CN101949899B - 藁本内酯的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
藁本内酯的定量检测方法。以丁苯酞为替代对照品，采用高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比(30～70)∶(70～30)的甲醇-水或(30～60)∶(70～40)的乙腈-水为流动相，检测波长为208～334nm，分别测定被测样品中藁本内酯和替代对照品丁苯酞的峰面积A和Ai，根据丁苯酞的浓度Ci，用校正因子f按下述公式计算被测成分藁本内酯的浓度C，其中校正因子f＝0.8572～1.3283。实验结果表明，采用本发明方法与以新鲜制备的藁本内酯对照品对藁本内酯含量的检测结果一致，检测结果稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种以替代对照品对藁本内酯成分进行定量检测的方法。
背景技术
对照品是药品质量评价和监督检验工作的关键。在实际工作中，因有些对照品本身价格昂贵，检验成本很高，而有些对照品又由于不稳定而无法提供，这些都影响了对药品含量的测定，导致药品质量难以控制，是影响药品质量的评价和监督检验的一个重要因素。
藁本内酯是常用中药当归、川芎等挥发油的主要有效成分。藁本内酯纯品由于其稳定性差，不能作为国家法定含量测定用对照品对藁本内酯进行定量检测。
为解决类似问题，谢元超等人在“替代对照品法用于丹参和复方丹参片含量测定的研究”中曾提出了一种采用替代对照品进行含量测定的方法(药物分析杂志，2007，27(4)：497)。其基本原理是，采用测定替代对照品相对于对照品的“相对校正因子”的方法，即用由真实对照品与替代对照品检测得到“相对校正因子”(f)：
然后用替代对照品结合校正因子对被测样品成分的含量进行检测的方法进行药品质量控制。上述式中Ai为替代对照品的峰面积；Ar为真实对照品的峰面积；Ci为替代对照品的浓度；Cr为真实对照品的浓度。该方法用于检测丹参和复方丹参片中丹酚酸B含量时，采用高效液相色谱方法，分别配制一定浓度的真实对照品和替代对照品的溶液，在一定的色谱条件下，以进样量为横坐标，以峰面积A为纵坐标，分别测定二者的标准曲线，将标准曲线的截距校正为0后，用两条标准曲线斜率K的比值求得校正因子(f)。实际测定样品时，即可用替代对照品进行测定，被测成分浓度C：
式中A为被测成分峰面积，由被测成分的浓度即可计算出该成分在被测样品中的含量。该研究结果还表明，在该方法用于检测丹参和复方丹参片中丹酚酸B含量时，校正因子(f)一般可不受色谱仪器、流动相条件及被测物溶液配制浓度等因素的影响，具有进一步研究和探索的价值。
发明内容
针对上述情况，本发明经进一步研究和试验，提供一种以替代对照品进行藁本内酯的定量检测方法，以解决由于藁本内酯纯品稳定性差不能作为国家法定含量测定用对照品对藁本内酯进行定量检测的问题，实现对含藁本内酯成分药物的定量化检测和监控，保证药品质量。
经本发明人的研究发现，丁苯酞(butylphthalide)(式Ⅱ)与藁本内酯(ligustilide)(式Ⅰ)均属于苯酞内酯类成分，具有相似的化学结构、理化性质和色谱行为，且丁苯酞的结构稳定，已是国家法定的对照品，容易获得，价格低廉，因此，以丁苯酞作为藁本内酯的替代对照品是合适的。
本发明的藁本内酯定量检测方法，是以丁苯酞为替代对照品，采用高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比(30～70)∶(70～30)的甲醇-水或(30～60)∶(70～40)乙腈-水为流动相，检测波长为208～334nm，分别测定被测样品中藁本内酯和替代对照品丁苯酞的峰面积A和Ai，根据丁苯酞的浓度Ci，用校正因子f按下述公式计算被测成分藁本内酯的浓度C：
其中，校正因子f＝0.8572～1.3283。
在上述方法基础上，进一步的深入的研究还发现，本发明上述检测方法中优选方式有：
流动相溶剂采用为所说的甲醇-水时，藁本内酯的检测波长可为208～334nm，丁苯酞的检测波长可为228±4nm，校正因子f＝0.8776～1.3283。例如：
流动相溶剂采用体积比为50∶50的甲醇-水，藁本内酯检测波长为330nm，丁苯酞检测波长为228nm时，校正因子为f＝1.0887；
