CN102809619B - 当归油中藁本内酯的测定方法 - Google Patents
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Abstract
天然药物制剂中藁本内酯的测定方法，以藁本内酯的水解产物2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸为对照品，测定天然药物制剂中藁本内酯的含量，使藁本内酯制剂在含有碱金属氢氧化物的乙腈水溶液中充分水解，再利用高效液相色谱，测定样品中的2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸含量，再按照摩尔比1:1的比例换算成藁本内酯的含量。本发明的方法稳定性好、成本低廉，能够简便、准确地测定天然药物制剂中藁本内酯的含量。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，尤其是一种当归油中藁本内酯的测定方法。
背景技术
藁本内酯是中药当归、川芎中的重要活性成份之一，其是具淡黄色带香味的油状液体，沸点为168~169℃，可溶于乙醇、甲醇、乙醚、乙酸乙酯、石油醚等有机溶剂，分子式为 C12H14O2 ,相对分子质量为190.24，其结构式如下：
。
藁本内酯的化学结构为不饱和的苯酞结构，3位上有活泼的丁烯基，均为化学不稳定性因素，容易发生多种异构化反应。
目前，含有藁本内酯的天然药物制剂中藁本内酯的含量测定方法主要有HPLC和GC方法，蒋伟，王长虹等人公开了一种利用HPLC对当归提取物中藁本内酯进行定量分析的方法（当归提取物的制备工艺及其质量控制，《华西药学杂志》，2010，25（1）：87~89），采用C18色谱柱，以磷酸水溶液-乙腈二元系统为流动相进行梯度洗脱，流速1.0mL*min-1，检测波长350nm，以藁本内酯纯品作为对照，采用外标法测定样品中的藁本内酯含量。
李桂生，马成俊等人研究发现（藁本内酯的稳定性研究及异构化产物的GC-MS分析，《中草药》，2000，31（6）：405~407），藁本内酯纯品于室温条件下保存可生成多种异构化产物，其主要产物有8种，占异构化产物的90.81%。而藁本内酯在挥发油中基本稳定，不会出现纯品状态下的异构化反应。
现有的藁本内酯测定方法需要以藁本内酯纯品为对照品，由于藁本内酯纯品稳定性极差，极易异构化为其他结构相近的苯酞类化合物，因此不能作为国家法定含量测定用对照品对藁本内酯进行定量检测，往往需要自行提取、纯化，并且难以长期保存，给测定工作带来极大的不变，增加了检测的难度和成本。目前缺少一种操作简便、稳定、成本低廉的藁本内酯测定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定性好、成本低廉的藁本内酯的测定方法，能够简便、准确地测定当归油中藁本内酯的含量。
为实现本发明目的，本发明人所采用的技术方案为：
当归油中藁本内酯的测定方法，其包括以下步骤：
（a）称取含有藁本内酯的当归油或当归油软胶囊内容物，加入到含有碱金属氢氧化物的乙腈水溶液中，摇匀后于20~30℃下放置1~3天，加入盐酸调节pH至中性，加入乙腈水溶液定容，摇匀后过滤，续滤液为供试品溶液；
（b）称取2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸，加甲醇配制成对照品溶液，所述对照品溶液中2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的含量为0.05~0.4mg/mL；
（c）采用高效液相色谱法分别测定对照品溶液和供试品溶液，色谱条件为：采用以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱，以乙腈/水溶液或甲醇/水溶液作为流动相，流动相的流速为0.5 ~2 mL/min，检测波长为285nm，柱温为20~40℃，以外标法计算供试品溶液中2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的含量，按照藁本内酯与2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的摩尔比1:1的比例，换算得到藁本内酯的含量。
本发明所述碱金属氢氧化物最好为氢氧化钠或氢氧化钾，如此水解反应更加迅速和充分。
c步骤所述乙腈/水溶液其体积比为20~45：80—55；甲醇/水溶液的体积比为40~65:60~35；所述乙腈水溶液或甲醇水溶液的pH值控制在2~7；调节pH值时，可选用醋酸或磷酸进行调节。
优选乙腈/水溶液的体积比为35：65；甲醇/水溶液的体积比为55：45。
优选上述条件时检测时，色谱峰形好，2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸与杂质峰分离度高。
b步骤所述2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的制备方法为：
取当归油，加入80倍体积比浓度为25%的乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中含有质量体积比为2—3%的氢氧化钾，20~30℃下放置1~3天，加盐酸调节 pH值至中性，加入等体积的二氯甲烷提取，提取液减压浓缩，浓缩液上硅胶柱，依次以体积比浓度为10%、20%、30%丙酮/石油醚混合液进行梯度洗脱，分别收集不同的流份，进行检测，检测条件如下：
逐一吸取各流份与二氯甲烷提取液，分别点于同一硅胶GF254板上，以体积比为7：1.5的石油醚/丙酮混合液为展开剂展开，取出，晾干，置254nm紫外灯下检视，二氯甲烷提取液色谱中，比移值在0.3 ~0.8之间斑点最大的物质即为2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸，收集与此斑点比移值相同的流份，减压浓缩后，用氮气流吹干有机溶剂即得油状的2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸。
2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的化学结构如下：
采用Bruker ARX-300核磁共振谱图测定产物2-戊酰基-1,5-环己二烯-1-羧酸，质谱采用Agilent 1100LC/MSD测定，红外光谱采用CN61M/H630测定；
MS :231.20[M+Na], 247.08[M+K] .
