CN104880517B - 一种中药制剂中痕量成分含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中药制剂中痕量成分含量的测定方法。该方法包括下列步骤：(a)建立对照指纹图谱；(b)指认对照指纹图谱的色谱峰，并将指纹峰对应的物质作为参照物；(c)结合对照指纹图谱，通过与参照物的光谱比较，对各个色谱峰对应的物质进行分类，确定目标物质及其对应参照物，其中所述目标物质与其参照物具有相似的光谱行为；(d)建立参照物标准曲线；(e)依据参照物标准曲线估算目标物质含量。适用于结构不明确的或还微量或痕量物质的含量测定。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，尤其是一种中药制剂中痕量成分含量的测定方法。
背景技术
中药具有丰富的物质组成，通常称为物质群。中药作用的整体性和协同性特点也源自于此。但是因此而来，给活性成分的定性定量分析也带来了很大的困难。中药及其制剂，例如丹参注射液、参麦注射液、板蓝根颗粒的主要活性成分群已经被很多研究证实。然而，实验研究表明，能够明显检测到并作出准确含量测定的成分依然只是一小部分。而大多数微量甚至痕量的成分，其总重量占据了主要活性成分群的大部分。以丹参注射液为例，丹参酚酸类化合物是其主要活性成分群，除丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、原儿茶酸、紫草酸、咖啡酸、异阿魏酸和丹酚酸D九种能明确结构并且以HPLC方法测得含量的成分之外，仍含有其他多种难于进行定性和定量的酚酸类物质，并且这些物质占总酚酸比例超过70％。因此，对中药及其制剂的成分，尤其是主要活性成分群的系统研究，最大限度地研究这些化合物在产品中所占的含量比例，对中药及其的质量控制和作用机理研究具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种中药制剂中痕量成分含量的测定方法，其包括下列步骤：
(a)建立对照指纹图谱，其中所述对照指纹图谱采用HPLC(高效液相色谱)法或LC-MS(液质联用)法建立；
(b)对步骤(a)所得对照指纹图谱的色谱峰进行指认，并将指纹峰对应的物质作为参照物，其中对照指纹图谱色谱峰采用HPLC法、UV(紫外光谱)法或LC-MS法指认；
(c)结合对照指纹图谱，通过与参照物的光谱比较，对各个色谱峰对应的物质进行分类，确定目标物质及其对应参照物，其中所述目标物质与其参照物具有相似的光谱行为，包括紫外吸收光谱行为；
(d)建立参照物标准曲线，其中所述参照物标准曲线采用HPLC法建立，标准曲线方程是y＝ax1+b；
(e)估算目标物质含量，其中所述目标物质含量采用下述公式进行估算：
公式(1)为参照物标准曲线，其中x1为浓度，以μg/ml为单位，
y＝ax1+b 公式(1)
假设M1为参照物摩尔质量，则有
公式(2)
设则公式(2)可写成
y＝M1*a*x1'+b 公式(3)
其中x1'以10-3mol/L为单位，公式(3)为参照物摩尔浓度标准曲线，可以此为依据，根据目标物质的峰面积，估算其摩尔浓度，公式如下
公式(4)
其中x'2为目标物质摩尔浓度，以10-3mol/L为单位，乘以目标物质分子量M2即得其质量浓度
公式(5)
公式(5)中x2为目标物质质量浓度，以μg/ml为单位。
在建立对照指纹图谱步骤中，鉴于光谱采集指纹图谱技术的特点在于其整体性和模糊性，但在对照品缺乏的条件下最大限度地指认其色谱峰尤其是不明成分峰存在缺陷，因此推荐液质联用技术补充性地解决上述问题。
在本发明的一些实施方案中，步骤(e)中所述目标物质的分子量采用高效液相色谱联用电喷雾离子阱质谱的方法确定。
本发明还进一步提供了一种丹参注射液中丹酚酸类痕量成分含量的测定方法，其包括下列步骤：
(a)采用HPLC法建立对照指纹图谱；
(b)采用HPLC法对步骤(a)所得对照指纹图谱的色谱峰进行指认，并将指纹峰对应的物质作为参照物；
(c)结合对照指纹图谱，通过与参照物的紫外吸收光谱行为的相似性，对各个色谱峰对应的组织进行分类，确认目标物质及其对应参照物；
(d)采用HPLC法建立参照物标准曲线，其标准曲线方程是y＝ax1+b；
(e)采用下述公式估算目标物质含量：
公式(1)为参照物标准曲线，其中x1为浓度，以μg/ml为单位，
y＝ax1+b 公式(1)
假设M1为参照物摩尔质量，则有
公式(2)
设则公式(2)可写成
y＝M1*a*x1'+b 公式(3)
其中x1'以10-3mol/L为单位，公式(3)为参照物摩尔浓度标准曲线，可以此为依据，根据目标物质的峰面积，估算其摩尔浓度，公式如下
公式(4)
