성 수지 행렬의 검증

	무게/mg	농도	흡광도	함유량%
대조군	5.7	0.228	1.0446
샘플 1	6.3	0.126	0.4026	69.74
샘플 2	5.6	0.112	0.3464	67.51
샘플 3	5.64	0.1128	0.3456	66.87
평균				68.04

실험 결과 도 16 및 도 17과 같이, 순화 공정은 안정적이고 실행 가능한 것을 확인하였다.

거대 다공성 수지 기술 요약: D101 거대 다공정 수지는, 샘플 농도는 0.3 g/mL,샘플 용액이 pH1.5로 조절하고 침전 용해 분산, 1:7의 높이 비율 직경, 2.1g 미가공의 생약/mL 수지의 샘플 부피, 4 BV의 세척 불순물 제거 부피, 0.4 mL/분의 유속, 80%의 용출 에탄올 농도, 0.4 mL/분의 용출 유속, 8 BV 용출 부피이다.

실시예 4

1.재료와 방법

1.1 실험재료

1.1.1 실험동물

중량 200 내지 220 g의 건강한 랫드를 북경 화부강 과기주식 유한회사(Beijing HFK Bioscience Co., Ltd.)로부터 구입하였다.

고유 번호：SCXK 북경 2009-0007.

1.1.2 기기와 설비

Phantom V7 스캐너는 시노 크리스탈 기술(Sino Krystal Techonology)에서 제공받았다. DT－2000형 전자저울은 미국 투 브라더스사에서 생산하였다. MPIDS-500 멀티미디어 컬러 병리 영상 분석 시스템은 북경 공해회사 생산하였다.

1.1.3 약품과 시약

현호색 추출물：노란 갈색 분말, 실시예3의 방법에 의해 획득, 배치 번호1：201107， 1 그램당 추출물 생약 62.762 g 상당；배치 번호2：201107， 1 그램당 추출물 생약 65.50218 g 상당.

메토프롤롤(Metoprolol)：Astrazeneca제약 유한회사，규격：25mg/정제，배치 번호：1105031；

삼송양심캡슐(Shengsong Yangxin capsule)：하북 이령 약업 유한회사，규격：0.4 g/정제，배치 번호1104007；

니트로테트라졸륨블루염화물(N-BT)，배치 번호: 2541C012，암네스코사(Amresco);

클로랄 수화물(Chloral hydrate)，배치 번호: 20110210，국약그룹 화학시약 유한회사(Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd).

1.2 실험방법

1.2.1 동물 모델 확립

랫드에게 3.5%의 10 mg/kg 클로랄 수화물을 복강 내 주사 마취하여 반듯이 눕힌 후 판넬에 고정시킨다. 랫드의 왼쪽 4, 5번째 늑간을 절개하여 흉강을 열고 심막을 열어서 흉곽을 약간 눌러 심장을 드러나게 한 후 0호 수술실밥으로 왼쪽 귓바퀴(left auricle) 밑 2 mm되는 부위에서 관상동맥 좌측 전하행지(Left anterior descending artery)를 결찰한 후 즉시 심장을 흉강에 넣고 절개구와 피부를 봉합한 후 국부에 페니실린 80,000 단위(unit)를 사용하여 감염을 방지한다.

1.2.2 그룹화

랫드 42 마리를 매 팀에 7 마리, 무작위로 6 군으로 나누었다. ⓛ 모델군 ② 메토프롤롤군 ③ 삼송양심 캡슐군 ④ 대량투여의 현호색 추출물군 ⑤ 적당량투여의 현호색 추출물군 ⑥ 소량투여의 현호색 추출물군 총 6개의 군으로 나누었다.

1.2.3 약물 용량 및 제조 방법

1) 메토프롤롤군(Metoprolol group). 심근경색(MI) 후에 β 수용체 억제제를 투여하기 때문에, 메토프롤롤을 최초에 하루에 두번(bid) 12.5 mg의 적은 용량으로 투여하였고, 즉 투여용량은 25 ×0.018 ×5 = 2.25 mg/kg이었다. 메토프롤롤 67.5 mg을 정확하게 측정하였고, 300 ml의 생리식염수(0.9%)에 고르게 용해시켰다.

2) 삼송양심 캡슐군(Shengsong Yangxin capsule group). 0.4 g/capsule을 하루에 3번(tid) 4개의 캡슐을 투여하였다. 랫드에 대한 용량은 4.8×0.018×5 =0.432 g/kg 이었다. 삼송양심 캡슐 12.96 g을 정확하게 측정하여 300 ml의 생리식염수(0.9%)에 고르게 용해시켰다.

3) 추출물 처리군. 약전에 따라서 가장 큰 현호색 용량은 9 g이었다. 따라서, 0.81 g/kg(9×0.018×5) 은 소량 투여군이고; 1.62 g/kg은 적당량 투여군이고, 3.24 g/kg 은 대량 투여군이었다.

10 ml/kg을 투여할 때 현호색 3.24 g/kg군 농도는 0.324 g/ml, 400 ml를 배합하면 즉 생약 400 ml를 배합하면, 즉 생약 400×0.324 = 129.6 g 이다. 하지만 4.78 g 현호색 진액 = 300 g생약, 129.6 g생약 = 2.06496 g진액이다. 현호색 추출물 진액을 정확히 2.06496 g 취하여 400 ml 생리식염수를 첨가하여 약물에 녹이면 400 ml의 현호색이 대용량으로 배합된다. 대량 투여군 중 110 ml를 취하여 110 ml생리 식염수를 첨가하여 고르게 섞이면 220 ml 적당량 투여군 약품이다. 대량 투여군 중 60 ml를 취하여 180 ml 생리 식염수를 첨가하여 고르게 섞이면 240 ml 소량 투여군 약품이다.

1.2.4 약물 투여 방법

1 ml/100 g을 위내 투여하고 모델군에 동 부피의 생리 식염수를 투여한다. 메토프롤롤군, 삼송양심 캡슐군, 현호색 추출물 대량, 적당량, 소량 투여군에 각각 해당 약품을 투여하였다. 7일간 지속적으로 위내 투여하였다. 최종 약물 혹은 생리 식염수 투여 후 2시간 내에 샘플을 취하였다. 비고: 그 중 모델군 2마리, 메토프롤롤군 1마리, 삼송양심 캡슐군 2마리, 현호색 적당량 투여군 1마리, 현호색 소량 투여군 1마리는 다음날에 위내 약물 투여 전 사망했다.

1.2.5 랫드의 심근 경색 부위의 평가

심장을 취하여 생리 식염수로 심장에 남겨진 혈액을 세척한 후 여과지로 잔여 액체를 흡수시킨 후 무게를 측정하고; 결찰선 밑부분부터 관상동맥 고랑과 평행된 부위에서 심실을 동등 두께로 5조각을 절개한 후 각각 무게 측정 후 0.2%N - BT에 넣어 상온 염색 2-3 분, 스캐너를 이용해 5조각의 심근의 정, 후면 스캔 영상을 획득하였다; 획득한 영상에 대해 맹검법을 이용해 다시 번호를 매긴 후 2명이 멀티미디어 컬러 병리영상분석시스템(MPIDS-500)으로 매개 심근 양측의 경색 구역을 측정하여 다시 맹검법을 이용해 2명의 평균치를 취하여 심실 총 면적, 경색 구역 총 면적 및 경색 구역 면적이 심실 면적에 대한 백분율을 계산하였다.

1.4 통계 분석

데이터 통계 분석은 SPSS16.0통계 분석 소프트웨어를 이용해 분석하였다. 원 웨이 아노바(One-way ANOVA)를 수행하였고, 유의수준이 P<0.05이었다.

2．과정 순서도（도 19 참조）

3. 결과

모델군과 비교해 볼 때, *P<0.05, **P<0.01; 메토프롤롤군과 비교해볼 때, △P<0.05, △△P<0.01. 삼송양심 캡슐군과 비교해 볼 때, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01.

각 군의 심실 총 면적을 비교해 볼 때, 각 군의 유의적인 차이가 없었다(P=0.425). 심근경색면적을 보면, 현호색 추출물 대량 투여군을 제외하고는 모델군과 비교할 때, 메토프롤롤군, 삼송양심 캡슐군, 현호색 추출물 소량, 적당량 ㅌ투여군의 심근경색 면적은 유의적으로 감소하였다(P<0.05). 메토프롤롤군과 비교하였을 때, 현호색 추출물 대량 투여군의 심근경색 면적이 약간의 차이가 있었으며(P<0.05), 다른 처치군과 비교했을 때, 유의적인 차이는 보이지 않았다. 삼송양심 캡슐군과 비교할 때, 현호색 추출물 대량 투여군만이 심근경색 면적이 약간의 차이가 있었으며, 다른 처치군과 비교했을 때, 유의적인 차이는 보이지 않았다. 심근경색 면적/심실 총면적 비율을 모델군과 비교해볼 때, 각 약물 처치군은 모두 모델군보다 축소되어 차이에 통계학적 의의가（P<0.05）있었다. 메토프롤롤군과 비교해볼 때, 현호색 추출물 소량 투여군의 심근경색 면적/심실 총면적에 대해 효과가 더욱 좋았으며 기타 처치군은 통계학적 의의가 없었다. 삼송양심 캡슐군과 비교해볼 때, 각 처치군 사이에 유의적인 차이가 없었다. 이러한 결과는 현호색 추출물 소량, 적당량 투여군은 유의적인 심근경색 면적 축소 작용이 있었고 심근 혈액 공급 부족을 개선하여 국소 허혈성 부정맥의 발생을 감소시킨 동시에 효과는 메토프롤롤군, 삼송양심 캡슐군의 효과와 유사했으며 심지어 더욱 강했다.

4.고찰

관상동맥 좌각전지 결찰로 인한 심근 허혈이 유발한 부정맥 모델은 임상의 급성심근경색 환자에 발생한 부정맥과 아주 유사했다. 부정맥이 발생한 빈도와 심근 허혈의 정도는 상관관계를 나타냈으며 심각한 심근 허혈이 발생시 심근 대사, 세포 구조 및 이온 채널의 이질성이 중대한 변화를 일으켰고 미토콘드리아 산화 대사가 감소 되었고 심근 포스파타아제가 활성화되었으며 인산에스테르가 분해되었으며 혈액순환 중 유리 지방산 함량이 증가 되었고 활성산소가 빈혈조직 중 힘을 모아서 심근 허혈, 손상을 일으켰으며 국부 심근이 카테콜아민에 대한 반응성이 감소되었고, 일시적 칼륨방출 전류(Ito)가 외막과 중, 내막에서의 차이를 증가했으며 J파와 ST가 증가하는 현상이 발생했으며 심근전층 분산 재분극이 증가하여 심근의 재분극의 불균형을 초래함으로써 안쪽으로 들어가는 심근 리듬(reentrant rhythm) 및 부정맥을 유발했다. 관상동맥 관류를 통해 좌심실 웨지 개 동물모델을 통해 부상 글라스 미소전극과 심전도 동시 기록 기술을 이용해 급성심근허혈이 20분 동안 관찰되었고 전체 심근 조직절편 심실성 기외수축(VPC) 발생률이 63.6%였으며, R 온 T(R on T) VPC 와 심실성빈맥이 발생할 가능성이 있다. 또한 급성심근허혈 초기에 내, 중, 외 3층 심근의 Ito가 증가하고 활동전위기간이 단축되었으며 심근전층 분산 재분극이 증가하여 2상 안쪽으로 들어가는 심근 리듬(reentrant rhythm)이 발생했는데 이는 심실성 부정맥 발생의 주요 메커니즘이다. 그 외에 심근 허혈 후 국부 심근 세포 간격이 단백질 연결 방면에서 커플링을 맺을 수 없었고 수량이 감소되었으며 전도속도가 감소되어 자발 혹은 이차성 심실성기외수축이 심실세동을 유발했다.

