CN105241980B - 一种脑心通胶囊快速分离液相色谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脑心通胶囊快速分离液相色谱检测方法，其中色谱条件为：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以0.1％甲酸水为流动相A相，以乙腈为流动相B相；其体积配比为流动相A相：流动相B相为85‑10：15‑90，进行线性梯度洗脱；流速：0.20mL·min^‑1；柱温25℃，进样5μL；测定脑心通胶囊中没食子酸、丹参素、羟基红花黄色素A、绿原酸、苦杏仁苷、原儿茶醛、表儿茶素、咖啡酸、芍药内酯苷、芒柄花苷、芍药苷、芦丁、丹酚酸A、桂皮酸、芒柄花素、二氢丹参酮Ⅰ的含量，该检测方法具有快速，稳定、准确的特点。

Description

一种脑心通胶囊快速分离液相色谱检测方法

技术领域

本发明涉及属于中医药领域，尤其涉及一种脑心通胶囊快速分离液相色谱检测方法。

背景技术

脑心通胶囊由陕西步长制药有限公司独家生产，现执行质量标准2002年国家药品监督管理局汇编的《国家中成药标准汇编-中成药地方标准上升国家标准部分》的《内科-脑系》分册，标准号：WS-10001(ZD-0001)-2002)，具有益气活血，化瘀通络的功效。用于气虚血滞、脉络瘀阻所致中风中经络，半身不遂、肢体麻木、口眼歪斜、舌强语謇及胸痹心痛、胸闷、心悸、气短；脑梗塞、冠心病心绞痛属上述证候。由黄芪、丹参、当归、川芎、赤芍、红花、乳香(制)、没药(制)、桑枝、桂枝、牛膝、桃仁、全蝎、地龙、水蛭16味中药加工制成，中国专利文献CN103207255A公开了该组合物的质量控制方法，采用超高效液相色谱(UPLC)技术同时测定脑心通胶囊中羟基红花黄色素A，芍药苷，阿魏酸，丹酚酸B，藁本内酯5个主要化学成分，上述方法难以全面表征脑心通的物理化学特征。而且由于脑心通胶囊有良好的临床效果且市场销售前景广阔，而目前对该制剂的质量标准中仅对芍药苷含量进行控制，且脑心通胶囊中化学成分的复杂性，现有检测技术中存在分离难度大，分析时间长的诸多问题，这显然对控制脑心通胶囊内在质量是远远不够的。

近年来，快速分离液相色谱技术(RRLC)以其较好的分离效果和分离速度，在中药分析得到了普遍的应用；三重四级杆质谱(QQQ)因为能选择性监测母离子和子离子，从而分析混合物中的特定化合物，干扰因素少，精密度和准确度较高，特别适用于中药大复方的定量分析。因此，本实验拟采用RRLC-QQQ来定量分析脑心通胶囊中多个成分，根据文献报道及现有的标准品信息，选择16个化合物进行定量分析，分别为：没食子酸、丹参素、羟基红花黄素色A、绿原酸、苦杏仁苷、原儿茶醛、表儿茶素、咖啡酸、芍药内酯苷、芒柄花苷、芍药苷、丹酚酸A、桂皮素、芒柄花素和二氢丹参酮Ⅰ。为进一步提高该产品的质量标准提供参考依据，有力保证其内在质量的稳定性。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种脑心通胶囊快速分离液相色谱检测方法，该方法具有快速、准确，高分辨率的特点。

本发明所述脑心通胶囊，均是指由陕西步长制药有限公司生产，其具体的处方配比组成及制备方法为：黄芪66份，赤芍27份，丹参27份，当归27份，川芎27份，桃仁27份，红花13份，乳香(制)13份，没药(制)13份，鸡血藤20份，牛膝27份，桂枝20份，桑枝27份，地龙27份，全蝎13份，水蛭27份；制备方法是：十六味药材，取地龙，全蝎，粉碎成细粉；其余黄芪等十四味粉碎成细粉，与地龙、全蝎粉末配研，过筛，混匀，装入胶囊即得胶囊剂。