流动相溶剂采用体积比为30∶70的甲醇-水，藁本内酯的检测波长为280nm，丁苯酞的检测波长为228nm时，校正因子为f＝1.3283。
流动相溶剂采用为所说的乙腈-水时，藁本内酯的检测波长可以为208～334nm，丁苯酞的检测波长可以为228±4nm，校正因子f＝0.8572～1.3009。例如：
流动相溶剂采用为体积比40∶60的乙腈-水，藁本内酯的检测波长为330nm，丁苯酞的检测波长为228nm时，校正因子f＝1.0811；
流动相溶剂采用为体积比的30∶70乙腈-水，藁本内酯检测波长为280nm，丁苯酞检测波长为228nm时，校正因子为f＝1.3009。
大量的实验结果验证表明，对含藁本内酯成分样品的含量，采用本发明上述方法与以新鲜制备的藁本内酯为对照品的方法检测结果一致，检测结果稳定。
以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。
具体实施方式
实施例1 川芎药材中藁本内酯成分的定量检测
按照中国药典2010年版一部附录Ⅵ D规定的高效液相色谱法测定。
1.1 色谱条件和系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(50∶50)为流动相；流速为1.0ml/ml；柱温为35℃，藁本内酯检测波长为330nm，丁苯酞检测波长为228nm；理论板数按藁本内酯峰计算应不低于3000。
1.2 溶液的配制
对照品溶液配制 精密称取新鲜制备的藁本内酯对照品11.27mg(以藁本内酯计)，置25ml量瓶，用无水乙醇溶解并定量稀释制成每ml中含藁本内酯45.08μg的对照品溶液。精密称取替代对照品丁苯酞10.36mg，置25ml量瓶，用无水乙醇溶解并定量稀释制成每ml中含丁苯酞41.44μg的替代对照品溶液。
供试品溶液的配制 取川芎药材粉末(过四号筛)约0.2g，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇约45ml，超声处理(功率100W，频率40kHz)30分钟，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.3 线性关系考察
取上述藁本内酯对照品溶液(0.04508mg/ml)和丁苯酞替代对照品溶液(0.04144mg/ml)，按“1.1”项下色谱条件用自动进样器分别进样1、2、4、6、8、10μl，以进样量X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，分别测定对照品和替代对照品的标准曲线。结果表明，藁本内酯进样量X(μg)在0.04508～0.4508μg范围内与其峰面积Y线性关系良好，回归方程为：Y＝2694.25X+2.24，r＝0.9999。丁苯酞进样量X(μg)在0.04144～0.4144μg范围内与其峰面积Y线性关系良好，回归方程为：Y＝2947.41X-2.03，r＝0.9999。
1.4 校正因子f值测定
将上述标准曲线的截距校正为0后，得到标准曲线斜率K，替代对照品与对照品标准曲线的斜率K值之比即得校正因子f＝1.0887。
1.5 f 值测定方法的耐用性考察
1.5.1 仪器波长对f值测定的影响
在液相色谱仪上分别在334、332、330、328、326nm波长处测定对照品藁本内酯标准曲线的斜率K；在232、230、228、226、224nm波长处分别测定替代对照品丁苯酞标准曲线的斜率K，计算校正因子见表1。结果表明在同一台高效液相色谱仪上，测定波长在规定波长处变化±2nm或±4nm，对f影响不大，RSD为0.56％。
表1 仪器波长对f值测定的影响
1.5.2 仪器流速对f值测定的影响
用同一台液相色谱仪，分别在0.98、1.0、1.02ml/min测定对照品藁本内酯及其替代对照品丁苯酞标准曲线的斜率K，计算f，考察流速变化0.02ml/min对f值的影响。进一步测定在0.9、1.1ml/min流速下藁本内酯和丁苯酞标准曲线的斜率K，计算f，考察流速进一步变化0.1ml/min对f值的影响。结果见表2，表明在同一台高效液相色谱仪上，流速变化对f影响不大，RSD为0.76％。
表2 仪器流速对f值测定的影响