본 실험예는 본 발명에 따른 현호색 추출물은 랫드의 심근경색 면적 및 심근경색 면적/심실 면적의 백분율을 현저히 축소함으로써 심근 허혈을 개선하고 부정맥의 발생을 감소시켰다는 것을 알 수 있다.

실시예 5

1. 재료와 방법

1.1 실험재료

1.1.1 실험동물

중량 200 내지 220 g의 건강한 랫드를 북경화부강과기주식 유한회사(Beijing HFK Bioscience Co., Ltd.)로부터 구입하였다.

고유 번호 : SCXK 북경 2009-0007.

1.1.2 기기와 설비

전자 저울 DT-2000: 미국 투브라더스 유한회사 생산.

효소라벨측정기(Enzyme-labelled meter) 352 : 핀란드(Labsystems Multiskan MS) 기기모델.

마이크로플레이트 세척기(Microplate washer) AC8 : 핀란드(ThermoLabsystems).

고속 원심 분리기 TG16W : 중국

인큐베이터 : 워터재킷(중국), 기기모델 : GNP-9080 형.

고속 산화기(High speed disperses) : 금단시 금남의기제조유한회사, 기기모델 : FHS-2.

1.1.3 약품과 시약

현호색 추출물 : 노란 갈색 분말, 실시예 3의 방법에 의해 획득, 배치 번호 1: 201107, 1 그램당 추출물 생약 62.762g 상당; 배치 번호 2: 201107, 1 그램당 추출물 생약 65.50218g 상당.

메토프롤롤(Metoprolol)：아스트라제네카 약업 유한회사(AstraZeneca Pharmaceutical Co. Ltd.)，규격：25mg/정제，배치 번호：1105031；

삼송양심 캡슐(Shengsong Yangxin capsule)：하북 이령 약업 유한회사，규격：0.4g/정제，배치 번호1104007；

니트로테트라졸륨블루염화물（N-BT），배치 번호：2541C012，암네스코사(Amresco);

클로랄 수화물(Chloral hydrate)，배치 번호 :20110210，국약그룹 화학시약 유한회사(Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd).

1.2 실험방법

1.2.1 동물 모델 확립

랫드에게 3.5%의 10 ml/kg 클로랄 수화물을 복강내 주사 마취하여 반듯이 눕힌 후 판넬에 고정시켰다. 랫드의 왼쪽 4, 5번째 늑간을 절개하여 흉강을 열고 심막을 열어서 흉곽을 약간 눌러 심장을 드러나게 한 후 0호 수술실로 왼쪽 귓바퀴(Left auricle) 아래 2 mm 되는 부위에서 관상동맥 좌측 전하행지를 결찰한 후 즉시 심장을 흉강에 넣고 절개구와 피부를 봉합한 후 국부에 페니실린 80,000 단위(unit)를 사용하여 감염을 방지하였다.

1.2.2. 그룹화

랫드 42 마리를 매 팀에 7 마리, 무작위로 6 군으로 나누었다. ⓛ 모델군 ② 메토프롤롤군 ③ 삼송양심 캡슐군 ④ 대량 투여의 현호색 추출물군 ⑤ 적당량 투여의 현호색 추출물군 ⑥ 소량 투여의 현호색 추출물군 총 6개의 군으로 나누었다. 대조군 6 마리 랫드와 가장수술군(sham operation) 6 마리군을 포함하여 총 8군으로 나누었다.

1.2.3 약물 용량 및 제조방법 : 실시예 1의 1.2.3 참조

1.2.4 약물 투여 방법

1 ml/100 g을 위내 투여하고 모델군, 정상 대조군, 가장 수술군에 동 부피의 생리 식염수를 투여하였다. 메토프롤롤군, 삼송양심 캡슐군, 대량, 적당량, 소량의 현호색 추출물 투여군에 각각 해당 약물을 투여하였다. 7일간 지속적으로 위내 투여하였다. 최종 약물 혹은 생리 식염수 투여 후 2시간 내에 재료를 취하였다. 비고 : 그 중 모델군 1마리, 가장 수술군 1마리는 다음날에 위 내 약물 투여 전 사망하였다.

1.3 심근경색 면적 평가

결찰 부위 밑의 경색 부위를 절개하여 심장을 취하였고, 생리 식염수로 심강에 남겨진 혈액을 생리 식염수로 세척하였다. 일정량의 PBS, pH 7.4를 첨가한 후, 액체 질소로 신속히 냉동 보관하였다.

Na⁺-K⁺-ATPase, Ca² ⁺-ATPase의 검측: 시약키트 설명서대로 조작, 측정하였다.

순서는 다음과 같다:

(1)냉동된 심장 샘플을 해동한 후 2 - 8℃의 온도를 유지시키고 심근조직의 무게를 측정한 후 일정량의 PBS를 배합하고 균질기를 이용해 표본을 충분히 균질화시켜 20%의 심근조직 파쇄액으로 만들었다. 원심분리기로 2000 회/분, 20분간 원심 분리시켜 상청액을 취하였다.

(2) 표준품의 희석과 샘플 주입: 표준품은 설명서에 의해 5 구배로 희석시켰다. 농도는 각각 1200 ug/L, 800 ug/L, 400 ug/L, 200 ug/L, 100 ug/L 였고, 모든 구배의 웰당 샘플 50 ㎕을 첨가하였다.

(3) 샘플 주입: 대조군 웰 및 실험군 웰을 셋업하였다. 키트의 플레이트 위에 시험되어야 할 샘플 웰에 40 ul 샘플-희석 용액을 첨가한 후, 웰의 옆쪽 벽면을 건드리지 않고 플레이트의 아래쪽에 10 ul의 시험되어야 할 샘플을 첨가한 후, 가볍게 흔들어 주었다.

(4) 배양

플레이트를 파라필를(parafilm)으로 봉입하고 배양기에 37℃에서 30분 동안 배양하였다.

(5) 제조된 액 세정

30배의 농축 세정액을 증류수로 30배 희석 후 조심스럽게 파라필름을 제거한 후 액체를 버리고 탈수한 후 각 웰에 세정액을 가득 채우고 30초간 방치 후 버렸다. 이렇게 5회 반복한 후 건조시켰다.

(6) 효소 첨가

대조군 웰을 제외하고 50 ul의 시약을 첨가하였다.

(7) 배양

플레이트를 파라필름으로 봉입하고 배양기에 37℃에서 30분 동안 배양하였다.

(8) 세정

조심스럽게 파라필름을 제거한 후 액체를 버리고 탈수한 후에 각각의 웰에 세정액을 가득 채우고 30초간 방치 후에 버렸다. 이렇게 5회 반복한 후 건조시켰다.

(9) 착색

각각의 웰에 착색제 A 50 ul을 첨가한 후 착색제 B 50 ul을 첨가하고 나서 천천히 흔들어 고르게 섞은 후 37℃에서 빛이 닿지 않게 15분 동안 두어 착색시켰다.

(10) 50 ul의 종결 용액(ter분ation solution)을 첨가하여 각 웰에서 반응을 종결시켰다.

(11) 측정

대조군을 제로로 설정하고 450 nm에서의 각 웰의 흡광도(OD)를 측정하였다. 종결 용액을 첨가하고 15분 후에 수행하였다.

(12) 흡광도 계산

표준물의 농도를 가로축(X)로 하고 OD 값을 세로축(y)로 하여 좌표에 표준 곡선을 나타내고 샘플의 OD 값에 의해 표준곡선으로 해당 농도를 찾아낸 후 희석 배수를 곱하거나 표준물의 농도와 OD 값을 이용해 표준곡선의 선형회귀식을 계산하고 샘플의 OD 값을 방정식에 대입시켜 샘플 농도를 계산한 후 희석 배수를 곱하여 실제 농도를 구하였다.

1.4 통계분석

데이터 통계 분석은 SPSS 16.0 을 이용하여 수행하였다. 수치는(X±SD)로 나타내었다. 일방향 아노바(One-way ANOVA)를 수행하였다. OD 값과 농도는 단순선형회귀분석을 하였다. P<0.05는 유의적인 결과를 나타낸다.

2. 과정 순서도. 도 19참조

3. 결과

3.1. Na⁺-K⁺-ATPase, Ca² ⁺-ATPase 시험의 결과

3.1.1. 표준 샘플의 회귀 방정식

표 중 측정한 OD치와 농도에 의해 회귀방정식 Y = -0.725 + 5.071X, r=0.996을 얻어냈다.

3.1.2 Na⁺-K⁺-ATPase 의 농도

정상군과 비교해볼 때, *P<0.05, **P<0.01 모델군과 비교해볼 때, △P<0.05, △△P<0.01 메토프롤롤군과 비교해볼 때, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01.

결과를 보면, 정상군과 비교해볼 때, 나머지 각 군의 Na⁺-K⁺-ATPase농도는 모두 낮아졌고 특히 모델군이 현저히 감소되어 차이에 통계학적 의의가(P<0.01) 있었다. 모델군과 비교해볼 때, 각 처치군의 Na⁺-K⁺-ATPase 농도치는 모두 조금 높아져 차이에 통계학적 의의가(P<0.01) 있었다. 메토프롤롤군과 비교해볼 때, 삼송양심캡슐팀, 현호색 추출물 대량, 적당량, 소량 투여군의 Na⁺-K⁺-ATPase농도치는 약간 작아 치료 효과는 메토프롤롤팀보다 좋지 않았다. 실험결과, 현호색 추출물 중, 소량 투여군은 Na⁺-K⁺-ATPase활성을 제고시켜 Na⁺-Ca² ⁺교환을 촉진시켰으며 세포 내 칼슘 부하가 감소하였고 심근 허혈을 개선한 동시에 심근 손상 회복을 촉진함으로써 허혈성 부정맥의 발생을 감소시켰다.

3.2 Ca² ⁺-ATPase 농도 측정 결과

3.2.1 표준 샘플 측정을 통해 얻은 회귀 방정식

표 중 측정한 OD값과 농도에 의해 회귀방정식 Y = -0.871 + 8.473X, r = 0.997 을 얻어냈다.