其中x'2为目标物质摩尔浓度，以10-3mol/L为单位，乘以目标物质分子量M2即得其质量浓度
公式(5)
公式(5)中x2为目标物质质量浓度，以μg/ml为单位；
其中，所述参照物选自丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、原儿茶酸、紫草酸、咖啡酸、异阿魏酸、丹酚酸D中的任意一种或一种以上，优选丹参素钠、迷迭香酸、丹酚酸B、原儿茶酸、紫草酸、咖啡酸、丹酚酸D中的任意一种或一种以上，更优选丹参素钠、迷迭香酸、丹酚酸B、原儿茶酸、紫草酸、咖啡酸中的任意一种或一种以上。
丹酚酸类成分极易溶于水，尼龙6微孔滤膜对酚酸类物质有一定吸附作用，且注射液产品中几乎不含固体颗粒杂质，因此丹参注射液供试品可加水稀释5倍后直接进样，或经其他种类滤膜(如PVDF亲水滤膜)或离心后取上清加水稀释5倍后进样以维护色谱柱。
在本发明的丹参注射液中丹酚酸类痕量成分含量测定的一些实施方案中，步骤(a)所述的对照指纹图谱按照下列方法建立，
对照品溶液的制备：取丹参注射液加水稀释5倍，备用；
对照指纹图谱的测定：吸取上述对照品溶液注入液相色谱仪，使用HPLC法进行测定，得到丹参注射液对照指纹图谱，色谱条件：色谱柱为Shiseido Capcell pak MG C18柱并用Shiseido MG C18柱保护，流动相为乙腈-0.03％磷酸水溶液，检测波长为286nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，梯度洗脱程序如下，
在建立丹参注射液对照指纹图谱过程中，发现当所述十八烷基硅烷键合硅胶柱为Shiseido Capcell pak MG C18柱或Phenomenex Luna C18柱，优选Shiseido Capcell pakMG C18柱时所得色谱图基线平稳，各主要色谱峰分离度均达到1.5；当检测波长为270-280nm时，优选286nm时，适合分析丹参酚酸类成分色谱分析，基线平稳，主要成分响应值高，谱图信息全面；当柱温为25-30℃时，各主要峰分离度良好，且分析时间较短，当20℃柱温时原儿茶酸和异阿魏酸分离度不佳，35℃时丹酚酸D与之前杂质峰无法分离。
在本发明的丹参注射液中丹酚酸类痕量成分含量测定的一些实施方案中，步骤(d)中所述参照物标准曲线按照如下方法建立，
参照物标准曲线对照品溶液的制备
丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B对照品贮备液：分别精密称取3mg原儿茶醛对照品和2mg迷迭香酸对照品，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液；分别精密称取7.2mg丹参素钠对照品和2.90mg丹酚酸B对照品，置于5ml容量瓶中，精密量取1ml原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液置于此容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得含1.44mg/ml丹参素钠、0.58mg/ml丹酚酸B、0.30mg/ml原儿茶醛和0.20mg/ml迷迭香酸的对照品贮备液；
丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；
咖啡酸和异阿魏酸对照品贮备液：分别精密称取2.8mg咖啡酸对照品和1.2mg异阿魏酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取250μl所配溶液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含28μg/ml咖啡酸、12μg/ml异阿魏酸的对照品贮备液；
咖啡酸和异阿魏酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；
原儿茶酸和紫草酸对照品贮备液：精密称取1.2mg原儿茶酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得原儿茶酸对照品母液。精密称取1.4mg紫草酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得紫草酸对照品母液；精密量取0.25ml原儿茶酸对照品母液和1.25ml紫草酸对照品母液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含12μg/ml原儿茶酸、70μg/ml紫草酸的对照品贮备液；