为了实现以上目的，本发明所采取的技术方案为：一种脑心通胶囊快速分离液相色谱检测方法，该方法包括如下的步骤：

(a)供试品溶液的制备：称取脑心通胶囊内容物，加入料液比为1:50～200的甲醇溶剂，进行超声提取时间为30～60min，放置至室温，用甲醇补足损失重量，摇匀，过滤，续滤液即为供试品溶液；

(b)对照品标准液的制备：精密称重，没食子酸、丹参素、羟基红花黄色素A、绿原酸、苦杏仁苷、原儿茶醛、表儿茶素、咖啡酸、芍药内酯苷、芒柄花苷、芍药苷、芦丁、丹酚酸A、桂皮酸、芒柄花素、二氢丹参酮Ⅰ对照品适量，加甲醇溶解，配制为混合对照品溶液；

(c)色谱条件：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以0.05～0.2％甲酸水为流动相A相，以乙腈为流动相B相；其体积配比为流动相A相：流动相B相为85-10：15-90，进行线性梯度洗脱；流速：0.20mL·min^-1；柱温25℃，进样5μL；

(d)质谱条件：三重四极杆质谱仪，电离离子源采用电喷雾离子源，检测模式为正负切换多重反应监测模式；质谱条件如下：碰撞气温度：300℃，N₂流速:12L/min，保护气流动：15psi，正负模式下毛细管温度均为4000V，驻留时间为200ms；

(e)色谱峰测定：将上述步骤(a)所制得的供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照上述步骤(c)的色谱条件和步骤(d)质谱条件，测定供试液溶液，得到脑心通胶囊中各自特征峰的保留时间，即得。

作为本发明的优选，所述步骤(a)供试品溶液制备方法中，加入料液比1：100的甲醇溶剂，超声提取时间为40min。

作为本发明的优选，所述步骤(b)对照品标准液的制备中，所述没食子酸浓度为80.55-10310.00ng/mL、丹参素浓度为25.73-3293.33ng/mL、羟基红花黄色素A浓度为93.36-11950.00ng/mL、绿原酸浓度为70.00-8960.00ng/mL、苦杏仁苷浓度为321.10-41100.00ng/mL、原儿茶醛浓度为11.21-1434.67ng/mL、表儿茶素浓度为49.27-6306.67ng/mL、咖啡酸浓度为6.00-767.50ng/mL、芍药内酯苷浓度为51.72-6620.00ng/mL、芒柄花苷浓度为6.13-784.00ng/mL、芍药苷浓度为393.08-50314.15ng/mL、芦丁浓度为12.14-776.67ng/mL、丹酚酸A浓度为38.59-4940.00ng/mL、桂皮酸浓度为7.94-1017.00ng/mL、芒柄花素浓度为13.07-1673.33ng/mL、二氢丹参酮Ⅰ浓度为39.45-5050.00ng/mL的混合对照品溶液，即得。

作为本发明的优选，所述步骤(c)的色谱条件中，所述流动相A相为0.1％甲酸水，其流动相所采用的线性梯度洗脱条件为：

0-4min，流动相A相所占的体积比为：85→80％，流动相B相所占的体积比为：15→20％；

4-5min，流动相A相所占的体积比为：80→10％，流动相B相所占的体积比为：20→90％；

5-8min，流动相A相所占的体积比为：10％，流动相B相所占的体积比为：90％；

8-8.1min，流动相A相所占的体积比为：10→85％，流动相B相所占的体积比为：90→15％；

8.1-15min，流动相A相所占的体积比为：85％，流动相B相所占的体积比为：15％。

作为本发明的优选，所述步骤(d)质谱条件中，三重四极杆质谱仪的型号为Agilent G6410A。

本发明液相和质谱条件优化

为了得到较高的离子响应和较好的色谱行为，本发明分别考察了甲醇-水，甲醇-酸水，乙腈-水，乙腈-酸水四种流动性系统，结果显示，乙腈-酸水系统作为流动相时，各化合物具有较好的色谱行为。最后选择乙腈-酸水系统作为流动相。并对不同浓度的甲酸水(0.05％、0.1％和0.2％)进行了考察，结果显示乙腈-0.1％甲酸水作为流动相时，分析效果和离子响应较好。