3.2.2 Ca² ⁺-ATPase 의 농도

결과를 보면, 정상군과 비교할 때, 각 군의 Ca² ⁺-ATPase 농도는 모두 낮아졌고 특히 모델군이 현저히 감소되어 차이에 통계학적 의의가(P<0.01)있었다. 모델군과 비교해볼 때, 각 처치군의 Ca² ⁺-ATPase 농도는 모두 조금 높아져 차이에 통계학적 의의가(P<0.01) 있었다. 메토프롤롤군과 비교해볼 때, 삼송양심 캡슐군, 현호색 추출물 대량, 적당량, 소량 투여군의 Ca² ⁺-ATPase 농도는 약간 작아 치료 효과는 메토프롤롤군보다 좋지 않았다. 실험결과, 현호색 추출물 적당량, 소량 투여군은 Ca²⁺-ATPase활성을 현저히 증가시켜 칼슘 부하를 감소시켰으며 나트륨, 칼슘의 교환을 촉진시킨 동시에 심근 허혈을 개선함으로써 부정맥의 발생을 감소시켰다.

4.고찰

4.1 Na⁺-K⁺-ATPase의 생리 작용

Na⁺-K⁺-ATPase는 나트륨-칼륨 펌프라고도 불린다. 이는 세포막 중 가장 중요한 이온펌프다. 또한 크고 작은 2개의 서브유닛이 있는데 큰 서브유닛은 ATP를 촉매, 가수분해하고 작은 서브유닛은 한 개의 당단백질이다. Na⁺-K⁺-ATPase는 인산화와 탈인산화 과정을 통해 형태의 변화를 발생시켜 Na⁺와K⁺과의 친화력에 변화를 일으킨다. 큰 서브유닛은 친 Na⁺상태로 Na⁺과 결합한 후 ATP의 가수분해를 유발시키는데 1분자의 ATP를 가수분해할 때마다 3개의 Na⁺를 세포 밖으로 이송하는 동시에 2개의 K⁺를 세포 내로 이동시켜 막간(transmembrane) 경사도와 전위 차를 조성함으로써 신경근육의 흥분의 기초가 된다. 세포 내의 Na+농도가 높아지거나 세포 외의 K⁺농도가 높아지면 Na⁺-K⁺-ATPase를 활성화할 수 있다. Na⁺-K⁺-ATPase의 특징은 그의 이온에 대한 수송 순환은 인산화과정에 의존하며 ATP의 1개의 인산기가 Na⁺-K⁺-ATPase의 1개의 아스파르트산 잔기로 이동하면 형태의 변화를 초래하게 된다.

Na⁺-K⁺-ATPase의 중요한 생리적 의의는: 1) 세포 내의 높은 칼륨 함량을 유지하는데 세포내의 높은 칼륨 환경은 세포가 정상적인 대사 활동을 진행하는 필요하다. 2) 세포 외의 높은 나트륨 함량을 유지하는데 세포의 정상적인 형태를 유지하고 정상적인 체액량 유지하는데 중요한 역할을 한다. 3) 세포 내, 외의 이온 분포를 불균형하게 함으로써 생체전위 발생의 기초이며 즉 K+의 외부이동은 휴지전위(resting potential)를 발생시키고 Na+의 외부이동은 활동전위를 발생시킨다. 4) 기타 물질의 능동 수송을 위해 에너지를 제공한다. 5) 세포 내의 PH 안정을 유지시키고 Na⁺-K⁺-ATPase는 Na⁺-H⁺교환을 위해 원동력을 제공한다.

4.2 Ca² ⁺-ATPase의 생리 작용

Ca² ⁺-ATPase는 칼슘펌프라고 부르는데 세포막, 근소포체와 소포체에 분포되어 있다. 세포막의 Ca² ⁺-ATPase는 원형질막 칼슘 펌프,PMCA1개의 ATP 분자를 분해할 때마다 1개의 Ca² ⁺를 세포질에서 세포 외로 이동시키고; 근소포체와 소포체의 Ca²⁺-ATPase는 근소포체(sarcoplasmic reticulum) 칼슘 1개의 ATP를 분해할 때마다 2개의 Ca² ⁺를 세포질에서 근소포체와 소포체 내로 이동시킨다. 그의 수송 메커니즘은 Na⁺-K⁺-ATPase와 유사한데 즉 인산화와 탈인산화반응을 통해 Ca² ⁺의 수송을 완성한다. Ca² ⁺-ATPase는 1개의 펩티드사슬로 구성되었으며 10개의 막통과(transmebrane) 나선구조(helix)가 있는데 그의 N 말단과 C 말단은 모두 막의 세포질측에 분포되어 있다. 그의 ATP결합부위, 인산화부위와 Ca² ⁺결합부위도 세포질측에 분포되어 있다. 그 외에 세포질 내에 분포된 C 말단은 Ca² ⁺와 칼모듈린(Calmodulin) CaM복합물과 결합할 수 있는 도메인을 1개를 가지고 있는데 이 부위는 Ca² ⁺-ATPase 자체의 활성에 대해 억제작용 즉 소위 자기억제작용이 있다. 세포질 내의 Ca² ⁺농도가 높아질 경우 비교적 많은 Ca² ⁺-CaM복합물을 형성하는데 후자는 이 부위와 결합하여 그가 효소 활성에 대한 억제작용을 해제함으로써 효소단백질이 Ca²⁺에 대한 친화력과 수송 속도를 향상시켜 Ca² ⁺의 외부 배출을 가속화시키는데 이는 세포 내의 Ca² ⁺의 안정상태의 음성피드백기전이다. 근소포체의 Ca² ⁺-ATPase도 이런 유사한 조절 메커니즘이 있지만 효소 활성 억제 부위가 효소분자의 C 말단이 아니라 효소분자와 분리된 포스포람반(phosphlamban)이다.

Ca² ⁺-ATPase의 주요 작용은 세포질 내의 Ca² ⁺농도가 저 수준에 있도록 유지하는 것인데 이는 세포의 정상적 생리 기능에 대해 중요한 의의가 있다. 막 내, 외의 Ca² ⁺농도 구배는 다양한 메키니즘을 통해 유지되는 것이며 여기에 근소포체 혹은 소포체의 Ca² ⁺-ATPase, 세포막의 Na⁺-Ca² ⁺교환체와 Ca² ⁺-ATPase의 기능 활동을 포함하고 있다. 세포질 내의 유리 Ca² ⁺농도가 장시간 동안, 비가역적으로 높아질 경우 칼슘의 부하가 발생하여 세포에 독성을 일으키며 심지어 세포의 사멸을 초래할 수 있다.

4.3 Na⁺-Ca² ⁺교환 메커니즘

Na⁺-Ca² ⁺교환체는 세포막 내의 양방향 수송 시스템으로서 이는 3개의 Na⁺를 들여보내고 1개의 Ca² ⁺를 내보내는 것을 통해 진행한다. Na⁺-Ca² ⁺의 이온 막간 수송의 방향은 3개 요소에 의해 결정되는데 즉 세포막 내외의 Na⁺농도차, Ca² ⁺농도차와 막전위 수준이다. 휴지전위와 활동전위의 대부분 시간 내에 Ca² ⁺는 Na⁺-Ca² ⁺과의 교환을 통해 세포 외로 배출되고 Na⁺가 세포로 진입했을 때 1개의 내향전류가 발생하여 세포막 내의 전위를 플러스로 변화시킨다. 활동전위가 감극일 때만 대량의 Na⁺가 세포로 진입하여 Na⁺-Ca² ⁺교환체가 단시간의 반대방향 수송이 발생함으로써 3개의 Na⁺를 배출하고 1개의 Ca² ⁺를 바꿔서 세포로 진입시켜 일시적인 외향전류를 발생시킨다. 그의 주요 기능은 나트륨펌프를 이용해 만든 막 양측의 Na⁺의 농도 구배의 위치에너지가 세포 내의 Ca² ⁺를 외부로 배출시킴으로써 세포질 내의 낮은 유리 Ca² ⁺농도를 유지하도록 한다. Na⁺-Ca² ⁺교환 메커니즘은 심근 세포가 Ca² ⁺안정적 상태를 유지하는 중요한 메커니즘으로서 활동전위가 3기(phase) 말로 재분극될 때 Na⁺-Ca² ⁺교환 메커니즘을 일으켜 내부의 칼슘을 외부로 유출시키며 L형 칼슘 통로를 통해 유입된 칼슘 이온을 배출시킨다. 항(anti) Na⁺-Ca² ⁺도 마찬가지로 칼슘의 내류를 일으킬 수 있으므로 L형 칼슘 통로를 통한 칼슘의 내류는 근소포체가 칼슘을 방출하는 주요 유발 신호라고 할 수 있다. 심근 허혈 시 Na⁺-Ca² ⁺교환 기능은 저하되어 세포 내의 칼슘 이온 농도가 증가함으로써 부정맥, 심근 정지, 심지어 괴사를 초래할 수 있다.

4.4 Na⁺-K⁺-ATPase, Ca² ⁺-ATPase활성과 심근허혈, 부정맥

심근허혈시, 심근 세포가 호기성 대사로부터 혐기성 해당으로 신속히 전환되어 심근 세포내의 ATP를 전부 소모해버리게 된다. ATP의 수준이 낮아지면 일련의 대사의 이상과 문란을 더욱 일으키게 되며 ATP에 의존하여 수송하는 Na⁺-K⁺-ATPase, Ca²⁺-ATPase활성도 저하된다. Na⁺-K⁺-ATPase활성 저하는 K⁺의 과도한 유실과 세포 내의 Na⁺의 증가를 일으켜 Na⁺-Ca² ⁺의 교환에 더 영향을 주게 되며 세포 내의 Ca² ⁺농도를 높아지게 한다; Ca² ⁺-ATPase활성 저하는 칼슘이 세포질로부터 세포 외로 이동하는 속도를 느리게 하여 세포 내의 Ca² ⁺농도가 증가하게 된다. 양자의 합동작용으로 인해 세포 내의 칼슘부하가 일어나는데, 칼슘부하는 리아누딘(Ryanoodine)수용기(RyR)와 나트륨 칼륨 교환의 내향전류를 통해 탈분극하여 자발적인 Ca² ⁺의 방출을 일으킬 수 있는데 이것이 바로 지연성 후탈분극으로서 이는 부정맥을 유발할 수 있다.

4.4.1 Na⁺-K⁺-ATPase활성저하와 심근허혈, 부정맥

Na⁺-K⁺-ATPase은 에너지 전환 펌프로서 세포막에 분포되어 있다. 이온 수송이란 주요 기능 외에 그는 또 각기 다른 타이로신 단백질 인산화의 조절을 통해 세포 외 신호를 세포 내로 전달시킨다. Na⁺-K⁺-ATPase는 세포질 티로신인산화효소 Src를 활성화시키며 Src는 기타 단백질이 각기 다른 신호 유닛으로 진입하도록 인산화, 집합시킨다. 활성화된 단백질 인산화효소 캐스케이딩은 MAPK, P13/Akt와 PKC를 포함한다. 또한 Src/세포 외 신호 키나아제 1/2(ERK1/2)신호 캐스케이딩을 통해 반응하여 SSA412와 Na⁺-K⁺-ATPase의 H7-H8 도메인 연합은 Na⁺-K⁺-ATPase를 활성화시킴으로써 칼슘의 내류를 증가하여 심근 수축을 증가하고 심장 기능을 보호하며 심근허혈을 예방한다. NKA-아단위 897DVEDSYGQQWTYEQR911 도메인의 다클론항체 DRRSAb에 대해, 농도의존에 의해 NKA활성을 제고시킬 수 있으며 분리된 심장의 24시간 후의 세포 생존률을 현저히 향상시킬 수 있다. 급성심근경색 시 심근기면(mycardial stunning)이 발생하는 동시에 세포막의 Na⁺-K⁺-ATPase활성도 현저히 감소된다. 좌각전지에 대한 결찰을 실시한 심근경색군과 가장 수술군의 3일과 30일의 Na⁺-K⁺-ATPase 활성 및 좌심실 수축압을 통해 심근경색 후 3일과 30일에 심근 Na⁺-K⁺-ATPase활성과 심근 수축력이 선명하게 감소되었다는 결과를 알 수 있다. Na⁺-K⁺-ATPase의 활성 저하는Na⁺, K⁺와 Ca² ⁺의 근소포체를 통한 수송을 변화시켜 좌심실 기능 저하를 초래하여 부정맥의 발생을 유발시킨다.