原儿茶酸和紫草酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；
或，还包括取丹酚酸D分离产物适量，精密称定，加水制成每1ml含丹酚酸D分离产物0.35mg的对照品贮备液；精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；
标准曲线的绘制
取7个不同浓度的标准曲线对照品溶液，分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，每个浓度的对照品溶液重复配置测定3次，将3次结果平均得到最终的标准曲线；
色谱条件：色谱柱为Shiseido Capcell pak MG C18柱并用Shiseido MG C18柱保护，流动相为乙腈-0.03％磷酸水溶液，检测波长为286nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，梯度洗脱程序如下，
系统适应性条件：分离度大于1.5，色谱峰理论塔板数不小于30000，对称因子在0.9～1.1之间。
检测波长的变动对参照物的峰面积测定都有不同程度的影响，波长280-290nm检测结果可以接受。值得注意的是，检测波长对丹参素钠和原儿茶酸的影响最为明显，且在286nm波长下，基线平稳，主要成分响应值高，谱图信息全面。
在建立参照物标准曲线时，色谱柱选自Shiseido Capcell pak MG C18柱、Agilent Zorbax SB C18柱、Waters Xbridge C18柱或Phenomenex Luna C18，优选Shiseido Capcell pak MG C18柱或Phenomenex Luna C18，更优选Shiseido Capcell pakMG C18，其中所述十八烷基硅烷键合硅胶柱进一步用Shiseido MG C18柱保护。对于丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B三个主要成分以及咖啡酸，不同色谱柱均能做到基线分离，峰面积RSD<3％。而迷迭香酸、原儿茶酸、紫草酸和异阿魏酸四种成分，仅能在两到三种色谱柱上达到基线分离，其中迷迭香酸、异阿魏酸与其邻近的杂质峰较难分开，如果选用不同色谱柱，可通过改变流动相条件来改善分离度。当上述四种成分色谱峰分离度>1.2时，记录峰面积并计算RSD或RAD(相对平均偏差)。数据显示迷迭香酸、原儿茶酸和紫草酸峰面积RSD<4％，异阿魏酸峰面积RAD<3％，说明不同色谱柱对峰面积影响较小。
在建立参照物标准曲线时，流动相为乙腈-磷酸水溶液，其中磷酸的体积百分比为0.01～0.10％，优选0.03％、0.05％或0.075％，更优选0.03％。流动相动相酸度对分离度有一定影响，且不同物质变化趋势不同，但在磷酸的体积百分比为0.03％、0.05％或0.075％的条件下几乎所有成分都能达到基线分离。丹参素钠、原儿茶醛等主要成分的峰面积受酸度影响较小，RSD<2％。紫草酸和异阿魏酸由于含量低，峰面积小，相对偏差较大，实际峰面积的偏差仍在可接受的系统波动范围内。
在建立参照物标准曲线时，柱温(20～35℃)对丹参素钠9种酚酸类化合物的分离度影响较小，均能达到或接近基线分离，分离度均>1.4。随着温度上升，各成分保留时间减少，而大部分物质的理论塔板数也随之有一定幅度的降低。丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B四个主要成分峰面积RSD<2％，不同柱温对其影响不大。而由于原儿茶酸、紫草酸、咖啡酸和异阿魏酸含量较低，峰面积较小，其RSD达到了5％～8％，说明在测定含量较低的酚酸类成分时，有必要注意控温，优选30±0.8℃。
在本发明的丹参注射液中丹酚酸类痕量成分含量测定的一些实施方案中，所述对照指纹图谱如图1所示。
在本发明的丹参注射液中丹酚酸类痕量成分含量测定的一些实施方案中，所述目标物质及其对应参照物的紫外吸收光谱行为如图2、图3或图4所示。
按照本发明的方法测定丹参注射液中酚酸类成分，发现丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、原儿茶酸、紫草酸、咖啡酸、异阿魏酸和丹酚酸D九种主要丹酚酸占总酚酸比例为27.15％。
本发明的测定方法适用于结构不明确的或还微量或痕量物质的含量测定，弥补了HPLC、UV等定量方法依赖对照品、待检物质含量不宜过低等缺陷。
说明书附图
图1是丹参注射的对照指纹图谱。
图2是目标物质1～3及其参照物的紫外吸收光谱。
图3是目标物质4～6及其参照物的紫外吸收光谱。
图4是目标物质7及其参照物的紫外吸收光谱。