1.5.3 仪器柱温对f值测定的影响
用同一台液相色谱仪，分别在33、34、35、36、37℃测定对照品藁本内酯和替代对照品丁苯酞标准曲线的斜率K，计算f。结果见表3，表明在同一台高效液相色谱仪上，柱温变化对f影响不大，RSD为0.69％。
表3 仪器柱温对f值测定的影响
1.5.4 流动相组成比例对f值测定的影响
用同一台液相色谱仪，在流动相以甲醇-水的比例为表4时，分别测定对照品藁本内酯和替代对照品丁苯酞标准曲线的斜率K，计算f。结果见表4，表明在同一台高效液相色谱仪上，流动相比例变化引起的保留时间变化对f影响不大，RSD为0.42％。
表4 流动相组成比例对f值测定的影响
1.5.5 不同品牌或不同批号的同类型色谱柱对f值测定的影响
用同一台液相色谱仪，分别用不同品牌或不同批号的同类型色谱柱，测定对照品藁本内酯和替代对照品丁苯酞标准曲线的斜率K，计算f。结果见表5，表明在同一台高效液相色谱仪上，更换色谱柱(长短不同、厂家不同和新旧不同)对f影响不大，RSD为1.49％。
表5 不同品牌或不同批号的同类型色谱柱对f值测定的影响
1.5.6 不同液相色谱仪对f值测定的影响
用Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)色谱柱，柱号：USKH051741，分别在3台高效液相色谱仪：Waters1525-2487，Agilent1200，Agilent1100上测定，计算f。结果见表6，表明高效液相色谱仪的变化对f影响不大，RSD为0.41％。
表6 不同液相色谱仪对f值测定的影响
1.6 精密度实验
取“1.2”项下含藁本内酯对照品(0.04508mg/ml)与含丁苯酞替代对照品(0.04144mg/ml)的溶液，在“1.1”项色谱条件下，重复进样6次，记录藁本内酯和丁苯酞的峰面积，测定结果表明RSD分别为0.89％和1.15％。
1.7 重复性试验
取同一批药材样品，按“1.2”项下供试品溶液配制方法操作，平行测定6份，计算藁本内酯的含量为0.83％，RSD为1.24％。
1.8 回收率试验
精密称取藁本内酯对照品适量，加无水乙醇溶解并定量稀释成浓度为0.032mg/ml、0.04mg/ml、0.048mg/ml的溶液各3份；精密称取替代对照品丁苯酞适量，用无水乙醇溶解并定量稀释制成每ml中含丁苯酞40μg的替代对照品溶液各2份；采用替代对照品进行含量测定，计算回收率。其平均回收率为99.4％。
1.9 样品溶液稳定性考察
取“1.7”项下药材提取液1份，精密吸取5μl，分别在0、2、4、8、24h进行测定，记录峰面积，结果表明川芎药材样品溶液在24h内稳定性良好，RSD为0.75％。
1.10 样品含量测定
1.10.1 用替代对照品测定川芎中藁本内酯含量
取5批川芎药材样品，按“1.2”项下供试品溶液配制方法操作制成供试品溶液。在“1.1”项色谱条件下，精密吸取供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，在330nm处检测记录色谱图。精密吸取丁苯酞替代对照品溶液(0.04144mg/ml)5μl，注入液相色谱仪，在228nm处检测记录色谱图。按外标法进行计算，所得结果乘以f1.0887得到藁本内酯含量。结果见表7。
表7 丁苯酞替代对照品测定川芎药材中藁本内酯的含量(n＝3)
1.10.2 用对照品测定川芎中藁本内酯含量
在“1.10.1”测定的同时，精密吸取藁本内酯对照品溶液(0.04508mg/ml)5μl，注入液相色谱仪，在330nm处检测记录色谱图。按外标法计算藁本内酯的含量。结果见表8。
表8 藁本内酯对照品测定川芎药材中藁本内酯的含量(n＝3)
实施例2 当归药材中藁本内酯成分的定量检测
照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ D)测定。
2.1 色谱条件和系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(30∶70)为流动相；流速为1.5ml/ml；柱温为40℃，藁本内酯检测波长为280nm，丁苯酞检测波长为228nm；理论板数按藁本内酯峰计算应不低于3000。
2.2 溶液的配制 同实施例1。
2.3 线性关系考察