本发明还同时考察了各化合物在正、负离子模式下的质谱行为，因所测化合物中同时含有极性分子(酚酸类)和非极性分子(丹参酮类)。因此，最终采用正负切换模式。各个化合物根据其碎片离子响应度的高低，分别选择不同的CE和FV，并选择其中稳定性高和灵敏性高的离子进行定量分析，选择各自合适的质谱条件见表1。基于优化的LC、MS/MS条件，并根据各对照品的保留时间(RT)和质谱信息，对脑心通胶囊中16个成分进行标定和鉴定，色谱见图1和各对照品保留时间、质谱信息见表1，其中1号峰-没食子酸、2号峰-丹参素、3号峰-羟基红花黄素色A、4号峰-绿原酸、5号峰-苦杏仁苷、6号峰-原儿茶醛、7号峰-表儿茶素、8号峰-咖啡酸、9号峰-芍药内酯苷、10号峰-芒柄花苷、11号峰-芍药苷、12号峰-芦丁、13号峰-丹酚酸A、14号峰-桂皮素、15号峰-芒柄花素、16号峰-二氢丹参酮Ⅰ。

表1 16个对照品保留时间、质谱信息

本发明样品处理方法的优化

为了得到合适的样品前处理方法，本发明还考察了不同比例的甲醇-水(100％、75：25和50：50)，结果显示，在100％甲醇作为样品提取溶剂时，提取效率最高。同时又考察了不同的提取物料比(1：50，1：100，1：200)，不同的提取时间(30、40、50和60min)对提取效率的影响。最后确定，0.5g脑心通胶囊药粉，溶入到50mL的甲醇中，超声处理40min作为脑心通胶囊的样品前处理方法。

本发明有益效果：

1、本发明所建立的脑心通胶囊快速分离液相色谱检测方法，具有精密度、重现性良好、稳定性可靠的特点，能有效地表征脑心通胶囊中16个特征成分，并对其进行定性鉴定和定量测定，实验结果表明，该检测方法稳定、可靠。在测定结果中发现，芍药苷和苦杏仁苷含量最高，分别为1955.11-2323.14μg/g和1430.18-1938.42μg/g。没食子酸、丹参素、羟基红花黄色素A、绿原酸和表儿茶素的含量都在100μg/g以上。而含量较低的分别为原儿茶醛、咖啡酸、芦丁和芒柄花素。且测定成分中羟基红花黄色素A、丹参素、芦丁、丹酚酸A等成分，现代药理学实验表明，羟基红花黄色素可抑制血小板激活因子诱发的血小板聚集与释放，可竞争性地抑制血小板激活因子与血小板受体的结合，是脑心通活血化瘀有效成分之一。丹参素、丹酚酸A对脑缺血损伤的神经保护效应，其具有抗血栓的作用，这与脑心通胶囊的具有益气活血，化瘀通络的功能相类似，能更有效的保证成品的质量，对脑心通胶囊的质量控制具有重要作用。

2、采用本发明所建立的快速分离液相色谱检测方法，对脑心通胶囊15个批次中16种化合物的含量进行测定，实验结果显示，各化合物浓度的RSD范围为6.56％-18.02％，实验表明，在不同批次的脑心通胶囊中，各个化合物的含量稳定性较好。可以作为脑心通胶囊含量成分检测中的应用。

附图说明

图1-脑心通胶囊中16种化合物含量的快速分离液相色谱图；其中图1中1-没食子酸、2-丹参素、3-羟基红花黄素色A、4-绿原酸、5-苦杏仁苷、6-原儿茶醛、7-表儿茶素、8-咖啡酸、9-芍药内酯苷、10-芒柄花苷、11-芍药苷、12-芦丁、13-丹酚酸A、14-桂皮素、15-芒柄花素、16-二氢丹参酮Ⅰ。

具体实施方式

为了更加充分理解本发明的实施，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。

除非另作定义，本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本发明专利申请说明书以及权利要求书中所述的“脑心通胶囊”均指的是由陕西步长制药有限公司生产，其处方配比和制备方法在以上的发明内容部分有确切的含义。

