CN111413450B - 一种中药制剂含有黄芪药材的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有黄芪药材的中药制剂检测方法，其中色谱条件为：以乙腈为流动相A相,以0.2％磷酸水为流动相B相；其体积配比为流动相A相：流动相B相为：20‑75：80‑25，进行线性梯度洗脱；流速：1.0mL·min^‑1；柱温25℃，进样10μL，检测波长254nm；建立脑心通胶囊中君药黄芪黄酮类4种成分毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素含量标准，该检测方法具有快速，稳定、准确的特点。

Description

一种中药制剂含有黄芪药材的检测方法

技术领域

本发明涉及属于中医药领域，尤其涉及一种脑心通胶囊中黄芪药材的检测方法。

背景技术

脑心通制剂是是由黄芪、丹参、当归、川芎、赤芍、红花、乳香、没药、桑枝、桂枝、牛膝、桃仁、全蝎、地龙、水蛭16味中药加工制备而成的中药制剂。该中成药具有益气活血，化瘀通络的功效。临床用于气虚血滞、脉络瘀阻所致中风中经络，半身不遂、肢体麻木、口眼歪斜、舌强语謇及胸痹心痛、胸闷、心悸、气短；脑梗塞、冠心病心绞痛属上述证候。

脑心通制剂处方源出清代王清任经典名方补阳还五汤。基于“脑心同治”理念，方中重用黄芪为君药，大补元气，使元气充盛发挥，益气活血之效，通过补气使元气充盛达到气行则血行之功。臣药是虫类药水蛭、地龙、全蝎，取其药性善走，破血逐瘀，能搜剔络中之邪，发挥通经透络之功效。佐药当归、川芎、丹参、赤芍、红花等十味活血化瘀药，共助君臣药疏通瘀阻之力。桑枝、桂枝针对上肢半身不遂，可引药直达病所温经通脉；牛膝逐瘀血通经络，引血下行共为使药，诸药配伍，主次得当，标本兼治，益气活血，化瘀通络，既通脑络，又通心络，发挥脑心同治作用。

中药复方制剂由于其物质基础的复杂性，对其必须制定相应的质量标准，做好质量控制，才能保障其疗效和安全性。在2020年《中药注册管理专门规定》中强调了“质量控制的指标要关注与临床安全、有效性的关联”。脑心通胶囊现行国家标准为2017年国家药典委员会在2015版药典基础上的修订件(【批件号】ZGB2017-34)，该标准仅对脑心通胶囊中芍药苷、丹酚酸B含量进行控制，对于君药黄芪仅以显微鉴定和薄层色谱别定性，缺乏定量控制。如上所述，黄芪是脑心通制剂处方中的君药，且用量约为臣药(水蛭、地龙和全蝎)用量的总和，是处方的重中之重，应当将其含量测定纳入质量标准。然而现有技术中并无针对脑心通制剂中黄芪活性成分建立含量测定方法的报道，该领域亟待科研攻关和技术突破。

本发明申请主体，是步长制药全资设立高等院校，具有独立的中医药教学和科研中心，承担“脑心通胶囊、稳心颗粒”等步长大品种二次开发创新工作。针对如上所述的步长制药拳头产品脑心通胶囊中君药黄芪质量控制标准技术问题，本发明研究团队，通过黄芪药材多样本产区来源的质量筛选研究，建立有关黄芪药材质量优劣的检测方法，并在此基础上，对于中药大品种脑心通胶囊中君药黄芪，确定其在该中药制剂中的4种黄酮类成分的特征图谱，以此提升该制剂的质量可控性。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种脑心通胶囊中君药黄芪黄酮类成分的检测方法，该方法具有快速、准确、可控的特点。

本发明所述脑心通胶囊，均是指由陕西步长制药有限公司生产，其具体的处方配比组成及制备方法为：黄芪66份，赤芍27份，丹参27份，当归27份，川芎27份，桃仁27份，红花13份，醋乳香13份，醋没药13份，鸡血藤20份，牛膝27份，桂枝20份，桑枝27份，地龙27份，全蝎13份，水蛭27份；制备方法是：十六味药材，取地龙，全蝎，粉碎成细粉；其余黄芪等十四味粉碎成细粉，与地龙、全蝎粉末配研，过筛，混匀，装入胶囊，即得。

为了实现以上目的，本发明所采取的技术方案为：一种中药制剂含有黄芪药材的检测方法，该方法包括如下的步骤：

(a)供试品溶液的制备：取脑心通胶囊内容物，加入料液比为1:50～100的乙腈溶剂，进行超声提取30～60min，放置至室温，用乙腈补足损失重量，摇匀，过滤，续滤液即为供试品溶液；

(b)对照品标准液的制备：精密称重，毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品，加乙腈溶解，配制为混合对照品溶液；

(c)色谱条件：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为流动相A相,以0.2％磷酸水为流动相B相；其体积配比为流动相A相：流动相B相为：20-75：80-25，进行线性梯度洗脱；流速：1.0mL·min^-1；柱温25℃，进样10μL，检测波长254nm；