取上述藁本内酯对照品溶液(0.04508mg/ml)和丁苯酞替代对照品溶液(0.04144mg/ml)，按“2.1”项下色谱条件用自动进样器分别进样1、2、4、6、8、10μl，以进样量X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，分别测定对照品和替代对照品的标准曲线。结果表明，藁本内酯进样量X(μg)在0.04508～0.4508μg范围内与其峰面积Y线性关系良好，回归方程为：Y＝2201.35X+4.17，r＝0.9999。丁苯酞进样量X(μg)在0.04144～0.4144μg范围内与其峰面积Y线性关系良好，回归方程为：Y＝2947.41X-2.03，r＝0.9999。
2.4 f值测定方法
将上述标准曲线的截距校正为0后，得到标准曲线斜率K，替代对照品与对照品标准曲线斜率K值之比即得校正因子f＝1.3283。
2.5 精密度实验
取“2.2”项下含藁本内酯对照品(0.04508mg/ml)与含丁苯酞替代对照品(0.04144mg/ml)的溶液，在“2.1”项色谱条件下，重复进样6次，记录藁本内酯和丁苯酞的峰面积，测定结果表明RSD分别为0.95％和1.26％。
2.7 重复性试验
取同一批药材样品，按“2.2”项下供试品溶液配制方法操作，平行测定6份，计算藁本内酯的含量为0.93％，RSD为1.63％。
2.8 回收率试验
精密称取藁本内酯对照品适量，加无水乙醇溶解并定量稀释成浓度为0.032mg/ml、0.04mg/ml、0.048mg/ml的溶液各3份；精密称取替代对照品丁苯酞适量，用无水乙醇溶解并定量稀释制成每ml中含丁苯酞40μg的替代对照品溶液各2份；采用替代对照品进行含量测定，计算回收率。其平均回收率为99.5％。
2.9 样品溶液稳定性考察
取“2.7”项下药材提取液1份，精密吸取5μl，分别在0、2、4、8、24h进行测定，记录峰面积，结果表明当归药材样品溶液在24h内稳定性良好，RSD为0.86％。
2.10 样品含量测定
2.10.1 用替代对照品测定川芎中藁本内酯含量
取5批川芎药材样品，按“2.2”项下供试品溶液配制方法操作制成供试品溶液。在“2.1”项色谱条件下，精密吸取供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，在280nm处检测记录色谱图。精密吸取丁苯酞替代对照品溶液(0.04144mg/ml)5μl，注入液相色谱仪，在228nm处检测记录色谱图。按外标法进行计算，所得结果乘以f1.3283得到藁本内酯含量。结果见表9。
表9 丁苯酞替代对照品测定当归药材中藁本内酯的含量(n＝3)
2.10.2 用对照品测定川芎中藁本内酯含量
在“2.10.1”测定的同时，精密吸取藁本内酯对照品溶液(0.04508mg/ml)5μl，注入液相色谱仪，在280nm处检测记录色谱图。按外标法计算藁本内酯的含量。结果见表10。
表10 藁本内酯对照品测定当归药材中藁本内酯的含量(n＝3)
实施例3 川芎地上部分挥发油中藁本内酯成分的定量检测
照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ D)测定。
3.1 色谱条件和系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(70∶30)为流动相；流速为0.6ml/ml；柱温为15℃，藁本内酯检测波长为208nm，丁苯酞检测波长为228nm；理论板数按藁本内酯峰计算应不低于3000。
3.2 溶液的配制
对照品溶液配制 同实施例1。
供试品溶液的配制 取川芎油约0.1g，精密称定，置50ml量瓶中，加无水乙醇约45ml，超声处理(功率100W，频率40kHz)10分钟，放冷，加无水乙醇至刻度，摇匀，取1ml置10ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.3 线性关系考察