그 외에 심근허혈 시, Na⁺-K⁺-ATPase의 활성이 저하되면서 세포 내의 Na⁺를 증가하게 하며 산중독 시 Na⁺/H⁺의 교환과 산중독을 신속히 바로잡을 때의 Na⁺/HCO3^-의 작용 및 간극연접 매개 세포의 Na⁺수송 등 이러한 경우에 세포 내의 나트륨부하를 초래함으로써 Na⁺-Ca² ⁺교환체의 역수송 현상을 일으켜 Na⁺를 세포 외로 수송하고 Ca²⁺를 세포 내로 수송하여 칼슘 과적을 일으키게 된다. 이완기의 칼슘 부하는 후탈분극과 전기세포의 불안정성과 관련된 후수축을 일으켜 심실성 부정맥을 초래하게 된다. 재관류 전에 허혈 양상 처리(IPC)를 거치지 않은 심근허혈 심장을 5분 동안 재관류시, Na⁺-K⁺-ATPase의 활성은 현저히 감소되며 Na⁺-K⁺-ATPase의 1과 2 서브유닛이 세포골격으로부터 분리되고 이것은 칼모듈린 및 α-포드린 가수분해와 동일하게 일어난다. 허혈양상화(ischemic preconditioning)는 나트륨 전류의 회복을 가속화하고 Na⁺-K⁺-ATPase의 활성을 증가하며 Na⁺-K⁺-ATPase의 세포막 골격으로부터의 해리를 억제한다. 또한 허혈양상화는 α-포드린 및 칼모듈린의 활성화를 예방하고 LDH의 방출을 감소하며 심근경색 면적 및 손상을 축소시킨다. 제시할 점은 재관류 시, 허혈양상화는 나트륨 칼륨 펌프의 활성을 향상시키는 것을 통해 심근 손상을 보호하고 재관류 부정맥을 감소시키는 역할을 발휘하게 된다.

4.4.2 Ca² ⁺-ATPase활성 감소와 심근허혈, 부정맥

근소포체 내의 Ca² ⁺-ATPase는 심근 세포 내의 칼슘 수준 및 흥분 수축 연결 조절에 지극히 중요한 역할을 발휘한다. 이완기에 근소포체의 Ca² ⁺-ATPase는 세포질 내의 유리 Ca² ⁺을 다시 근소포체로 섭취함으로써 칼슘의 재흡수를 완성한다. 심근 수축 시, 근소포체내의 Ca² ⁺는 근소포체막의 RyR2을 통해 세포질 속으로 방출되고 트로포닌과 결합하여 근세사의 수축을 일으켜 심근의 흥분-수축 커플링을 완성한다. 근소포체의 Ca² ⁺-ATPase활성이 저하될 경우 칼슘이 세포질에서의 이동 속도를 느리게 하여 이완기 단백 수축에 손상을 일으키게 된다. 근소포체의 Ca² ⁺-ATPase활성이 저하될 경우에 또 세포내의 Ca² ⁺ 재흡수를 감소시켜 세포 내의 칼슘부하를 유발한다. 근소포체 내의 칼슘부하는 리아누딘(ryanoodine) 수용기와 나트륨 칼륨 교환을 통한 내향전류 감극으로 자발적인 Ca² ⁺ 방출 즉 지연성 후탈분극을 일으키게 되는데, 이는 부정맥 발생의 기초이자 심방세동의 발작과 유지와 관련이 있을 가능성도 존재한다. 그 외에 근소포체의 칼슘부하는 이완기 세포 내의 칼슘을 증가시키는데 나트륨 칼슘 교환 활성은 후탈분극을 일으킴으로써 활동을 유발하거나 최종적으로 치명적인 심실성 부정맥을 일으킬 수 있다.

근소포체의 Ca² ⁺-ATPase의 활성은 주로 1개의 52개 아미노산으로 구성된 소분자 포스포람반에 의해 조절한다. 비인산화 상태에서 포스포람반은 Ca² ⁺-ATPase이 Ca²⁺에 대한 민감성을 감소시키며 인산화 상태에서는 그가 Ca² ⁺에 대한 민감성을 제고시킨다. 심근 포스포람반의 인산화는 많은 효소에 의해 촉진되는 이는 칼슘/칼모듈린이 의존하는 단백질 인산화효소와 c-AMP이 의존하는 단백질 인산화효소A를 포함한다. 랫드의 좌각전지가 지체한 후의 몇 주 사이의 만성 심근경색 모델을 볼 때 심근 근소포체의 Ca² ⁺-ATPase의 mRNA와 단백 수준이 저하되었음을 발견했으며 심근경색으로 인한 좌심실 리모델링 시에도 근소포체의 Ca² ⁺-ATPase활성의 저하 현상을 발견했다. 그 외에 나트륨 제한 간섭은 허혈 혹은 재관류로 인한 과다한 Ca² ⁺ 누적을 예방함으로써 심근 손상과 기능 실조를 개선할 수 있다. 또한 심근 빈혈 시, ATP의 소모는 Na⁺-K⁺-ATPase의 활성 저하를 일으켜 전기 화학 전위 감소와 Ca² ⁺의 내류를 촉진시킨다. 허혈양상화는 상대적으로 칼슘부하를 감소하여 심근을 보호함으로써 부정맥의 발생을 감소시킨다.

4.5 현호색 추출물의 Na⁺-K⁺-ATPase, Ca² ⁺-ATPase에 대한 영향

본 실험예의 결과를 볼 때, 급성심근경색 후 랫드의 심근 세포 내의 Na⁺-K⁺-ATPase, Ca² ⁺-ATPase활성이 현저히 감소되었음을 알 수 있다. 현호색 추출물 혹은 메토프롤롤, 삼송양심캡슐을 투여 후, 랫드의 심근 Na⁺-K⁺-ATPase, Ca² ⁺-ATPase활성은 각각 어느 정도 향상되었다. 그리고 실험예 1에서는 현호색 추출물은 심근경색 면적을 현저히 축소시키고 심근 기능을 보호한다는 점까지 제시해주었다.

상기한 바와 같이, 심근허혈 시, Na⁺-K⁺-ATPase, Ca² ⁺-ATPase의 활성이 저하됨으로 인해 세포 내의 Na⁺부하를 일으키고 Na⁺-Ca² ⁺의 교환을 통해 나트륨 칼륨 교환체 역수송이 발생하여 세포 내의 칼슘부하를 유발했다. 또한 칼슘부하는 지연성 후탈분극을 초래하여 부정맥을 유발할 수 있다. 하지만 Na⁺-K⁺-ATPase, Ca² ⁺-ATPase활성 증가시, 칼슘부하를 감소시켜 심근을 보호하는 동시에 전기신호의 안정을 보장함으로써 부정맥의 발생을 감소시킬 수 있다.

추출물의 전처리가 허혈성 재관류 심근 Na⁺-K⁺-ATPase, Ca² ⁺-ATPase의 활성에 미치는 영향을 관찰한 결과, 가장 수술군과 비교할 때, 심근허혈성 재관류 손상 후 심근 세포막의 Na⁺-K⁺-ATPase, Ca² ⁺-ATPase의 활성이 현저히 감소되었고; 모델군과 비교하였을 때, 추출물 처리 후의 Na⁺-K⁺-ATPase, Ca² ⁺-ATPase활성이 증가하였다. 이러한 결과는 추출물 전처리가 심근의 Na⁺-K⁺-ATPase, Ca² ⁺-ATPase의 활성을 제고시켜 Na⁺-Ca² ⁺의 교환을 촉진시키며 세포 내의 칼슘부하를 감소시킴으로써 허혈성 심근의 손상을 보호하고 부정맥의 발생을 감소시킨다는 점을 제시해준다.

이로부터, 본 발명에 따른 현호색 추출물은 Na⁺-K⁺-ATPase, Ca² ⁺-ATPase의 활성을 증가시켜 세포 내의 칼슘부하를 감소시키고 심근허혈을 개선하며 심근경색 면적을 감소시키고 지연성 후탈분극의 발생을 감소시킴으로써 항부정맥의 작용을 발휘한다는 것을 알 수 있다.

실험예 6

1. 재료 및 방법

1.1.1 재료

1.1.1 동물

중량 200 내지 220 g의 건강한 랫드를 북경화부강과기주식 유한회사(Beijing HFK Bioscience Co., Ltd.; 시리얼 번호: SCXK beijing 2009-0007)로부터 구입하였다.

1.1.2 기기 및 설비

DT-2000 전자 저울은 투 브라더스사(Two Brothers Co. Ltd)에서 제작하였다. BS224S 전자 저울은 사토리우스(Sartouris, 독일)에서 구입하였다. 효소-라벨 기기 352는 랩시스템 멀티스칸사(Labsystems Multiskan, 핀란드)에서 제조하였다. 마이크로 플레이트(micro-plate) 세척기 AC8은 썰모 랩시스템 사(Thermo Labsystems, 핀란드)에서 만들었다. 고속 미세-원심분리기 TG16W는 중국에서 제조하였다. 워터 재킷 배양기(water jacket incubator) GNP-9080은 중국에서 제조하였다. 바이오-래드(Bio-Rad) 전기영동기(정전류 및 정전압) 파워팩 HQ(Powerpac HQ)는 미국에서 제조하였다. 바이오-래드 수직형 전기영동 장치 MP3는 미국에서 제조하였다. 바이오-래드 반건조 이동 유닛인 트랜스-블럿 SD(Trans-Blot SD)는 미국에서 제조하였다. 이미지-프로 플러스(Image-Pro Plus)는 소프트웨어 6.0으로 분석하였다. 고속 미세-원심분리(4℃) MR23i은 썰모사(Thermo, 미국)에서 제조하였다. 고속 미세-원심분리(실온) 5417C는 에펜도르프사(Eppendorf, 독일)에서 제조하였다. 미세주사기(microsyringe) 에펜도르프 리서치 플러스(eppendorf Research plus)는 에펜도르프사(독일)에서 제조하였다. 온도조절 장치 항온 수조 HHW-420은 중국, 상해에서 제조하였다. 액체 질소 탱크 및 시료 이동 저장 탱크 YDS-30-125는 중국 쓰촨성에서 제조하였다.