实施例1：本发明所建立脑心通胶囊快速分离液相色谱方法

1.1仪器

超声波清洗器KH3200E(昆山禾创超声仪器有限公司)，赛多利斯电子天平BS210S(赛多利斯科技有限公司)，Agilent XDB C₁₈柱，4.6mm×50mm，1.8μm，(安捷伦科技有限公司)，Agilent快速分离色谱仪Agilent1200(安捷伦科技有限公司)，gilent三重四极杆质谱G6410(安捷伦科技有限公司)。

1.2试药

没食子酸，MUST-13040103，(成都曼思特生物科技有限公司)；丹参素，MUST-13030108，(成都曼思特生物科技有限公司)；羟基红花黄A110826-200712，(中国药品生物制品检定所)；绿原酸，110753-200413，(中国食品药品检定研究院)；苦杏仁苷，110736-200403，(中国药品生物制品检定所)；原儿茶醛，110810-200205，(中国食品药品检定研究院)；表儿茶素，110878-200102，(中国药品生物制品检定所)；咖啡酸，110885-200102，(中国药品生物制品检定所)；芍药内酯苷，20100325，(深圳美禾生物科技有限公司)；芒柄花苷，2009-A0511，(成都曼斯特公司)；芍药苷，110732-20056，(中国药品生物制品检定所)；芦丁，760706，(中国药品生物制品检定所)；丹酚酸A，MUST-13020701，(成都曼思特生物科技有限公司)；桂皮酸，110710-200706，(中国药品生物制品检定所)；芒柄花素，RFS-B-100610-04(成都普思生物科技有限公司)；二氢丹参酮Ⅰ，MUST-13082317(成都曼思特生物科技有限公司)；甲酸，VC300060，(CNW科技技术有限公司)；甲醇136007，(FisherScientific Company)，乙腈，122070，(Fisher Scientific Company)。脑心通胶囊(共15批，样品编号S1(批号131117)、样品编号S2(批号131118)、样品编号S3(批号131120)、样品编号S4(批号131121)、样品编号S5(批号131122)、样品编号S6(批号131125)、样品编号S7(批号131126)、样品编号S8(批号131127)、样品编号S9(批号131129)、样品编号S10(批号131130)、样品编号S11(批号131131)、样品编号S12(批号131134)、样品编号S13(批号131135)、样品编号S14(批号131137)、样品编号S15(批号131138))由陕西步长制药有限公司提供(0.4g/粒)。

1.3供试品溶液的制备

取脑心通胶囊，称取粉末0.25g，加入75％甲醇溶液配成0.25g/mL溶液，超声提取35min，放至室温，用甲醇补足重量，摇匀，离心，取上清液，即得供试品溶液。

1.4混合对照品标准液的制备

取没食子酸、丹参素、羟基红花黄色素A、绿原酸、苦杏仁苷、原儿茶醛、表儿茶素、咖啡酸、芍药内酯苷、芒柄花苷、芍药苷、芦丁、丹酚酸A、桂皮酸、芒柄花素、二氢丹参酮Ⅰ对照品适量，精密称重，加甲醇，制得没食子酸浓度为1.031mg/mL、丹参素浓度为0.998mg/mL、羟基红花黄色素A浓度为0.717mg/mL、绿原酸浓度为0.448mg/mL、苦杏仁苷浓度为0.882mg/mL、原儿茶醛浓度为1.076mg/mL、表儿茶素浓度为1.0315mg/mL、咖啡酸浓度为0.307mg/mL、芍药内酯苷浓度为0.662mg/mL、芒柄花苷浓度为0.784mg/mL、芍药苷浓度为0.993mg/mL、芦丁浓度为0.466mg/mL、丹酚酸A浓度为1.0366mg/mL、桂皮酸浓度为1.017mg/mL、芒柄花素浓度为0.502mg/mL、二氢丹参酮Ⅰ浓度为0.2525mg/mL的混合对照品溶液，即得。

1.5色谱及质谱条件

色谱条件：以十八烷基键合硅胶柱为填充剂，以0.1％甲酸水为流动相A相，以乙腈为流动相B相；其体积配比为流动相A相：流动相B相为15-90：85-10，进行线性梯度洗脱；流速：0.20mL·min^-1；柱温25℃，进样5μL；