具体实施方案
实施例1丹参注射液对照指纹图谱的建立和解析
1、仪器与试剂
高效液相色谱系统：Agilent 1100美国安捷伦科技公司(配置真空脱气机，自动进样器，四元泵，VWD G1314A，DAD G1315B；Agilent ChemStation A 10.02色谱工作站)。
丹参素钠对照品、原儿茶酸对照品、原儿茶醛对照品均购自中国药品生物制品检定所，迷迭香酸对照品、紫草酸对照品、丹酚酸B对照品、咖啡酸对照品、异阿魏酸对照品均购自上海友思生物技术有限公司，丹酚酸D对照品从丹参中分离得(自制，纯度约70％)；磷酸(85％)、甲酸(96％)、乙酸均购自Tedia(USA)，甲醇、乙腈均购自Burdick&Jackson(Honeywell，USA)，水由Mili-Q超纯水仪制备。
2、色谱条件
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Shiseido Capcell pak MG C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱及Shiseido MG C18(4.6×12.5mm，5μm)保护柱；流动相：乙腈-0.03％磷酸水溶液；检测波长：286nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；梯度洗脱程序：见表1；色谱积分参数：见表2。
表1 梯度洗脱程序
表2 指纹图谱积分参数
3、溶液的制备
供试品溶液的制备：取丹参注射液(神威药业集团有限公司提供)加水稀释5倍，即得。
4、对照指纹图谱色谱及其峰指认
对200批丹参注射液进行指纹图谱分析，其相似度均在90％以上，得对照指纹图谱，见图1。通过与对照品的色谱、紫外光谱及质谱行为比较，确认9个指纹峰分别为：1号峰为丹参、2号峰为原儿茶、3号峰为原儿茶、4号峰为咖啡酸、5号峰为异阿魏酸、6号峰为丹酚酸D、7号峰为迷迭香酸、8号峰为紫草酸、9号峰为丹酚酸B。
5、指纹图谱分析方法的验证
(1)精密度考察
取丹参注射液样品，按照所建立的HPLC条件分析，连续进样6次，每次进样10μl。将色谱图导入国家药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价软件，计算各色谱图的相似度，结果见表3。结果表明，连续进样6次所得的色谱图相似度均在0.993以上，精密度符合要求。
表3 指纹图谱精密度考察相似度结果
(2)重复性考察
取同一瓶丹参注射液样品，平行制备6份供试品溶液，按照所建立的HPLC指纹图谱条件进行分析，结果见表4。结果表明，平行6份样品所得到的色谱图相似度为1.000，重复性符合要求。
表4 指纹图谱重复性考察相似度结果
(3)稳定性考察
取同一批丹参注射液样品，室温放置，于0，3，6，9，12，15，18，21，24小时进样，按照所建立的HPLC指纹图谱分析方法分析，结果见表5。结果表明，24小时内所得到的色谱图相似度大于0.998，稳定性符合要求。
表5 指纹图谱稳定性考察相似度结果
以上试验结果表明，该方法准确度高、重现性好、稳定性合格，符合指纹图谱的方法验证要求。
实施例2参照物标准曲线的建立
1、仪器与试剂与实施例1相同。
2、色谱条件与系统适应性试验
(1)色谱条件与实施例1相同。
(2)系统适应性试验
在选定的色谱条件下，九个主要酚酸类成分丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、异阿魏酸、丹酚酸D、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B均达到基线分离，分离度大于1.5，色谱峰理论塔板数不小于30000，对称因子在0.9-1.1之间。
对照品溶液的制备
由于样品中几个主要酚酸类成分含量及溶解度差异较大，将含量及溶解性相近的成分配成混标贮备液，量取不同体积后定容得到浓度适宜的标准曲线对照品溶液。具体操作方法如下。
丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B对照品贮备液：分别精密称取3.00mg原儿茶醛对照品和2.00mg迷迭香酸对照品，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液。分别精密称取7.20mg丹参素钠对照品和2.90mg丹酚酸B对照品，置于5ml容量瓶中，精密量取1ml原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液置于此容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得含1.44mg/ml丹参素钠、0.58mg/ml丹酚酸B、0.30mg/ml原儿茶醛和0.20mg/ml迷迭香酸的对照品贮备液。
丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液。
咖啡酸和异阿魏酸对照品贮备液：分别精密称取2.80mg咖啡酸对照品和1.20mg异阿魏酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取250μl所配溶液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含28μg/ml咖啡酸、12μg/ml异阿魏酸的对照品贮备液。
咖啡酸和异阿魏酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液。
原儿茶酸和紫草酸对照品贮备液：精密称取1.20mg原儿茶酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得原儿茶酸对照品母液。精密称取1.40mg紫草酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得紫草酸对照品母液。精密量取0.25ml原儿茶酸对照品母液和1.25ml紫草酸对照品母液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含12μg/ml原儿茶酸、70μg/ml紫草酸的对照品贮备液。
原儿茶酸和紫草酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液。
上述操作重复3次，用于建立标准曲线。
4、供试品溶液的制备
取丹参注射液样品加水稀释5倍，即得。
5、线性及范围
按3对照品溶液的制备项中步骤制备7个不同浓度的标准曲线对照品溶液，分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以样品浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线。每个浓度的对照品溶液重复配置测定3次，将3次结果平均得到最终的标准曲线，见表6-表14。结果表明，8个被测定的化合物在标准曲线的线性范围内均呈良好的线性(R2>0.999)。
表6 丹参素钠的标准曲线
表7 原儿茶醛的标准曲线
表8 迷迭香酸的标准曲线
表9 丹酚酸B的标准曲线
表10 原儿茶酸的标准曲线
表11 紫草酸酸的标准曲线
表12 咖啡酸的标准曲线
表13 异阿魏酸的标准曲线
表14 8种酚酸类化合物的标准曲线
检测限(LOD)是信噪比(S/N)为3时的被测物浓度；定量限(LOQ)是信噪比(S/N)为10时的被测物浓度，通过重复测量2次求得平均值，得被测成分的检测限和定量限见表6-表14。
6、准确度
准确度验证采用向已知浓度的供试品溶液中加入已知量的对照品，计算回收的百分率。每个对照品设计3个不同浓度，每个浓度平行制备3份供试品溶液进行测定，用9个测定结果评价准确度。
丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B对照品贮备液：分别精密称取3.10mg原儿茶醛对照品和2.00mg迷迭香酸对照品，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液。分别精密称取7.40mg丹参素钠对照品和2.90mg丹酚酸B对照品，置于5ml容量瓶中，精密量取1ml原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液置于此容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得含1.48mg/ml丹参素钠、0.58mg/ml丹酚酸B、0.31mg/ml原儿茶醛和0.20mg/ml迷迭香酸的对照品贮备液。
丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B加标回收率供试品溶液：精密量取0.3，0.4，0.6ml对照品贮备液，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得低、中、高三个浓度的混合对照品溶液。将丹参注射液加水稀释5倍，与对照品溶液等体积混合，每一浓度平行制备3份，得丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B加标回收率供试品溶液。