(d)色谱峰测定：将上述步骤(a)所制得的供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照上述步骤(c)的色谱条件，测定供试液溶液，得到脑心通胶囊中黄芪药材的特征峰，即得。

进一步来说，如上检测方法中，所述黄芪药材源自于甘肃陇西。

再进一步地，如上检测方法中，所述步骤(a)供试品溶液制备方法中，加入料液比1：80的乙腈溶剂，超声提取时间为45min。

进一步地，如上检测方法中，作为本发明的优选，所述步骤(b)对照品标准液的制备中，所述毛蕊异黄酮苷0.35mg/mL、芒柄花苷0.2mg/mL、毛蕊异黄酮0.1mg/mL、芒柄花素0.01mg/mL混合对照品溶液，即得。

再进一步地，如上检测方法中，作为本发明的优选，所述步骤(c)的色谱条件中，采用的线性梯度洗脱条件为：

0-10min，流动相A相所占的体积比为：20→40％，流动相B相所占的体积比为：80→60％；

10-20min，流动相A相所占的体积比为：40→60％，流动相B相所占的体积比为：60→40％；

20-30min，流动相A相所占的体积比为：60→75％，流动相B相所占的体积比为：40→25％；

30-45min，流动相A相所占的体积比为：75％，流动相B相所占的体积比为：25％。

本发明液相条件优化：

为了得到较高的离子响应和较好的色谱分离度，选择色谱流动相有机相时，分别考察了甲醇和乙腈，结果显示当乙腈作为有机相时，低波长区域基线漂移较小，说明乙腈相比甲醇在低波长区域干扰更小；选择流动相水相时，考察了纯水、甲酸、磷酸、磷酸缓冲溶液，结果显示磷酸作为流动相的改性剂可以显著提高分离效果，但加入过多的酸会使低波长区域基线明显增高，结果显示乙腈-0.2％磷酸水作为流动相时，分析效果和离子响应更好。

本发明样品处理方法的优化：

脑心通胶囊化学成分非常复杂，各成分极性差异较大，因此本实验分别考察了不同浓度的甲醇和乙醇对脑心通胶囊中提取效果，结果以100％乙腈为最佳，4个黄酮类成分基本都能有效提取；继而又对提取方式超声提取或回流提取予以对比考察，两种方式提取效果结果差异不明显，最终考虑效率，择定超声提取。同时又考察了不同的提取物料比(1：20、1：50、1：80、1：100)，不同的提取时间(30、45和60min)对提取效率的影响。最后确定，1g脑心通胶囊药粉，溶入到80mL的乙腈中，超声处理45min作为脑心通胶囊的样品前处理方法。

本发明有益效果：

1、本发明所建立的脑心通胶囊中君药黄芪的液相色谱检测方法，针对君药黄芪中黄酮类4种成分，如毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素，上述4种成分的特征峰分离度较好，能够准确的表征和控制该中成药种君药黄芪的有效含量，进而有效提升该中成药的质量控制标准。

2、本发明最终确定检测方法，通过多批次验证和方法评价验证，该检测方法具有精密度高、重复性好、稳定性稿等显著效果，能够有效的对于脑心通胶囊质量控制予以提升。

3、本发明所确立的复方制剂中黄芪质量测控方法，已经在该产品内部质量控制上予以产业化试应用，从各批次产品在节能减耗、专属性和均一性等方面，明显优于国家标准及现有实施的内控标准。

具体实施方式

为了更加充分理解本发明的实施，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。

除非另作定义，本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常释义。本发明专利申请说明书以及权利要求书中所述的“脑心通胶囊”均指的是由陕西步长制药有限公司生产，其处方配比和制备方法在以上的发明内容部分有确切的含义。

实施例1：本发明所建立的制剂中黄芪质量检测方法

1.1仪器与试药

美国WATERS超高效液相色谱，二极管阵列检测器、Empower 3色谱工作站；超声波清洗器KH3200E(昆山禾创超声仪器有限公司)，赛多利斯电子天平BS210S(赛多利斯科技有限公司)，Agilent XDB C₁₈柱，4.6mm×50mm，1.8μm。

乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)，磷酸(分析纯，北京化工厂)，色谱用水为自制超纯水；。毛蕊异黄酮苷对照品(批号:150326)、芒柄花苷对照品(批号:150507)、毛蕊异黄酮对照品(批号:151208)、芒柄花素对照品(批号:140601)。

脑心通胶囊(共10批，样品编号S1(批号180417)、样品编号S2(批号180418)、样品编号S3(批号180419)、样品编号S4(批号180420)、样品编号S5(批号180422)、样品编号S6(批号180423)、样品编号S7(批号180424)、样品编号S8(批号180425)、样品编号S9(批号180426)、样品编号S10(批号180427))由陕西步长制药有限公司提供(0.4g/粒)。

1.2供试品溶液的制备

取脑心通胶囊内容物，称取3g，加入料液比为1:80的乙腈溶剂240ml，进行超声提取45min，放置至室温，用乙腈补足损失重量，摇匀，过滤，续滤液即为供试品溶液；