质谱条件：三重四极杆质谱仪，电离离子源采用电喷雾离子源，检测模式为正负切换多重反应监测模式；质谱条件如下：碰撞气温度：300℃，N₂流速:12L/min，保护气流动：15psi，正负模式下毛细管温度均为4000V，驻留时间为200ms；

色谱峰测定：将上述步骤(a)所制得的供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照上述步骤(c)的色谱条件和步骤(d)质谱条件，测定供试液溶液，得到脑心通胶囊中16个化合物的各自特征峰的保留时间，即得。

2方法学验证

2.1线性关系，最低检测限(LOD)和最低定量限(LOQ)

精密量取各标准品储备液适量，置于同一容量瓶中，用甲醇定容至刻度。然后，依次稀释2，4，8，16，32，64，128倍。分别吸取各对照品溶液5μL注入RRLC-MS/MS，以各标准化合物的峰面积为纵坐标(Y)，以各标准化合物的浓度为横坐标(X)，依据最小二乘法(1/X²)计算出每一个化合物的标准曲线和线性范围。用甲醇稀释一系列混合标准化合物溶液，当所测化合物浓度的信噪比(S/N)为3：1时，此浓度就是该化合物的最低检测限(LOD)；当所测化合物浓度的信噪比(S/N)为10：1时，此浓度就是该化合物的最低定量限(LOQ)。见表1-1-7结果显示，各个化合物的线性关系良好(R>0.99)。

表2各化合物的标准曲线、相关系数及线性范围

表3各化合物最低检测限和最低定量限

2.2精密度考察

对该分析方法的日内精密度和日间精密度分别进行了考察。配制相同的6份含有16种化合物的混合标准品溶液，一天内连续进样，每份进样2次，依平均峰面积计算相对标准偏差(RSD)，即为该方法的日内精密度。取相同的6份对照品溶液，每天进样2份，连续进样3天，计算出的相对标准偏差(RSD)即为该方法的日间精密度。

表4各化合物的精密度考察

实验结果表明，16种化合物的日内精密度的相对标准偏差(RSD)范围为0.44-4.14％，日间精密度的相对标准偏差(RSD)范围为2.19-4.86％。表明该方法具有良好的日内精密度和日间精密度。

2.3重复性的考察

选择样品(S15，批号：131138)，采用“1.3供试品溶液的制备和1.4混合对照品标准液的制备”项下的方法，制备相同的6份样品溶液，采用“1.5色谱及质谱条件”项下的方法分别进行测定。计算该方法的重复性。

表5各化合物的重复性考察

实验数据显示，16种化合物的相对标准偏差(RSD)范围为0.61-4.31％，表明该方法的重复性良好。

2.4稳定性的考察

选择样品(S15，批号：131138)，采用“1.3供试品溶液的制备和1.4混合对照品标准液的制备”项下的方法，制备相同的6份样品溶液，采用“1.5色谱及质谱条件”项下的方法分别进行测定。在24h内每隔4小时测定一次，每次连续进样3针，分别计算含量，并计算各化合物间的相对标准偏差(RSD)。

表6各化合物的稳定性考察

实验数据显示，16种化合物的相对标准偏差(RSD)均小于5％，结果表明，该样品稳定性良好。

2.5加样回收率

精密称取已知含量的脑心通胶囊样品(S15，批号：131138)约0.25g，共称取9份，分为3组，每组3份，分别加入适量的标准品溶液，采用“1.3供试品溶液的制备和1.4混合对照品标准液的制备”项下的方法，制备相同的6份样品溶液，采用“1.5色谱及质谱条件”项下的方法测定。分别计算回收率。回收率(％)＝[(检测量-原有量)/加入量]×100

表7脑心通胶囊中16种化合物的加样回收率

结果显示，脑心通胶囊中的16种化合物的加样回收率范围为92.8％-104.3％(RSD≤4.94％)。

2.6 15个批次的脑心通胶囊含量测定结果

分别称取脑心通胶囊0.5g，精密称定，置于磨口锥形瓶中，“1.3供试品溶液的制备和1.4混合对照品标准液的制备”项下的方法，进行测定。分别计算各个脑心通胶囊中16种化合物的含量。其测定结果见表8。