原儿茶酸和紫草酸对照品贮备液：精密称取1.20mg原儿茶酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得原儿茶酸对照品母液。精密称取1.45mg紫草酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得紫草酸对照品母液。精密量取0.5ml原儿茶酸对照品母液和2.5ml紫草酸对照品母液置于10ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含12μg/ml原儿茶酸、72.5μg/ml紫草酸的对照品贮备液。
原儿茶酸和紫草酸加标回收率供试品溶液：精密量取0.3，0.4，0.6ml对照品贮备液，置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得低、中、高三个浓度的混合对照品溶液。将丹参注射液加水稀释5倍，与对照品溶液等体积混合，每一浓度平行制备3份，得原儿茶酸、紫草酸加标回收率供试品溶液。
咖啡酸和异阿魏酸对照品贮备液：分别精密称取2.85mg咖啡酸对照品和1.35mg异阿魏酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取250μl所配溶液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含28.5μg/ml咖啡酸、
13.5μg/ml异阿魏酸的对照品贮备液。
咖啡酸和异阿魏酸加标回收率供试品溶液：精密量取0.3，0.4，0.6ml对照品贮备液，置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得低、中、高三个浓度的混合对照品溶液。将丹参注射液加水稀释5倍，与对照品溶液等体积混合，每一浓度平行制备3份，得咖啡酸、异阿魏酸加标回收率供试品液。
将加标回收率供试品溶液用2色谱条件与系统适应性试验项的HPLC方法进行分析，通过计算测定的理论值和真实加入量的比值来计算回收率，结果见表15。结果表明，供试品平均回收率大于98％，小于102％，RSD小于3％，本方法具有良好的准确度。
表15 准确度考察结果
7、精密度
(1)重复性考察
取同一瓶丹参注射液样品，平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，计算含量，结果见表16。结果显示，RSD小于2％，表明方法重复性良好。
表16 重复性考察结果
(2)中间精密度试验
不同日期：取同一瓶丹参注射液样品，每天制备三份供试品溶液，分别精密吸取10μl注入液相色谱仪，测定峰面积，计算含量，连续分析三天，结果见表17。结果表明，RSD小于2％，方法精密度良好。
表17 中间精密度试验——不同日期
不同人员：取同一瓶丹参注射液样品，由三名不同操作人员每人平行制备三份供试品溶液，分别精密吸取10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，计算含量，结果见表18。结果表明，RSD小于2％，方法精密度良好。
表18 中间精密度试验——不同人员
8、供试品稳定性考察
取同一份供试品溶液，分别在0，3，6，9，12，15，18，21，24小时进样，记录峰面积，计算含量，结果见表19。结果表明，RSD小于2％，供试品溶液在24小时内稳定。
表19 稳定性考察
实施例3参照物的标准曲线的建立
1、仪器与试剂
高效液相色谱系统：Agilent 1100美国安捷伦科技公司(配置真空脱气机，自动进样器，四元泵，VWD G1314A，DAD G1315B；Agilent ChemStation A 10.02色谱工作站)。
由于丹酚酸D在纯化以后极不稳定，无法购买到可用于定性定量分析的对照品，因此从丹参中分离获得，纯度约为70％(HPLC，峰面积归一化法)；磷酸(85％)、甲酸(96％)、乙酸均购自Tedia(USA)，甲醇、乙腈均购自Burdick&Jackson(Honeywell，USA)，水由Mili-Q超纯水仪制备。
2、色谱条件与实施例1相同。
3、对照品溶液的制备
取丹酚酸D分离产物(自制)适量，精密称定，加水制成每1ml含丹酚酸D分离产物0.35mg的对照品贮备液。精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液。
4、线性及范围