1.1.3 약품 및 시약

황색(yellowish) 파우더인 현호색 추출물은 실시예 3의 배치 번호 1: 201107의 실험을 통해 수득하였다. 상기 추출물 1 g은 배치 번호 2: 201107의 조약물(crude medicinal) 62.762 g과 동등하다. 상기 추출물 1 g은 조약물 65.50218 g과 동일하다. 25 ㎎/정제(tablet)의 메타프롤롤(metaprolol)은 아스타르제네카 제약회사(AstraZeneca Pharmaceutical Co. Ltd., 배치 번호: 1105031)에서 공급받았다. 0.4g/캡슐인 삼송양심(Shengsong YangXin) 캡슐은 허베이 이링 제약회사(Hebei Yiling Pharmaceutical Co. Ltd., 배치 번호: 1104007)에서 준비하였다. 클로랄 수화물(chloral hydrate)는 시노팜 화학 약품사(Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.; 배치 번호: 20110210)에서 구입하였다.

웨스턴 블럿(Wsteren blot)은 아크릴아미드(acrylamide), 비스아크릴아미드(bisacrylamide), 판소(ponceau), 황산 도데실나트륨(sodium dodecylsulfate), β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 사용하였다. 바이오-래드 분자량 마커(제품 번호: 161-0374, 배치 번호: 310007919)는 미국에서 제조하였다. 니트로셀룰로오즈(nitrocellulose) 막은 밀리포어사(Millipore, 독일; 제품 번호: PIVH00010, 배치 번호: K1EA1531FK)에서 구입하였다. 광감성(light-sensitive) 필름은 코닥사(Kodak, 미국; 제품 번호: XBT-1, 배치 번호: 020901701)에서 구입하였다. 커넥신 43(connexin 43) 및 포스포-커넥신(phospho-connexin 43)(Ser 368)의 1차 항체는 미국의 CST 사(배치 번호: 08/2011)에서 제조한 토끼 다클론 항체이다. 2차 항체는 북경 종산 골든스페이스 생명공학사(Beijing Zhongshan Goldenspace Biotechnology Co. Ltd.)에서 제조한 HRP가 라벨된 거위의 항-토끼 IgG 및 HRP가 라벨된 토끼의 항-거위 IgG를 사용하였다.

두 개의 2차 항체는 면역조직화학(immunohistochemistry) 시험에 사용되었다. 커넥신 43 토끼 다클론 항체는 미국 CST 사(배치 번호 08/2011)에서 제조하였고, 포스포-커넥신 43(Ser368) 토끼 다클론 항체는 미국 산타크루즈사(Santa Cruz; 배치번호: G2011)에서 제조하였다. 2차 항체를 위한 SP 2-단계 시약 키트(SP 2-step reagent kit)는 북경 종산 골든스페이스 생명공학사(Beijing Zhongshan Goldenspace Biotechnology Co. Ltd.; 배치 번호: K116812C)에서 공급되었다. 2500 ㎖/병의 무수(Anhydrous) 에탄올(ethyl alcohol)은 북경 케미컬 웍스(Beijing Chemical Works; 배치 번호: 20110808)에서 공급받았다. 2500 ㎖/병의 95 % 에탄올(ethanol)은 북경 케미컬 웍스(배치 번호: 20110808)에서 공급받았다. 500 ㎖/병의 포르말린(Formalin) 용액은 실롱 화학약품사(Xilong Chemical Corporation; 배치 번호 1110082)에서 공급받았다. 자일렌(xylene) 용액은 북경 케미컬 웍스(Beijing Chemical Works; 배치 번호: 20110808)에서 공급받았다. 파라핀 섹션(Parafin section)(54 내지 56 ℃)은 북경 베이후아캉타이 시약회사(Beijing Beihuakangtai Reagents Co. Ltd.; 배치 번호 20110428)에서 공급되었다. DAD 시약 키트(DAB reagent kit)는 북경 콤윈 생명공학사(Beijing ComWin Biotech Co. Ltd.; 배치 번호 03911H)에서 공급되었다. 강도(strength) 25 ㎎의 폴리라이신(polylysine)은 상해 시그마-알드리치 무역사(Shanghai Sigma-aldrich Trading Co. Ltd.; 배치 번호 P1399)에서 공급되었다. 현미경 커버 글래스(24×24 ㎜) 및 슬라이드 글래스(모델 7105)는 북경 추안강후아신 실험기구 사(Beijing Chuanganghuaxin Experimental Instrument Co. Ltd)에서 구입하였다. 그 외 스테인레스강 압력공(Stainless steel pressure port), 전자레인지(microwave oven), 온도조절장치 항온수조(thermostatic waterbath), 면역조직화학(immunohistochemistry) 키트, 항원 검색 키트(antigen retrieval kit) 및 현미경(microscope)을 사용하였다.

1.2 방법

1.2.1 동물 모델 확립

랫드를 판자에 누워서 고정하고, 클로랄 수화물(3.5 %, 10㎎/㎏)을 복강 내에(intraperitoneally) 주입하였다. 왼쪽 4 내지 5번 늑골 사이로, 흉강(pleural cavity)을 절개하고, 심낭(pericardium)을 뜯어 연 다음, 흉부(thorax)로 광압(light pressure)을 통해 심장을 적출하였다. 좌측 귓바퀴(auricle) 2 ㎜ 아랫쪽(beneath)부터 결찰(ligation)을 좌측 외측의 하향하는 순으로 수술봉합(surgical suture)(USP 0)을 수행하였고, 심장은 흉부로 원위치하였다. 절개한 것은 닫아서 봉합하였다. 페니실린(Penicillin)(80,000 유닛까지)은 반복 감염에 대비하기 위해 절개 부위에 사용하였다.

1.2.2 그룹화

84 마리의 랫드 모델은 무작위로 14 마리씩 총 6 그룹으로 나누었고, 모델 그룹, 메토프롤올(Metoprolol) 그룹, 삼송양심(Shengsong Yangxin) 캡슐 그룹, 추출물 대량-투여 그룹, 추출물 적당량-투여 그룹 및 추출물 소량-투여 그룹으로 나누었다. 13 마리 랫드의 대조군 및 13 마리 랫드의 모의(sham) 수술 그룹(operation group)을 두 개 이상의 그룹으로 추가하였다. 몇몇의 랫드는 다음 날 위내부(intragastrical) 투여 전에 사망하였다: 모의 수술 그룹, 모델 그룹, 메토프롤롤(Metoprolol) 그룹, 삼송양심(Shengsong Yangxin) 캡슐 그룹, 추출물 대량-투여 그룹, 추출물 적당량-투여 그룹에서 한 마리씩 사망하였고, 소량-투여 그룹에서 2 마리가 사망하였다.

1.2.3 약물 투여량 및 준비

실험예 1의 1.2.3 절(section) 참조.

1.2.4 약물(treatment) 투여

모델군 확립 후 다음날부터 시작하여, 대조군, 모델 그룹 및 모의 수술 그룹에 위 내부로 정상 생리식염수(saline)(1 ㎎/100 g)을 투여할 때까지, 약물은 대응되는 관련 그룹에 모두 위 내부로 투여하였다. 처치 과정은 7 일이 소요되었다.

1.2.5 심근경색(myocardial infarction; MI) 부위의 확인

마지막 처치가 끝난 후 두 시간 후에, 랫드의 심장을 수득하여 심실(heart chambers) 내의 잔여 혈액을 정상 생리식염수로 세척하였다. 수득한 상기 심장 중에서 웨스턴 블럿 시험을 위해 각 그룹에서 3 개를 무작위로 선별하였고, 남은 것은 면역조직화학 실험에 사용하였다. 웨스턴 블럿 시험을 위해서, MI 부위를 결찰 부위로부터 잘라내어 액체 질소로 급속 냉동하였다; 면역조직화학 실험을 위해서, 심장의 좌심실(left ventricles)을 날카로운 칼로 모두 잘라내어 24 시간 동안 10 % 포르말린 용액에서 고정한 후, 그룹 이름을 각각 기재하였다.

2. 웨스턴 블럿 시험

2.1 웨스턴 블럿 시험에 필요한 시약

1) 단백질 용해 버퍼(Protein lysis buffer)

50 mmol/L 트리스-염산(Tris-HCl)(pH 8.0), 150 mmol/L NaCl, 0.025% NaN₃, 0.1 % SDS, 100 ㎍/㎖ PMSF, 1 ㎍/㎖ 아프로티닌(Aprotinin), 0.5 % 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate) 및 0.1 % NP-40.

2) A 용액[30% 아크릴아미드(acrylamide) 저장 용액]은 아크릴아미드 29.0 g, N-메틸렌비스아크릴아미드(N-methylenebisacrylamide) 1 g을 물(H₂O)에 넣어 100 ㎖로 맞추었다. 용액은 갈색 병에 감아 빛으로부터 차단하여 보관하였으며, pH는 7.0 미만이 되도록 조절하였다.

B 용액[스페이서(spacer) 겔 버퍼]는 6 g의 트리스를 40 ㎖의 물에 녹여 제조한 1 mol/ℓ 트리스 용액 48 ㎖을 사용하여 pH를 6.8로 맞추기 위해 물로 100 ㎖로 맞추어 희석하였다. 이것은 pH 6.8인 0.5 mol/ℓ 트리스-염산 버퍼용액이며, 여과하여 4℃에 보관하였다.

C 용액(분리 겔 버퍼)는 36.6 g의 트리스를 48 ㎖의 1 mol/ℓ HCl과 혼합한 다음, 용액이 100 ㎖이 되도록 물로 채워 희석하였다. 이것은 pH 8.8인 3 mol/ℓ 트리스-염산 버퍼이며, 여과한 다음, 4℃에서 보관하였다.

D 용액(진기영동 버퍼 저장 용액)은 트리스 30.3 g, 글리신(glycine) 114 g 및 SDS 10 g을 물에 녹여 100 ㎖을 맞추었다. 이는 글리신 전기영동 버퍼 저장 용액으로, 사용하기 전에 10 배 희석하였다.

E 용액은 1 g의 SDS를 10 ㎖ 물에 녹였다. 이는 10 % SDS 용액이다.

F 용액은 10 % 암모늄 퍼설페이트(ammonium persulfate) 용액으로, 사용하기 일 주일 내에 준비하였다.

G 용액은 테트라메틸 에틸렌디아민(Tetramethyl ethylenedia분e) 용액이다.

H 용액(시료 버퍼)는 B 용액 8 ㎖, 글리세린(glycerine) 6.4 ㎖, 용액 E 12.8 ㎖, 2-머캅토에탄올(2-Mercaptoethanol) 3.2 ㎖, 0.05% 브로모페놀 블루(bromophenol blue) 용액 1.6 ㎖ 및 증류수 32 ㎖으로 제조하였으며, 균일하게 섞어서 혼합하였다.

I 용액(10 % SDS-PAGE 분리 겔)은 30 % 아크릴아미드 저장 용액 6.65 ㎖, 분리 겔 버퍼 5 ㎖, 탈이온수(deionized water) 8.25 ㎖, 10% 암모늄 퍼설페이트 용액 150 ㎕ 및 20 ㎕ 테트라메틸 에틸렌디아민 용액을 혼합하였다. 전체 부피는 20 ㎖로 고르게 맞추며, 즉시 사용하였다.