取上述藁本内酯对照品溶液(0.04508mg/ml)和丁苯酞替代对照品溶液(0.04144mg/ml)，按“3.1”项下色谱条件用自动进样器分别进样1、2、4、6、8、10μl，以进样量X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，分别测定对照品和替代对照品的标准曲线。结果表明，藁本内酯进样量X(μg)在0.04508～0.4508μg范围内与其峰面积Y线性关系良好，回归方程为：Y＝3227.42X+25.68，r＝0.9999。丁苯酞进样量X(μg)在0.04144～0.4144μg范围内与其峰面积Y线性关系良好，回归方程为：Y＝2905.80X-1.6，r＝0.9999。
3.4 f值测定方法
将上述标准曲线的截距校正为0后，得到标准曲线斜率K，替代对照品与对照品标准曲线斜率K值之比即得校正因子f＝0.8776。
3.5 样品含量测定
3.5.1 用替代对照品测定川芎油中藁本内酯含量
取3批川芎油样品，按“3.2”项下供试品溶液配制方法操作制成供试品溶液。在“3.1”项色谱条件下，精密吸取供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，在208nm处检测记录色谱图。精密吸取丁苯酞替代对照品溶液(0.04144mg/ml)5μl，注入液相色谱仪，在228nm处检测记录色谱图。按外标法进行计算，所得结果乘以f0.8776得到藁本内酯含量。结果见表11。
表11 丁苯酞替代对照品测定川芎油中藁本内酯的含量(n＝3)
3.5.2 用对照品测定川芎油中藁本内酯含量
在“3.4.1”测定的同时，精密吸取藁本内酯对照品溶液(0.04508mg/ml)5μl，注入液相色谱仪，在208nm处检测记录色谱图。按外标法计算藁本内酯的含量。结果见表12。
表12 藁本内酯对照品测定川芎油中藁本内酯的含量(n＝3)
实施例4 当归油中藁本内酯成分的定量检测
照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ D)测定。
4.1 色谱条件和系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(40∶60)为流动相；流速为1.0ml/ml；柱温为35℃，藁本内酯检测波长为330nm，丁苯酞检测波长为228nm；理论板数按藁本内酯峰计算应不低于3000。
4.2 溶液的配制
对照品溶液配制 同实施例1。
供试品溶液的配制 同实施例3。
4.3 线性关系考察
取上述藁本内酯对照品溶液(0.04508mg/ml)和丁苯酞替代对照品溶液(0.04144mg/ml)，按“4.1”项下色谱条件用自动进样器分别进样1、2、4、6、8、10μl，以进样量X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，分别测定对照品和替代对照品的标准曲线。结果表明，藁本内酯进样量X(μg)在0.04508～0.4508μg范围内与其峰面积Y线性关系良好，回归方程为：Y＝2731.19X+2.97，r＝0.9999。丁苯酞进样量X(μg)在0.04144～0.4144μg范围内与其峰面积Y线性关系良好，回归方程为：Y＝2962.49X-4.55，r＝0.9999。
4.4 f值测定方法
将上述标准曲线的截距校正为0后，得到标准曲线斜率K，替代对照品与对照品标准曲线斜率K值之比即得校正因子f＝1.0811。
4.5 仪器波长对f值测定的影响
在液相色谱仪上分别在334、332、330、328、326nm波长处测定对照品藁本内酯标准曲线的斜率K；在32、230、228、226、224nm波长处分别测定替代对照品丁苯酞标准曲线的斜率K，计算校正因子见表13。结果表明在同一台高效液相色谱仪上，测定波长在规定波长处变化±2nm或±4nm，对f影响不大，RSD为0.72％。
表13 仪器波长对f值测定的影响
4.6 流动相组成比例对f值测定的影响
用同一台液相色谱仪，在流动相以乙腈-水的比例为表14时，分别测定对照品藁本内酯和替代对照品丁苯酞标准曲线的斜率K，计算f。结果见表14，表明在同一台高效液相色谱仪上，流动相比例变化引起的保留时间变化对f影响不大，RSD为0.53％。
表14 流动相组成比例对f值测定的影响
4.7 样品含量测定
4.7.1 用替代对照品测定当归油中藁本内酯含量