1.3混合对照品标准液的制备

取毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素对照品适量，精密称重，加乙腈，制得毛蕊异黄酮苷0.35mg/mL、芒柄花苷0.2

mg/mL、毛蕊异黄酮0.1mg/mL、芒柄花素0.01mg/mL混合对照品溶液，即得。

1.4色谱及质谱条件

色谱条件：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为流动相A相,以0.2％磷酸水为流动相B相；流速：1.0mL·min^-1；柱温25℃，进样10μL，检测波长254nm；其体积配比为流动相A相：流动相B相为：20-75：80-25，进行线性梯度洗脱；采用的线性梯度洗脱条件为：

0-10min，流动相A相所占的体积比为：20→40％，流动相B相所占的体积比为：80→60％；

10-20min，流动相A相所占的体积比为：40→60％，流动相B相所占的体积比为：60→40％；

20-30min，流动相A相所占的体积比为：60→75％，流动相B相所占的体积比为：40→25％；

30-45min，流动相A相所占的体积比为：75％，流动相B相所占的体积比为：25％。

色谱峰测定：将上述步骤所制得的供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照上述步骤的色谱条件，测定供试液溶液，得到脑心通胶囊中4个成分的各自特征峰的保留时间，即得。

2方法学验证

2.1线性关系：

依次精密量取上述本发明的混合对照品溶液0.5、1、1.5、2、3、5、10μL，分别进样，测定峰面积。分别以各色谱峰面积积分值(Y)对其浓度(X)进行线性回归，结果见表1。

表1 4个指标性成分色谱峰面积及浓度的线性关系

2.2精密度试验：取脑心通胶囊(批号180426)的供试品溶液连续进样6次，测定各成分峰面积积分值，结果毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素RSD分别为1.22％、0.52％、0.36％、0.35％，表明该方法的精密度良好。

2.3稳定性试验：取如上所述的本发明供试品溶液，按上述色谱条件，在24h内每隔4h进样测定各成分峰面积积分值，结果毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素分别RSD为0.65％、0.37％、0.46％、0.45％、0.77％，表明本发明的供试品溶液在24h各成分稳定。

2.4重复性试验：取脑心通胶囊(批号180427)，平行取样6份，按照上述方法制备供试品溶液，测定计算各成分的含量，结果毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素平均值分别为0.552，0.223，0.024，0.003mg·g^-1，RSD分别为0.88％、0.54％、0.58％、0.47％，表明本检测方法重复性良好。

2.5回收率试验：精密称取已测知含量的脑心通胶囊样品(批号180426)内容物共6份，每份0.3g，分别精密加入分别含毛蕊异黄酮苷0.35mg/mL、芒柄花苷0.2mg/mL、毛蕊异黄酮0.1mg/mL、芒柄花素0.01mg/mL对照品溶液各1mL，按照本发明上述方法平行制备成供试溶液，进样测定，回收率结果见表2。

表2回收率试验结果(n＝6)

2.6样品测定 取10批脑心通胶囊样品，按照本发明上述的方法制备3份供试品溶液，进样10μL，记录峰面积，按外标法计算各批样品中各成分的含量平均值，结果见表3。

表3样品测定平均结果(mg·g^-1,n＝3)

最后应说明的是：本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，均在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种中药制剂含有黄芪药材的检测方法，其特征在于，所述的中药制剂为脑心通胶囊，是由黄芪、丹参、当归、川芎、赤芍、红花、乳香、没药、桑枝、桂枝、牛膝、桃仁、全蝎、地龙、水蛭、鸡血藤16味中药加工制备而成；所述的检测方法，包括如下的操作步骤：

(a)供试品溶液的制备：取脑心通胶囊内容物，加入料液比为1:80的乙腈溶剂，进行超声提取45min，放置至室温，用乙腈补足损失重量，摇匀，过滤，续滤液即为供试品溶液；

(b)对照品标准液的制备：精密称重，加乙腈溶解，配制毛蕊异黄酮苷0.35mg/mL、芒柄花苷0.2mg/mL、毛蕊异黄酮0.1mg/mL、芒柄花素0.01mg/mL，混合对照品溶液；

(c)色谱条件：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以乙腈为流动相A相,以0.2％磷酸水为流动相B相；流动相A相和B相采用线性梯度洗脱条件是，：0-10min，流动相A相所占的体积比为：20→40％，流动相B相所占的体积比为：80→60％；10-20min，流动相A相所占的体积比为：40→60％，流动相B相所占的体积比为：60→40％；20-30min，流动相A相所占的体积比为：60→75％，流动相B相所占的体积比为：40→25％；30-45min，流动相A相所占的体积比为：75％，流动相B相所占的体积比为：25％；流速：1.0mL·min-1；柱温25℃，进样10μL，检测波长254nm；

(d)色谱峰测定：将上述步骤(a)所制得的供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照上述步骤(c)的色谱条件，测定供试液溶液，得到脑心通胶囊中黄芪药材的特征峰，即得。