按3中步骤制备7个不同浓度的标准曲线对照品溶液，分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪，用已确定的液相方法测定峰面积，同时用面积归一化法估算纯度，取7个浓度等级的对照品溶液的纯度平均值计算丹酚酸D的真实浓度。以丹酚酸D浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表20。结果表明，丹酚酸D在标准曲线的范围内呈良好的线性(R2>0.9995)。
表20 丹酚酸D的标准曲线
实施例4其他酚酸类化合物的含量测定
(1)定量计算方法的建立
以丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、原儿茶酸、紫草酸、咖啡酸、异阿魏酸和丹酚酸D九种主要成分作为参照物，结合的丹参注射液指纹图谱(见图1)，通过与参照物的紫外光谱比较，将丹参注射液中酚酸类物质进行分类，如目标物质与某一参照物具有相似的光谱行为，则可用该参照物的标准曲线对目标物质的含量进行估算，其中一些目标物质及其对应参照物的紫外光谱见图2、图3和图4，目标物质及对应参照物及其标准曲线见表21。
表21
需要注意的是，上表中列出的标准曲线公式其横坐标x均以μg/ml为单位。而吸光度公式A＝εlc中，物质浓度c以mol/L为单位。因此用高效液相色谱联用电喷雾离子阱质谱的方法确定目标物质的分子量，以进行质量浓度和摩尔浓度之间的换算并最终估算目标物质的含量，具体计算过程如下：
公式(1)为参照物标准曲线，其中x1以μg/ml为单位：
y＝ax1+b (1)
假设M1为参照物摩尔质量，则有
设则公式(2)可写成
y＝M1*a*x1'+b (3)
其中x1'以10-3mol/L为单位，公式(3)为参照物摩尔浓度标准曲线，可以此为依据，根据目标物质的峰面积，估算其摩尔浓度，公式如下
其中x'2为目标物质摩尔浓度，以10-3mol/L为单位，乘以目标物质分子量M2即得其质量浓度
公式(5)中x2为目标物质质量浓度，以μg/ml为单位。
(2)供试品溶液的制备
取丹参注射液加水稀释5倍，即得。
(3)其他酚酸类化合物含量测定
本试验对10个批次的丹参注射液样品进行了其它成分的含量估算，结果见表22。结果表明，各目标物质的含量稳定，7种酚酸类物质含量的平均值为8.41mg/瓶。
表22
Claims (1)
1.一种丹参注射液中丹酚酸类痕量成分含量的测定方法，其特征在于包括下列步骤：
(a)采用HPLC法建立对照指纹图谱；
(b)采用HPLC法对步骤(a)所得对照指纹图谱的色谱峰进行指认，并将指纹峰对应的物质作为参照物；
(c)结合对照指纹图谱，通过与参照物的紫外吸收光谱行为的相似性，对各个色谱峰对应的组织进行分类，确认目标物质及其对应参照物；
(d)采用HPLC法建立参照物标准曲线，其标准曲线方程是y＝ax1+b；
(e)采用下述公式估算目标物质含量：公式(1)为参照物标准曲线，其中x1为浓度，以μg/ml为单位，
y＝ax1+b 公式(1)
假设M1为参照物摩尔质量，则有
设则公式(2)可写成
y＝M1*a*x′1+b 公式(3)
其中x′1以10-3mol/L为单位，公式(3)为参照物摩尔浓度标准曲线，可以此为依据，根据目标物质的峰面积，估算其摩尔浓度，公式如下
其中x’2为目标物质摩尔浓度，以10-3mol/L为单位，乘以目标物质分子量M2即得其质量浓度
公式(5)中x2为目标物质质量浓度，以μg/ml为单位；其中，所述参照物选自丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、原儿茶酸、紫草酸、咖啡酸、异阿魏酸、丹酚酸D，
其中，步骤(a)～(d)中丹参注射液供试品溶液按照如下方法制备：取丹参注射液加水稀释5倍，或用PVDF亲水滤膜过滤或离心后加水稀释5倍，即得，
其中，步骤(a)所述的对照指纹图谱按照下列方法建立，对照品溶液的制备：取丹参注射液加水稀释5倍，备用；对照指纹图谱的测定：吸取上述对照品溶液注入液相色谱仪，使用HPLC法进行测定，得到丹参注射液对照指纹图谱，色谱条件：色谱柱为ShiseidoCapcellpak MG C18柱并用Shiseido MG C18柱保护，流动相为乙腈-0.03％磷酸水溶液，检测波长为286nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，梯度洗脱程序如下：0～30分钟，6％乙腈→20％乙腈，94％的0.03％磷酸水溶液→80％的0.03％磷酸水溶液；30～40分钟，20％乙腈，80％的0.03％磷酸水溶液；40～60分钟，20％乙腈→30％乙腈，80％的0.03％磷酸水溶液→70％的0.03％磷酸水溶液；60～70分钟，30％乙腈→50％乙腈，70％的0.03％磷酸水溶液→50％的0.03％磷酸水溶液；70～80分钟，50％乙腈→80％乙腈，50％的0.03％磷酸水溶液→20％的0.03％磷酸水溶液，其中0.03％为磷酸与水的体积百分比；