1 H-NMR: (CDCl3, 300 MHz): 6.14(d, 1H, J = 5.7 Hz), 5.96 (m, 1H), 2.60 (m, 1H), 2.46 (m, 2H), 2.39(m, 1H), 2.01 (m, 1H), 1.81 (m, 1H), 1.33 (m, 2H), 1.20 (m, 1H), 0.89 (m, 3H).
13 C-NMR: (CDCl3, 300 MHz): 169.3, 158.7, 130.1, 126.0, 116.3, 107.4, 35.9, 25.1, 22.5, 19.3, 13.8.
IR: 3366, 3050, 2957, 1739, 1668, 1436, 1280, 893, 699.
本发明所述的天然药物制剂为含有藁本内酯的天然药物制剂，如川芎粉或当归油。
本发明的藁本内酯测定方法稳定性好、成本低廉，能够简便、准确地测定天然药物制剂中藁本内酯的含量。
发明人通过实验研究发现，将2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸、藁本内酯分别置于4℃下保存，结果30天内，2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸纯度无明显变化，而藁本内酯的纯度已降到了70%以下。由此可见，2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸相对藁本内酯而言，其稳定性要强得多。由于藁本内酯自然降解过程中，很少会产生2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸，因此，在测定天然药物（例如当归、川芎）的原料、中间体及制剂中藁本内酯的含量时，选择2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸作对照品比选择藁本内酯操作更方便，稳定性更好。
附图说明
图1是对照品2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的红外光谱图；
图2是对照品2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的氢谱图，
图3是对照品2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的碳谱图。
具体实施方式
下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。
本实施例中使用的当归油及当归油软胶囊均来自神威药业有限公司生产，其制备工艺依专利CN00103336.0所述，当归油中的藁本内酯
含量在50%左右，当归油软胶囊中藁本内酯含量在5%左右。
实施例1 2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸对照品的制备
（1）制备含有碱金属氢氧化物的乙腈水溶液：
按照乙腈/水的体积比为25：75计，配制成乙腈浓度为25%的乙腈水溶液；在每100ml:乙腈水溶液中，加入2g氢氧化钾。
（2）取当归油5g，加入80倍体积的上述含有碱金属氢氧化物的乙腈水溶液。30℃下放置3天，加盐酸调节 pH值至中性，加入等体积的二氯甲烷提取，提取液减压浓缩，浓缩液上硅胶柱，分别以丙酮体积分数为10%、20%、30%的丙酮石油醚混合物进行梯度洗脱（所述石油醚的沸程为30~60℃），分别收集不同的流份，进行检测，检测条件如下：
逐一吸取不同的流份与二氯甲烷提取液，分别点于同一硅胶GF254板上，以体积比为7：1.5的石油醚/丙酮混合物为展开剂展开，所述石油醚的沸程为30~60℃，取出，晾干，置254nm紫外灯下检视，二氯甲烷提取液色谱中，比移值在0.3 ~0.8之间斑点最大的物质即为2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸，收集与此斑点比移值相同的流份，减压浓缩后，用氮气流吹干有机溶剂即得油状的2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸1.2g。
2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的红外光谱图见图1，氢谱图见图2，碳谱图见图3。
[M+Na], 247.08[M+K] .
1 H-NMR: (CDCl3, 300 MHz): 6.14(d, 1H, J = 5.7 Hz), 5.96 (m, 1H), 2.60 (m, 1H), 2.46 (m, 2H), 2.39(m, 1H), 2.01 (m, 1H), 1.81 (m, 1H), 1.33 (m, 2H), 1.20 (m, 1H), 0.89 (m, 3H).
13 C-NMR: (CDCl3, 300 MHz): 169.3, 158.7, 130.1, 126.0, 116.3, 107.4, 35.9, 25.1, 22.5, 19.3, 13.8.
IR: 3366, 3050, 2957, 1739, 1668, 1436, 1280, 893, 699.