J 용액(5 % 스페이서 겔)은 아크릴아미드 저장 용액 2.1 ㎖, 스페이서 겔 버퍼 3.76 ㎖, 탈이온수(deionized water) 9 ㎖, 10% 암모늄 퍼설페이트 용액 45 ㎕ 및 15 ㎕ 테트라메틸 에틸렌디아민 용액을 혼합하였다. 전체 부피는 15 ㎖로 고르게 맞추며, 즉시 사용하였다.

3) 니트로셀룰로오즈 막(Nitrocellulose membrane) 0.45 ㎛은 밀리포어(Millipore Co. Ltd, 미국)에서 구입하였다.

4) 이동 버퍼는 트리스 염기 3 g, SDS 1 g 및 글리신 14.4 g을 200 ㎖ 메탄올에 녹인 다음, 물로 1 ℓ가 되도록 채웠다.

5) 코마시에 브릴리언트 블루 G250(Coomassie brilliant blue G250 solution)(염색 고정 용액)은 코마시에 브릴리언트 블루 G250 1.25 g을 메탄올 230 ㎖, 증류수 230 ㎖ 및 빙초산(glacial acetic acid) 40 ㎖을 혼합하여 제조하였다.

6) 탈염색 용액(Destaining solution)은 230 ㎖ 메탄올, 230 ㎖ 증류수 및 40 ㎖ 빙초산을 혼합하여 제조하였다.

7) 차단 버퍼(Blocking buffer)는 5 % 건조 스킴 밀크(dry skim milk), 0.01 % 소포제(antifoa분g agent) 및 0.025 % NaH₃을 TBS-T 버퍼에 녹여 제조하였다.

8) 5×TBS 버퍼는 트리스 염기 12.1 g 및 NaCl 40 g을 이차 증류수에 넣어 녹이고, HCl을 첨가하여 pH를 7.6으로 조절한 다음, 이차 증류수로 1 ℓ를 채워 희석하였다.

9) TBS-T 용액은 0.1 % 트윈-20dmf 포함하는 TBS 용액이다.

10) 단백질 마커는 MBI(미국)에서 구입하였다.

11) 전개 용액 및 고정 용액은 중국 럭키 그룹 회사(China Lucky Group Corporation)에서 구입하였다.

2.2 웨스턴 블럿 시험 과정

2.2.1 조직 단백질 추출 및 측정

액체 질소에서 조직을 꺼내어, 미리 식혀 놓은(precooling) 모르타르(mortar)에 놓고 액체 질소를 넣어서 빠르게 간(grinding) 다음, 미리 식혀 놓은 EP 튜브에 파우더를 넣고 단백질 용해 용액 50 ㎕을 각각의 튜브에 첨가하여 20 분간 얼려, 10000 r/분으로 4℃에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 얻어 미리 식혀놓은 EP 튜브로 옮겨, 침전체는 제거하였다. 브레드포드 방법(Bradford method)으로 단백질을 측정한 후에, 동일한 부피의 2×SDS 시료 버퍼를 남은 단백질에 첨가한 다음, 5 분간 물에서 가열하였다.

2.2.2 겔 및 시료 준비

10 % SDS-PAGE 분리 겔 용액을 준비하고, 균일하게 섞은 후 유리 판(glass plate)에 주입하여 수직으로 놓고 판을 기울여 분리된 물을 제거한 다음, 겔 위에 남아있는 물은 흡수지(absorbent paper)로 빨아들여 제거하였다; 콤보(comb)를 끼우고 천천히 5 % 스페이서 겔을 첨가하여 실온에서 방치하였다. 겔이 완전히 굳으면, 바닥면의 테두리를 제거하고, 굳은 겔을 포함하는 잘-준비된 유리판을 전기영동기(eletrophorator)에 놓았다. 전기영동 버퍼를 첨가하여 겔이 완전히 버퍼에 잠길 수 있게 한 후에 콤보를 조심스럽게 제거하고, 시료를 넣을 구멍(holes)을 전기영동 버퍼로 여러 번 세척하였다; 전체 단백질 40 ㎍인 시료 및 단백질 분자량 마커를 5×시료 버퍼와 1:4 비율로 혼합하거나 1×시료 버퍼와 동일한 시료의 부피로 맞추어 혼합하였고 단백질을 변성시키기 위해 물에서 5 분간 끓였다; 공지된 순서에 따라 첨가된 스페이서 겔의 구멍에 잘 처리된 시료를 주입하였다.

2.2.2 전기영동

초기 전압 80 V에서 전원을 넣고, 브로모페놀 블루가 분리 겔로 들어간 후 전압을 100 V로 상승시켜 브로모페놀 블루가 분리 겔을 빠져나갈 때 까지 전개하였다.

2.2.4 전기이동(Electrotransfer) 및 막 차단

겔의 크기에 맞게 1 개의 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride; PDVF) 막 및 필터 시트(filter sheets) 6 개를 잘라서, 필터 시트를 이동 버퍼에 15 분 동안 적신 다음, 90 분 동안 지속적 전류를 30 ㎃로 반건조 전기이동하여 단백질을 이동하였다. PDVF 막을 막의 방향에 맞게 하여 5 % TBS-T 스킴 밀크로 막을 차단한 다음, 실온에서 60 분간 흔들어주었다.

2.2.5 항원 및 항체의 반응 및 영상화(image fixation)

차단이 끝나면, 막은 TBS-T로 10 분 동안 3 번 세척하여 혼성 가방(hybridization bag)에 막을 놓고 커넥신 43 및 포스포커넥신 43 항체 모두를 버퍼 r로 희석하여(1:2000), 가방을 잠구어 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다; 막을 TBS-T 버퍼로 10 분 동안 3 번 세척한 다음, 다른 혼성 가방에 막을 넣어 HRP-라벨된 커넥신 43 및 포스포커넥신 43(1:2000) 이차 항체를 첨가하여 60 분 동안 흔들어 주고, TBS-T 버퍼로 10 분 동안 3 번 세척하였다. PVDF 막을 ECL 믹스에 넣어서 실온에서 5 분간 흔들면서 배양하고, 적어도 0.125 ㎖/㎝²의 ECL 믹스로 전체 막을 덮어준 후에, 집게로 막을 고정하고 흡습지와 수직으로 맞추어 남은 물을 흡수하여 제거한 다음, 사이에 기포가 들어가지 않도록 하면서 두 개의 필름 사이에 막을 넣었다. 단백질이 포함된 막의 면이 위로 오도록 하여, x-레이 박스에 넣고, x-레이 감광 필름을 놓은 다음, 수 분간 빛을 조사하였다. 선명한 영상이 보일 때 까지 전개 용매를 노출된 필름에 넣어주고, 잠시 동안 필름을 물에 옮긴 다음에, 고정 버퍼에 필름을 넣었다. 필름을 다시 세척하여, 말리고 스캔하였고, 전기영동 밴드의 회색 정도를 분석하였다. 실험은 3 회 반복하였다.

3. 면역조직화학 검사 및 HE 염색

3.1 면역조직화학 검사에 필요한 시약

1) pH 7.2 0.01 PBS 버퍼

A 용액은 0.2 mol/ℓ NaH₂PO₄ 및 NaH₂PO₄·H₂O 27.6 g를 이차증류수(double-distilled H₂O)에 녹인 후 1000 ㎖으로 희석하여 채웠다.

B 용액은 0.2 mol/ℓ NaH₂PO₄ 및 NaH₂PO₄·7H₂O 53.6 g(또는 NaH₂PO₄·7H₂O 71.6 g 또는 NaH₂PO₄·2H₂O 35.6 g)을 이차증류수에 녹였다. 용액은 1000 ㎖으로 희석하여 채웠다.

두 용액을 사용하여, A 용액 28 ㎖, B 용액 72 ㎖ 및 NaCl 118 g을 1900 ㎖의 물에 첨가하였다.

2) pH 6.0의 0.02 mol/ℓ 항원 회수 용액(Antigen retrieval solution)

A 용액은 0.1 M 시트레이트(citrate) 용액으로, 이차증류수에 C₆H₈0·7H₂O 21.01 g을 녹인 다음, 1000 ㎖으로 희석하여 채웠다.

B 용액은 0.1 M 시트르산 나트륨(sodium citrate) 용액으로, C₆H₅O₇ _·3H₂O 29.41 g를 이차 증류수에 녹인 다음, 1000 ㎖으로 희석하여 채웠다.

두 용액을 사용하여, A 용액 18 ㎖, B 용액 82 ㎖을 혼합한 다음, 1000 ㎖으로 희석하여 채웠다.

0.01 % 트리톤-100(Triton-100)은 100 % 트리톤-100으로 준비하였다.

3 % H₂O₂-CH₃OH 용액은 30 % H₂O₂ 및 80 % 메탄올 용액을 1:9 비율로 혼합하여 제조하였다.

5) 마운팅 액(Mounting media)는 천연 발삼(neutral balsam)을 사용하였다.

4. 데이터 분석

데이터는 SPSS 16.0. 소프트웨어에서 카이제곱 검정(Chi-square) 또는 순위 시험(rank test)으로 분석하고, 아노바(ANOVA)를 실시하였다. P<0.05를 통계학적 유의 수준으로 계산하였다.

5. 결과

5.1 웨스턴 블럿(Western Blot) 검사 결과

5.1.1 커넥신 43(connexin 43) 결과

커넥신 43의 그레이 값(gray degree)(X±SD)

그룹	n	커넥신 43 그레이 값	F 값	P-값
대조군	3	0.8629±0.02288	13.49	0.0001
가장 수술군	3	0.9484±0.10929
모델	3	0.2453±0.11019**
메토프롤롤	3	0.5443±0.15226**△△
삼송양심 캡슐	3	0.5581±0.18178**△△
대량 투여군	3	0.3728±0.03228**
적정량 투여군	3	0.6057±0.08018*△△
소량 투여군	3	0.5063±0.08884**△

대조군과 비교하여, *P<0.05，** P<0.01；모델군과 비교하여, △P<0.05，△△P<0.01；메토프롤롤군과 비교하여, ▲P<0.05，▲▲P<0.01；삼송양심 캡슐군과 비교하여, ★P<0.05，★★P<0.01.

결과는 대조군과 비교하여, 커넥신 43 단백질은 모델군 및 모든 처리군에서 유의적으로 감소하였고(p<0.05); 모델 그룹과 비교하여, 커넥신 43 단백질은 대량 투여군을 제외한 모든 처리군에서 유의적으로 증가하였고(p<0.05); 메토프롤롤 그룹과 비교하여, 커넥신 43 단백질은 삼송양심 캡슐군, 대량 투여군, 적정량 투여군, 또는 소량 투여군에서 유의적인 차이를 보였다. 그러나, 추출물의 양이 증가할수록, 커넥신 43 단백질이 증가하는 경향이 존재하였고, 이는 메토프롤롤군을 능가하는 경향을 보였다.