其中，步骤(d)中所述参照物标准曲线按照如下方法建立，参照物标准曲线对照品溶液的制备丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B对照品贮备液：分别精密称取3mg原儿茶醛对照品和2mg迷迭香酸对照品，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液；分别精密称取7.2mg丹参素钠对照品和2.90mg丹酚酸B对照品，置于5ml容量瓶中，精密量取1ml原儿茶醛、迷迭香酸对照品母液置于此容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得含1.44mg/ml丹参素钠、0.58mg/ml丹酚酸B、0.30mg/ml原儿茶醛和0.20mg/ml迷迭香酸的对照品贮备液；丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；咖啡酸和异阿魏酸对照品贮备液：分别精密称取2.8mg咖啡酸对照品和1.2mg异阿魏酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取250μl所配溶液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含28μg/ml咖啡酸、12μg/ml异阿魏酸的对照品贮备液；咖啡酸和异阿魏酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；原儿茶酸和紫草酸对照品贮备液：精密称取1.2mg原儿茶酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得原儿茶酸对照品母液，精密称取1.4mg紫草酸对照品，置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得紫草酸对照品母液；精密量取0.25ml原儿茶酸对照品母液和1.25ml紫草酸对照品母液置于5ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得含12μg/ml原儿茶酸、70μg/ml紫草酸的对照品贮备液；原儿茶酸和紫草酸标准曲线对照品溶液：精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，分别置于2ml容量瓶中，加50％甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；或，还包括取丹酚酸D分离产物适量，精密称定，加水制成每1ml含丹酚酸D分离产物0.35mg的对照品贮备液；精密量取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.0ml对照品贮备液，置于2ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀制得7个浓度等级的标曲对照品溶液；标准曲线的绘制取7个不同浓度的标准曲线对照品溶液，分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，每个浓度的对照品溶液重复配置测定3次，将3次结果平均得到最终的标准曲线；色谱条件：色谱柱为Shiseido Capcell pakMG C18柱并用Shiseido MG C18柱保护，流动相为乙腈-0.03％磷酸水溶液，检测波长为286nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，梯度洗脱程序如下：0～30分钟，6％乙腈→20％乙腈，94％的0.03％磷酸水溶液→80％的0.03％磷酸水溶液；30～40分钟，20％乙腈，80％的0.03％磷酸水溶液；40～60分钟，20％乙腈→30％乙腈，80％的0.03％磷酸水溶液→70％的0.03％磷酸水溶液；60～70分钟，30％乙腈→50％乙腈，70％的0.03％磷酸水溶液→50％的0.03％磷酸水溶液；70～80分钟，50％乙腈→80％乙腈，50％的0.03％磷酸水溶液→20％的0.03％磷酸水溶液，其中0.03％为磷酸与水的体积百分比；系统适应性条件：分离度大于1.5，色谱峰理论塔板数不小于30000，对称因子在0.9～1.1之间。
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