取3批当归油样品，按“4.2”项下供试品溶液配制方法操作制成供试品溶液。在“4.1”项色谱条件下，精密吸取供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，在330nm处检测记录色谱图。精密吸取丁苯酞替代对照品溶液(0.04144mg/ml)5μl，注入液相色谱仪，在228nm处检测记录色谱图。按外标法进行计算，所得结果乘以f1.0811得到藁本内酯含量。结果见表15。
表15 丁苯酞替代对照品测定当归油中藁本内酯的含量(n＝3)
4.7.2 用对照品测定当归油中藁本内酯含量
在“4.7.1”测定的同时，精密吸取藁本内酯对照品溶液(0.04508mg/ml)5μl，注入液相色谱仪，在330nm处检测记录色谱图。按外标法计算藁本内酯的含量。结果见表16。
表16 藁本内酯对照品测定当归油中藁本内酯的含量(n＝3)
实施例5 川芎根茎油中藁本内酯成分的定量检测
照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ D)测定。
5.1 色谱条件和系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(30∶70)为流动相；流速为1.5ml/ml；柱温为40℃，藁本内酯检测波长为280nm，丁苯酞检测波长为228nm；理论板数按藁本内酯峰计算应不低于3000。
5.2 溶液的配制
对照品溶液配制 同实施例1。
供试品溶液的配制 同实施例3。
5.3线性关系考察
取上述藁本内酯对照品溶液(0.04508mg/ml)和丁苯酞替代对照品溶液(0.04144mg/ml)，按“5.1”项下色谱条件用自动进样器分别进样1、2、4、6、8、10μl，以进样量X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，分别测定对照品和替代对照品的标准曲线。结果表明，藁本内酯进样量X(μg)在0.04508～0.4508μg范围内与其峰面积Y线性关系良好，回归方程为：Y＝2243.18X-1.20，r＝0.9999。丁苯酞进样量X(μg)在0.04144～0.4144μg范围内与其峰面积Y线性关系良好，回归方程为：Y＝2908.58X+1.49，r＝0.9999。
5.4 f值测定方法
将上述标准曲线的截距校正为0后，得到标准曲线斜率K，替代对照品与对照品标准曲线斜率K值之比即得校正因子f＝1.3009。
5.5 样品含量测定
5.5.1 用替代对照品测定川芎油中藁本内酯含量
取3批川芎油样品，按“5.2”项下供试品溶液配制方法操作制成供试品溶液。在“5.1”项色谱条件下，精密吸取供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，在280nm处检测记录色谱图。精密吸取丁苯酞替代对照品溶液(0.04144mg/ml)5μl，注入液相色谱仪，在228nm处检测记录色谱图。按外标法进行计算，所得结果乘以f1.3009得到藁本内酯含量。结果见表17。
表17 丁苯酞替代对照品测定川芎油中藁本内酯的含量(n＝3)
5.5.2 用对照品测定川芎油中藁本内酯含量
在“5.5.1”测定的同时，精密吸取藁本内酯对照品溶液(0.04508mg/ml)5μl，注入液相色谱仪，在280nm处检测记录色谱图。按外标法计算藁本内酯的含量。结果见表18。
表18 藁本内酯对照品测定川芎油中藁本内酯的含量(n＝3)
实施例6 当归油中藁本内酯成分的定量检测
照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录Ⅵ D)测定。
6.1 色谱条件和系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(60∶40)为流动相；流速为0.6ml/ml；柱温为15℃，藁本内酯检测波长为208nm，丁苯酞检测波长为228nm；理论板数按藁本内酯峰计算应不低于3000。
6.2 溶液的配制
对照品溶液配制 同实施例1。
供试品溶液的配制 同实施例4。
6.3 线性关系考察