5.1.2 포스포-커넥신 43(phosphor-connexin 43)의 결과

포스포-커넥신 43의 그레이 값(X±SD)

그룹	n	커넥신 43 그레이 값	F 값	P-값
대조군	3	0.9443±0.05676	4.760	0.005
가장 수술군	3	1.0727±0.19626
모델	3	0.2268±0.08750**
메토프롤롤	3	0.6830±0.26236△
삼송양심 캡슐	3	0.5906±0.21438
대량 투여군	3	0.4901±0.22870*
적당량 투여군	3	0.8253±0.29672△△
소량 투여군	3	0.4900±0.27663*

대조군과 비교하여, *P<0.05，** P<0.01；모델군과 비교하여, △P<0.05，△△P<0.01; 메토프롤롤군과 비교하여, ▲P<0.05，▲▲P<0.01；삼송양심 캡슐군과 비교하여, ★P<0.05，★★P<0.01.

결과는 대조군과 비교하여, 포스포-커넥신 43 단백질은 모델군에서 유의적으로 감소하였고(p<0.05); 대량 투여군의 단백질은 감소하였으나, 이는 유의미하지 않았고(p<0.05); 나머지 처리군의 단백질은 유적으로 감소하였다(p<0.05). 결과는 또한 모델군과 비교하여, 단백질이 메토프롤롤군 및 적당량 투여군에서 증가하였고(p<0.05), 나머지 처리군의 단백질은 무의미하게 증가하였다(p<0.05). 결과는 또한 모든 처리군에서 단백질이 메토프롤롤군의 결과에 대해 유의적인 차이가 없음을 제시하고 있으나(p>0.05), 적당량 투여군은 메토프롤롤군을 능가하는 경향을 보였다.

5.2 면역조직화학적(immunohistochemical) 검사 결과

5.2.1 커넥신 43의 면역조직화학적 발현 결과

커넥신 43 및 IOD의 발현 범위(area)(X±SD)

그룹	n	범위	IOD
대조군	10	53739.9200±8211.98879	15104.1623±2601.2000
가장수술	9	32946.6667±7080.3686**	8681.2899±2098.95456**
모델	10	1470.2400±974.92195**	361.9282±249.38330**
메토프롤롤	10	17723.1800±6671.83472**△△	4535.0243±1742.67121**△△
삼송양심 캡슐	10	17498.6800±6437.29864**△△	4597.4566±1818.08202**△△
대량 투여군	10	16758.6600±3415.47214**△△	4280.7530±947.73916**△△
적당량 투여군	10	33285.5667±9406.21647**△△▲▲★★	9218.6902±2839.33530**△△▲▲★★
소량 투여군	9	16548.7556±7990.49798**△△	6391.4570±4668.13667**△△
웰치(Welch)		115.04	97.204
P		<.0001	<.0001

결과는 대조군과 비교하여, 커넥신 43의 발현 범위 및 IOD 값이 다른 군에서 감소하였고(p<0.01), 특히 모델군에서 커넥신 43의 발현이 가장 많이 감소하였다. 결과는 또한 모델군과 비교하여, 모든 처리군에서, 특히 적당량 투여군에서 커넥신 43의 발현이 증가하였다(p<0.01). 결과는 또한 메토프롤롤군과 비교하여, 상기 커넥신 43의 발현이 적당량 투여군에서 상당히 증가하였고(p<0.01), 나머지 실험군에서는 유의적인 차이가 발견되지 않았다(p>0.05). 결과는 또한 삼송양심 캡슐군과 비교하여, 커넥신 43의 발현이 적당량 투여군에서 유의적으로 증가하였고(p<0.01), 대량 투여군, 소량 투여군, 및 삼송양심 캡슐군에서 유의적인 차이(p>0.05)가 존재하였다.

5.2.2 포스포-커넥신 43의 면역조직화학적 발현 결과

포스포-커넥신 43 및 IOD의 발현 범위(X±SD)

그룹	n	범위	IOD
대조군	10	33936.3200±12892.12362	6954.9538±2888.33033
가장수술	9	27656.3333±6366.42470*	6650.7868±976.93702
모델	10	1727.720±700.66938**	345.3192±174.94916**
메토프롤롤	10	13283.8000±8070.47849**△△	2686.5321±1724.68155**△△
삼송양심 캡슐	10	8549.600±3136.84524**△	1652.4931±726.52637**
대량 투여군	10	12076.380±5462.37090**△△	2292.0587±914.03147**△△
적당량 투여군	10	12503.1133±4809.51552**△△	2791.7334±1631.29058**△△
소량 투여군	9	8296.4222±1663.44896**△	2078.0578±907.32972**△
웰치		52.947	64.675
P		<.0001	<.0001

대조군과 비교하여, *P<0.05，** P<0.01；모델관과 비교하여, △P<0.05，△△P<0.01; 메토프롤롤군과 비교하여, ▲P<0.05，▲▲P<0.01；삼송양심 캡슐군과 비교하여, ★P<0.05，★★P<0.01.

결과는 대조군과 비교하여, 포스포-커넥신 43의 발현 범위 및 IOD 값은 다른 군에서, 특히 모델군에서 유의적으로 감소하였다(p<0.01). 결과는 또한, 모델군과 비교하여, 포스포-커넥신 43의 발현 범위의 증가가 삼송양심 캡슐군에서 유의미하지 않았고(p>0.05), 다른 실험군에서, 특히 적당량 투여군에서는 유의미하였다(p<0.05). 결과는 또한 메토프롤롤군의 발현 범위는 대량, 적당량, 및 소량 투여군의 발현 범위와 유의적으로 다르지 않았다(p>0.05).

6. 토의

본 연구는 단백질의 양을 측정하기 위하여 웨스턴 블럿 검사를 이용하였다. 그 결과는 CX43-s368(Ps368-CX43)의 발현 수준을 제시하였다. 대조군 및 가장 수술군과 비교하여, 모든 처리군에서 유의적으로 증가한 것과 달리 모델군에서는 유의적으로 감소하였다. 유사하게, 면역조직화학적 검사의 결과는 대조군과 비교하여, Ps368-CX43 및 IOD 값의 발현 범위가 모든 처리군에서 다양하게 증가한 것과 달리 모델군에서 유의적으로 감소하였다. 모델군에서, 페리페랄라이제이션(peripheralization)이 Ps368-CX43의 발현에서 확인되었다. 그러나, 페리페랄라이제이션은 모든 처리군에서 증가하였다. 추출물은 심근(myocardium)에서 CX43 인산화(phophorylation)를 증가, 세포 간 투과성(permeability)을 감소, 세포 사이 유해 물질의 흐름을 감소, CX43의 비균질 분배(inhomogeneous distribution), 더 나은 전자 커플링(electron coupling)을 개선, ML 지역을 감소, 국소 빈혈(ischemia)의 교정(correct), 및 부정맥(arrhythmia) 발생(incidence)의 감소를 가능하도록 하였다.

종합하면, 본 발명은 상기 추출물이 ML 지역을 감소시키고 심근의 국소 빈혈을 교정할 수 있음을 면밀히 검토하였다. 본 발명에 기재된 추출물은 심근에서 Na⁺-K⁺-ATPase 및 Ca² ⁺-ATPase의 활성을 향상시키고, Na⁺-Ca² ⁺ 교환을 증가시키고, 칼슘 과부하(overload)를 감소시키고, 피해로부터 심근 국소 빈혈을 보호하고, 탈분극(depolarization) 후 발생 지연을 감소시키고, 부정맥 발생을 감소시킬 수 있다. 추출물은 또한 국소 빈혈 이후 심근에서, CX43 페리페랄라이제이션을 감소시키기 위해서, 세포 간 투과성을 감소시키기 위해서, 유해 물질의 흐름을 줄이기 위해서, CX43 및 P-CX43 S368의 비균질 분배, 더 나은 전자 커플링을 개선하기 위해서, 국소 빈혈을 교정하기 위해서, 그리고 부정맥 발생을 감소시키기 위해서, CX43 및 P-CX43 S368의 단백질 수준을 증가시킬 수 있다.

구체적인 실시예

실시예 1:

현호색 미가공(crude) 분말 100 g은, 70% 에탄올 800 ml로 2 번 추출하고, 상기 추출물을 여과하여 혼합하며, 감압하여 상대 밀도 0.3 g/mL의 유동엑스로 농축하고; D101 수지를 처리하고, 준비된 유동엑스는 수지 컬럼에, 유속 0.4 mL/분으로, 유속 0.4 mL/분의 탈염수로 불순물을 제거하고, 8 배 부피의 80% 에탄올 용출을, 유속 0.6 mL/분으로 로딩(loading)하고, 현호색 추출물 건조 페이스트로 농축하였다.

실시예 2:

현호색 미가공(crude) 분말 100 g은, 70% 에탄올 700 ml로 3 번 추출하고, 상기 추출물을 여과하여 혼합하며, 감압하여 상대 밀도 0.5 g/mL의 유동엑스로 농축하고; D101 수지를 처리하고, 준비된 유동엑스는 수지 컬럼에, 유속 0.2 mL/분으로, 유속 0.4 mL/분의 탈염수로 불순물을 제거하고,, 60% 에탄올 용출을, 유속 0.8 mL/분으로 로딩하고, 현호색 추출물 건조 페이스트로 농축하였다.

실시예 3:

현호색 미가공(crude) 분말 100 g은, 70% 에탄올 800 ml로 2 번 추출하고, 상기 추출물을 여과하여 혼합하며, 감압하여 상대 밀도 0.3 g/mL의 유동엑스로 농축하고; D101 수지를 처리하고, 1:7 직경 및 길이의 비율로, 그리고 유동엑스의 샘플 용액은 침전물을 용해시키기 위하여 pH 2로 조정하고, 준비된 유동엑스는 수지 컬럼에, 유속 0.4 mL/분의 탈염수로 불순물을 제거하고, 유속 0.4 mL/분으로, 8 배 부피의 80% 에탄올 용출을, 유속 0.6 mL/분으로 로딩하고, 에탄올을 회복시키고, 현호색 추출물 건조 페이스트로 농축하였다. 종래 부속품을 첨가하는 일반적인 방법에 따라, 현호색 건조 페이스트는 점적액(dripping pills)으로 제조되었다.

실시예 4:

현호색 미가공(crude) 분말 100 g은, 70% 에탄올 700 ml로 3 번 추출하고, 상기 추출물을 여과하여 혼합하며, 감압하여 상대 밀도 0.5 g/mL의 유동엑스로 농축하였고; D101 수지를 처리하고, 1:8 직경 및 길이의 비율로, 그리고 유동엑스의 샘플 용액은 침전물을 용해시키기 위하여 pH1.5로 조정하고, 준비된 유동엑스는 수지 컬럼에, 유속 0.2 mL/분의 탈염수로 불순물을 제거하고, 유속 0.5 mL/분으로, 60% 에탄올 용출을, 유속 0.8 mL/분으로 로딩하고, 현호색 추출물 건조 페이스트로 농축하였다. 종래 부속품을 첨가하는 일반적인 방법에 따라, 현호색 건조 페이스트는 캡슐로 제조되었다.