实施例2当归油软胶囊中藁本内酯的含量测定
（1）制备含有碱金属氢氧化物的乙腈水溶液：
按照乙腈/水的体积比为25：75计，配制成乙腈浓度为25%的乙腈水溶液；在每100ml:乙腈水溶液中，加入2g氢氧化钾。
（2）供试品溶液的制备
（a）称取当归油软胶囊内容物0.3g，加入到20mL上述含有氢氧化钾的乙腈水溶液中，摇匀后于30℃下放置1天，加入2M的盐酸调节pH至中性，加入体积比为40：60的乙腈/水溶液定容于50ml量瓶，滤过，滤液即为供试品溶液。
（b）对照品溶液的制备
称取实施例1所制备的2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸，加乙腈配制成对照品溶液，所述对照品溶液中2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的含量为0.3835mg/mL。
（c）液相色谱条件
采用高效液相色谱法分别测定对照品溶液和供试品溶液，色谱条件为：采用以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱，以体积比为55:45的甲醇/水混合液为流动相，用醋酸溶液调混合液ph值至3.5，流动相的流速为1 mL/min，检测波长为285nm，柱温为30℃。
（d）测定法
分别吸取对照品与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，以外标法计算供试品溶液中2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的含量，按照藁本内酯与2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的摩尔比1:1的比例，换算得到藁本内酯的含量。
（e）方法学考察
线性关系考察：取2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸，加50%乙腈配制成浓度为0.4794mg/ml的溶液，分别吸取1、2、4、5、10、20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱峰面积，以对照品进样量（X：μg）为横坐标对峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸线性回归方程y = 9.754x + 0.1604，R=0.9999。
精密度试验：取供试品溶液，重复进样6次，每次进样10μl，按色谱条件测定，2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸峰面积平均值的RSD值为0.66%，表明仪器的精密度良好。
稳定性试验：按上述制备供试品溶液一份，于配制后0、1、2、4、6、8小时进样，测定，记录峰面积，计算。结果2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的RSD值为1.28%，表明供试品溶液在8小时内稳定。
重复性试验：取当归油软胶囊内容物约0.3g，精密称定，共五份，依法制备供试品溶液，测定，以2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸峰面积平均值计算含量，结果含量的RSD值为0.83%，表明该方法重复性较好。
加样回收试验：取当归油软胶囊内容物6份，每约0.15g，精密称定，置50ml量瓶中，分别加入含1.034mg/ml的2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的25%乙腈溶液12、12、10、10、8、8ml，补加25%乙腈至20ml，各加入0.5g氢氧化钾，室温放置水解1天，加入2M盐酸调节pH值至中性，加入40%乙腈至刻度，摇匀过滤即得供试品溶液。按照本发明所述方法测定，计算含量。结果 2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的平均回收率为99.77%，RSD为1.77%。
（f）测定结果
当归油软胶囊含藁本内酯以2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸计，测得结果为5.23%。
Claims (5)
1.当归油中藁本内酯的测定方法，其特征在于如下步骤：
（a）称取含有藁本内酯的当归油或当归油软胶囊内容物，加入到含有氢氧化钠或氢氧化钾的乙腈/水溶液中，摇匀后于20~30℃下放置1~3天，加入盐酸调节pH至中性，加入乙腈水溶液定容，摇匀后过滤，续滤液为供试品溶液；
（b）称取2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸，加乙腈或甲醇配制成对照品溶液，所述对照品溶液中2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的含量为0.05~0.4mg/mL；
（c）采用高效液相色谱法分别测定对照品溶液和供试品溶液，色谱条件为：采用以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱，以乙腈/水溶液或甲醇/水溶液作为流动相，流动相的流速为0.5 ~2 mL/min，检测波长为285nm，柱温为20~40℃，以外标法计算供试品溶液中2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的含量，按照藁本内酯与2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的摩尔比1:1的比例，换算得到藁本内酯的含量。
2.根据权利要求1所述的当归油中藁本内酯的测定方法，其特征在于（a）步所述乙腈/水溶液中含有质量体积比为2~3%的氢氧化钾。
3.根据权利要求1所述的当归油中藁本内酯的测定方法，其特征在于（c）步骤所述乙腈/水溶液其体积比为20~45：80~55；甲醇/水溶液的体积比为40~65:60~35；所述乙腈/水溶液或甲醇/水溶液的pH值控制在2~7。
4.根据权利要求2所述的当归油中藁本内酯的测定方法，其特征在于（c）步所述乙腈/水溶液的体积比为35：65；甲醇/水溶液的体积比为55：45。
5.根据权利要求1所述的当归油中藁本内酯的测定方法，其特征在于（b）步骤所述2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸的制备方法为：
取当归油，加入80倍体积比浓度为25%的乙腈水溶液，所述乙腈水溶液中含有质量体积比为2—3%的氢氧化钾，20~30℃下放置1~3天，加盐酸调节 pH值至中性，加入等体积的二氯甲烷提取，提取液减压浓缩，浓缩液上硅胶柱，依次以体积比浓度为10%、20%、30%丙酮/石油醚混合液进行梯度洗脱，分别收集不同的流份，进行检测，检测条件如下：
逐一吸取各流份与二氯甲烷提取液，分别点于同一硅胶GF254板上，以体积比为7：1.5的石油醚/丙酮混合液为展开剂展开，取出，晾干，置254nm紫外灯下检视，二氯甲烷提取液色谱中，比移值在0.3 ~0.8之间斑点最大的物质即为2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸，收集与此斑点比移值相同的流份，减压浓缩后，用氮气流吹干有机溶剂即得油状的2-（1-戊酮）-1，5-环已二烯甲酸。
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