取上述藁本内酯对照品溶液(0.04508mg/ml)和丁苯酞替代对照品溶液(0.04144mg/ml)，按“6.1”项下色谱条件用自动进样器分别进样1、2、4、6、8、10μl，以进样量X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，分别测定对照品和替代对照品的标准曲线。结果表明，藁本内酯进样量X(μg)在0.04508～0.4508μg范围内与其峰面积Y线性关系良好，回归方程为：Y＝3437.21X+2.27，r＝0.9999。丁苯酞进样量X(μg)在0.04144～0.4144μg范围内与其峰面积Y线性关系良好，回归方程为：Y＝2944.64X+2.28，r＝0.9999。
6.4 f值测定方法
将上述标准曲线的截距校正为0后，得到标准曲线斜率K，替代对照品与对照品标准曲线斜率K值之比即得校正因子f＝0.8572。
6.5 样品含量测定
6.5.1 用替代对照品测定当归油中藁本内酯含量
取3批当归油样品，按“6.2”项下供试品溶液配制方法操作制成供试品溶液。在“6.1”项色谱条件下，精密吸取供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，在208nm处检测记录色谱图。精密吸取丁苯酞替代对照品溶液(0.04144mg/ml)5μl，注入液相色谱仪，在228nm处检测记录色谱图。按外标法进行计算，所得结果乘以f0.8572得到藁本内酯含量。结果见表19。
表19 丁苯酞替代对照品测定当归油中藁本内酯的含量(n＝3)
6.5.2 用对照品测定川芎油中藁本内酯含量
在“6.4.1”测定的同时，精密吸取藁本内酯对照品溶液(0.04508mg/ml)5μl，注入液相色谱仪，在208nm处检测记录色谱图。按外标法计算藁本内酯的含量。结果见表20。
表20 藁本内酯对照品测定当归油中藁本内酯的含量(n＝3)
上述研究结果显示，以丁苯酞替代对照品，结合校正因子的方法测定藁本内酯的含量，与以新鲜制备的藁本内酯对照品测定藁本内酯的含量，二者结果相同(见表7～8；表9～10；表11～12；表15～16；表17～18；表19～20)，检测结果稳定。
Claims (6)
1.藁本内酯的定量检测方法，其特征是以丁苯酞为替代对照品，采用高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比(30～70)∶(70～30)的甲醇-水为流动相，检测波长为224～334nm，分别测定被测样品中藁本内酯和替代对照品丁苯酞的峰面积A和Ai，根据丁苯酞的浓度Ci，用校正因子f按下述公式计算被测成分藁本内酯的浓度C：
其中，藁本内酯的检测波长为280～334nm，丁苯酞的检测波长为228±4nm，校正因子f＝1.0633～1.3283，校正因子f按下式计算得到：
式中Ar为真实对照品的峰面积，Cr为真实对照品的浓度。
2.如权利要求1所述的藁本内酯的定量检测方法，其特征是所说的流动相溶剂为50∶50的甲醇-水，藁本内酯的检测波长为330nm，丁苯酞的检测波长为228nm，校正因子f＝1.0887。
3.如权利要求1所述的藁本内酯的定量检测方法，其特征是所说的流动相溶剂为30∶70的甲醇-水，藁本内酯的检测波长为280nm，丁苯酞的检测波长为228nm，校正因子f＝1.3283。
4.藁本内酯的定量检测方法，其特征是以丁苯酞为替代对照品，采用高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比(30～60)∶(70～40)的乙腈-水为流动相，检测波长为224～334nm，分别测定被测样品中藁本内酯和替代对照品丁苯酞的峰面积A和Ai，根据丁苯酞的浓度Ci，用校正因子f按下述公式计算被测成分藁本内酯的浓度C：
其中，藁本内酯的检测波长为280～334nm，丁苯酞的检测波长为228±4nm，校正因子f＝1.0702～1.3009，校正因子f按下式计算得到：
式中Ar为真实对照品的峰面积，Cr为真实对照品的浓度。
5.如权利要求4所述的藁本内酯的定量检测方法，其特征是所说的流动相溶剂为40∶60的乙腈-水，藁本内酯的检测波长为330nm，丁苯酞的检测波长为228nm，校正因子f＝1.0811。
6.如权利要求4所述的藁本内酯的定量检测方法，其特征是所说的流动相溶剂为30∶70的乙腈-水，藁本内酯的检测波长为280nm，丁苯酞的检测波长为228nm，校正因子f＝1.3009。
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