表8 15个批次的脑心通胶囊中化合物的含量(μg.g^-1)

最后应说明的是：本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，均在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种脑心通胶囊快速分离液相色谱检测方法，所述的脑心通胶囊是由黄芪、丹参、当归、川芎、赤芍、红花、乳香、没药、桑枝、桂枝、牛膝、桃仁、全蝎、地龙、水蛭16味中药加工制备而成；其特征在于，该方法包括如下的步骤：

(a)供试品溶液的制备：称取脑心通胶囊内容物，加入料液比为1:50～200的甲醇溶剂，进行超声提取时间为30～60min，放置至室温，用甲醇补足损失重量，摇匀，过滤，续滤液即为供试品溶液；

(b)对照品标准液的制备：精密称重，没食子酸、丹参素、羟基红花黄色素A、绿原酸、苦杏仁苷、原儿茶醛、表儿茶素、咖啡酸、芍药内酯苷、芒柄花苷、芍药苷、芦丁、丹酚酸A、桂皮酸、芒柄花素、二氢丹参酮Ⅰ对照品适量，加甲醇溶解，配制为混合对照品溶液；

(c)色谱条件：以Agilent XDB C₁₈为色谱柱，以0.05～0.2％甲酸水为流动相A相，以乙腈为流动相B相；其流动相所采用的线性梯度洗脱条件为：

0-4min，流动相A相所占的体积比为：85→80％，流动相B相所占的体积比为：15→20％；

4-5min，流动相A相所占的体积比为：80→10％，流动相B相所占的体积比为：20→90％；

5-8min，流动相A相所占的体积比为：10％，流动相B相所占的体积比为：90％；

8-8.1min，流动相A相所占的体积比为：10→85％，流动相B相所占的体积比为：90→15％；

8.1-15min，流动相A相所占的体积比为：85％，流动相B相所占的体积比为：15％，流速：0.20mL·min^-1；柱温25℃，进样5μL；

(d)质谱条件：三重四极杆质谱仪，电离离子源采用电喷雾离子源，检测模式为正负切换多重反应监测模式；质谱条件如下：碰撞气温度：300℃，N₂流速:12L/min，保护气流动：15psi，正负模式下毛细管温度均为4000V，驻留时间为200ms；

(e)色谱峰测定：将上述步骤(a)所制得的供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照上述步骤(c)的色谱条件和步骤(d)质谱条件，测定供试液溶液，得到脑心通胶囊中各自特征峰的保留时间，即得。

2.根据权利要求1所述快速分离液相色谱检测方法，所述步骤(a)供试品溶液制备方法中，加入料液比1：100的甲醇溶剂，超声提取时间为40min。

3.根据权利要求1所述快速分离液相色谱检测方法，所述步骤(b)对照品标准液的制备中，所述没食子酸浓度为1.031mg/mL、丹参素浓度为0.998mg/mL、羟基红花黄色素A浓度为0.717mg/mL、绿原酸浓度为0.448mg/mL、苦杏仁苷浓度为0.882mg/mL、原儿茶醛浓度为1.076mg/mL、表儿茶素浓度为1.0315mg/mL、咖啡酸浓度为0.307mg/mL、芍药内酯苷浓度为0.662mg/mL、芒柄花苷浓度为0.784mg/mL、芍药苷浓度为0.993mg/mL、芦丁浓度为0.466mg/mL、丹酚酸A浓度为1.0366mg/mL、桂皮酸浓度为1.017mg/mL、芒柄花素浓度为0.502mg/mL、二氢丹参酮Ⅰ浓度为0.2525mg/mL的混合对照品溶液，即得。

4.如权利要求1所述快速分离液相色谱检测方法，其特征在于，所述步骤(c)的色谱条件中，所述流动相A相为0.1％甲酸水。

5.根据权利要求1所述快速分离液相色谱检测方法，所述步骤(d)质谱条件中，所述快速分离色谱仪型号为Agilent1200，三重四极杆质谱仪的型号为Agilent G6410A。