실시예 5:

현호색 미가공(crude) 분말 100 g은, 70% 에탄올 800 ml로 2 번 추출하고, 상기 추출물을 여과하여 혼합하며, 감압하여 상대 밀도 0.3 g/mL의 유동엑스로 농축하고; D101 수지를 처리하고, 준비된 유동엑스는 수지 컬럼에, 유속 0.4 mL/분으로, 유속 0.4 mL/분의 탈염수로 불순물을 제거하고, 8 배 부피의 80% 에탄올 용출을, 유속 0.6 mL/분으로 로딩하고, 그리고 에탄올을 회복시키고, 현호색 추출물 건조 페이스트로 농축하였다. 종래 부속품을 첨가하는 일반적인 방법에 따라, 현호색 건조 페이스트는 정제(tablets)로 제조되었다.

실시예 6:

현호색 미가공(crude) 분말 100 g은, 70% 에탄올 700 ml로 3 번 추출하고, 상기 추출물을 여과하여 혼합하며, 감압하여 상대 밀도 0.5 g/mL의 유동엑스로 농축하고; D101 수지를 처리하고, 준비된 유동엑스는 수지 컬럼에, 유속 0.2 mL/분으로, 유속 0.5 mL/분의 탈염수로 불순물을 제거하고, 60% 에탄올 용출을, 유속 0.8 mL/분으로 로딩하고, 현호색 추출물 건조 페이스트로 농축하였다. 종래 부속품을 첨가하는 일반적인 방법에 따라, 현호색 건조 페이스트는 경구용 액제(oral liquid preparation)로 제조되었다.

실시예 7:

현호색 미가공(crude) 분말 100 g은, 70% 에탄올 800 ml로 2 번 추출하고, 상기 추출물을 여과하여 혼합하며, 감압하여 상대 밀도 0.3 g/mL의 유동엑스로 농축하고; D101 수지를 처리하고, 1:7 직경 및 길이의 비율로, 그리고 유동엑스의 샘플 용액은 침전물을 용해시키기 위하여 pH 2로 조정하고, 준비된 유동엑스는 수지 컬럼에, 유속 0.4 mL/분의 탈염수로 불순물을 제거하고, 유속 0.4 mL/분으로, 8 배 부피의 80% 에탄올 용출을, 유속 0.6 mL/분으로 로딩하고, 에탄올을 회복시키고, 현호색 추출물 건조 페이스트로 농축하였다. 종래 부속품을 첨가하는 일반적인 방법에 따라, 현호색 건조 페이스트는 과립(granule)으로 제조되었다.

실시예 8:

현호색 미가공(crude) 분말 100 g은, 70% 에탄올 700 ml로 3 번 추출하고, 상기 추출물을 여과하여 혼합하며, 감압하여 상대 밀도 0.5 g/mL의 유동엑스로 농축하고; D101 수지를 처리하고, 1:8 직경 및 길이의 비율로, 그리고 유동엑스의 샘플 용액은 침전물을 용해시키기 위하여 pH1.5로 조정하고, 준비된 유동엑스는 수지 컬럼에, 유속 0.2 mL/분의 탈염수로 불순물을 제거하고, 유속 0.5 mL/분으로, 60% 에탄올 용출을, 유속 0.8 mL/분으로 로딩하고, 현호색 추출물 건조 페이스트로 농축하였다. 종래 부속품을 첨가하는 일반적인 방법에 따라, 현호색 건조 페이스트는 주사액(injection)으로 제조되었다.

Claims

하기의 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 항-빈맥성(anti-tachyarrhythmia) 부정맥을 위한 현호색(Rhizoma Corydalis) 추출물:
1) 미가공의 현호색 가루 100 중량부를 60 내지 80% 에탄올 600 내지 1000 부피부로 1 내지 3회 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 추출물을 여과하여 혼합하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 혼합물을 0.2 내지 0.5 g/mL의 상대밀도의 유동엑스(fluidextract)로 감압하여 농축하는 단계;
4) 가공된 101 수지(resin)를 취하고, 상기 단계 3)의 유동엑스를 0.2 내지 0.5 mL/분의 유속으로 제조하고, 탈염수(deionized water) 0.2 내지 0.5 mL/분의 유속으로 불순물(impurity)을 제거하는 단계;
5) 상기 단계 4)의 유동엑스를 0.4 내지 0.8 mL/분의 유속으로 60 내지 90%의 에탄올로 용출하는 단계;
6) 상기 단계 5)의 용출물을 현호색 추출 건조 페이스트(dry paste)로 제조하기 위해 농축하는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 현호색 추출물은 하기의 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 현호색 추출물:
1) 미가공의 현호색 가루 100 중량부를 70% 에탄올 800 부피부로 2회 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 추출물을 여과하여 혼합하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 혼합물을 0.3 g/mL의 상대밀도의 유동엑스로 감압하여 농축하는 단계;
4) 가공된 101 수지를 취하고, 상기 단계 3)의 유동엑스를 0.4 mL/분의 유속으로 제조하고, 탈염수 0.4 mL/분의 유속으로 불순물을 제거하는 단계;
5) 상기 단계 4)의 유동엑스를 0.6 mL/분의 유속으로 80%의 에탄올 8배 부피로 용출하는 단계;
6) 상기 단계 5)의 용출물을 현호색 추출 건조 페이스트로 제조하기 위해 농축하는 단계.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 D101 거대 다공성 수지(macroporous resin)의 직경 및 높이의 비율은 1 : 4 내지 8인 것을 특징으로 하는 현호색 추출물.
제 3항에 있어서, 상기 D101 거대 다공성 수지의 직경 및 높이의 비율은 1 : 7인 것을 특징으로 하는 현호색 추출물.
제 1항, 제 2항 또는 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 거대 다공성 수지 유동엑스의 샘플 용액(sample solution)은 pH 1 내지 2인 것을 특징으로 하는 현호색 추출물.
제 3항에 있어서, 상기 거대 다공성 수지 유동엑스의 샘플용액은 pH 1 내지 2인 것을 특징으로 하는 현호색 추출물.
제 5항에 있어서, 상기 거대 다공성 수지 유동액스의 샘플용액은 pH 1.5인 것을 특징으로 하는 현호색 추출물.
제 6항에 있어서, 상기 거대 다공성 수지 유동엑스의 샘플 용액은 pH 1.5인 것을 특징으로 하는 현호색 추출물.
제 1항, 제 2항, 제 4항, 제 6항, 제 7항 또는 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종래 부속품(conventional accessories)을 추가하는 일반적인 방법에 따라 추출물은 임상적으로 허용가능한(clinically acceptable) 알약(pills), 캡슐(capsules), 과립제(granules), 정제(tablets), 경구액(oral liquid) 또는 주사액(injection)으로 제조되는 것을 특징으로 하는 현호색 추출물.
제 3항에 있어서, 상기 종래 부속품을 추가하는 일반적인 방법에 따라 추출물은 임상적으로 허용가능한 알약, 캡슐, 과립제, 정제, 경구액 또는 주사액으로 제조되는 것을 특징으로 하는 현호색 추출물.
제 5항에 있어서, 상기 종래 부속품을 추가하는 일반적인 방법에 따라 추출물은 임상적으로 허용가능한 알약, 캡슐, 과립제, 정제, 경구액 또는 주사액으로 제조되는 것을 특징으로 하는 현호색 추출물.
하기의 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 항-빈맥성 부정맥을 위한 현호색 추출물의 제조방법:
1) 미가공의 현호색 가루 100 중량부를 60 내지 80% 에탄올 600 내지 1000 부피부로 1 내지 3회 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 추출물을 여과하여 혼합하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 혼합물을 0.2 내지 0.5 g/mL의 상대밀도의 유동엑스로 감압하여 농축하는 단계;
4) 가공된 101 수지를 취하고, 상기 단계 3)의 유동엑스를 0.2 내지 0.5 mL/분의 유속으로 제조하고, 탈염수 0.2 내지 0.5 mL/분의 유속으로 불순물을 제거하는 단계;
5) 상기 단계 4)의 유동엑스를 0.4 내지 0.8 mL/분의 유속으로 60 내지 90%의 에탄올로 용출하는 단계;
6) 상기 단계 5)의 용출물을 현호색 추출 건조 페이스트로 제조하기 위해 농축하는 단계.
제 12항에 있어서, 상기 현호색 추출물의 제조방법은 하기의 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 현호색 추출물의 제조방법:
1) 미가공의 현호색 가루 100 중량부를 70% 에탄올 800 부피부로 2회 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 추출물을 여과하여 혼합하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 혼합물을 0.3 g/mL의 상대밀도의 유동엑스로 감압하여 농축하는 단계;
4) 가공된 101 수지를 취하고, 상기 단계 3)의 유동엑스를 0.4 mL/분의 유속으로 제조하고, 탈염수 0.4 mL/분의 유속으로 불순물을 제거하는 단계;
5) 상기 단계 4)의 유동엑스를 0.6 mL/분의 유속으로 80%의 에탄올 8배 부피로 용출하는 단계;
6) 상기 단계 5)의 용출물을 현호색 추출 건조 페이스트로 제조하기 위해 농축하는 단계.
제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 D101 거대 다공성 수지의 직경 및 높이의 비율은 1 : 4 내지 8인 것을 특징으로 하는 현호색 추출물 제조방법.
제 14항에 있어서, 상기 D101 거대 다공성 수지의 직경 및 높이의 비율은 1 : 7인 것을 특징으로 하는 현호색 추출물 제조방법.
제 12항, 제 13항, 또는 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 거대 다공성 수지 유동엑스의 샘플용액은 pH 1 내지 2인 것을 특징으로 하는 현호색 추출물 제조방법.
제 14항에 있어서, 상기 거대 다공성 수지 유동엑스의 샘플용액은 pH 1 내지 2인 것을 특징으로 하는 현호색 추출물 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 거대 다공성 수지 유동엑스의 샘플용액은 pH 1.5인 것을 특징으로 하는 현호색 추출물 제조방법.
제 17항에 있어서, 상기 거대 다공성 수지 유동엑스의 샘플용액은 pH 1.5인 것을 특징으로 하는 현호색 추출물 제조방법.
제 12항, 제 13항, 제 15항, 제 17항, 제 18항 또는 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종래 부속품을 추가하는 일반적인 방법에 따라 추출물은 임상적으로 허용가능한 알약, 캡슐, 과립제, 정제, 경구액 또는 주사액으로 제조되는 것을 특징으로 하는 현호색 추출물 제조방법.
제 14항에 있어서, 상기 종래 부속품을 추가하는 일반적인 방법에 따라 추출물은 임상적으로 허용가능한 알약, 캡슐, 과립제, 정제, 경구액 또는 주사액으로 제조되는 것을 특징으로 하는 현호색 추출물 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 종래 부속품을 추가하는 일반적인 방법에 따라 추출물은 임상적으로 허용가능한 알약, 캡슐, 과립제, 정제, 경구액 또는 주사액으로 제조되는 것을 특징으로 하는 현호색 추출물 제조방법.
제 1 내지 2항, 제 4항, 제 6 내지 8항, 제 10 내지 11항 중 어느 한 항의 현호색 추출물을 함유하는 빈맥성 부정맥의 치료를 위한 약학적 조성물.