CN109991327A - 一测多评法评价小蓟质量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种一测多评法评价小蓟质量的方法，首先建立小蓟中4种主要药效成分的HPLC含量测定方法，以芦丁作为内参物，计算其他3种活性成分的相对校正因子，并考察相对校正因子的系统适用性和方法重现性，根据相对保留时间进行色请峰定位，再结合相对校正因子算各待测成分的含量，通过一测多评法与外标法的相互验证，证明含量测定结果无显著差异。本发明方法克服了对照品成本高、不易得等难题，通过相对校正因子及色谱峰定位计算指标成分含量，实现小蓟中多种药效物质的同步测定，可节省成本、简化操作，提高效率，且检测灵敏度高，稳定性好，测定结果准确可靠，对小蓟质量控制和临床疗效的保证具有重大意义。
Description
技术领域
本发明属于药物质量控制技术领域，涉及一种一测多评法评价小蓟质量的方法。
背景技术
小蓟Herba Cirsii Setosi，民间俗称刺角芽、刺角，为菊科蓟属的植物小蓟的干燥地上部分，为常用中药。小蓟味甘、苦，性凉，归心、肝经，具有凉血止血，祛瘀消肿的作用。可用于衄血，吐血，尿血，便血，崩漏下血，外伤出血，痈肿疮毒等病症的治疗。小蓟粗提物具有明显的抗菌、抗炎活性，对肺炎双球菌、溶血性链球菌、白喉杆菌、伤寒村菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌等均有抑制作用。小蓟中主要含有挥发油、生物碱、黄酮等成分。研究发现小蓟中黄酮类成分中的芦丁具有维生素P样作用和抗炎作用；小蓟中的蒙花苷具有有抗衰老、抗缺氧、抗不良刺激以及促凝血的作用；木犀草素具有消炎、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒；小蓟中的芹菜素具有抑制致癌物质的致癌活性、抗炎、抗氧化、镇静、安神、降压的作用。而上述成分在小蓟中含量较高且活性较好，具有一定的代表性，有必要将其纳入小蓟药材质量控制和评价体系。
近年来我们国家通过各种政策大力推行传统的中医药以及中药现代化，现在越来越多的中药制剂出现在医药市场上，为了能使中药制剂达到应有的疗效，对中药材的质量评价以及含量测定就显得尤为重要。现有中药标准多以单一成分含量反应中药产品质量，但中药成分复杂，具有多成分、多功效的特点，仅以一种成分含量无法全面反映中药质量的优劣，由此提出了多成分质量控制的理念。
一测多评法(quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS)指利用中药有效成分内在的函数关系和比例关系，只测定其中的一个成分(对照品易于得到)，来实现多个成分(对照品难以得到或供应)的同步测定，是适合中药特点的多指标质量评价模式。在对照品不足的情况下，利用相对校正因子(relative correctionfactor，RCF)对药材进行质量控制是方便、快速、廉价的，其方法将会是中药多组分同步定量的发展方向。目前，用一测多评法同时测定小蓟中多种不同类型成分的含量的文献还没有。
发明内容
本发明的目的是提供一种一测多评法评价小蓟质量的方法，解决了现有技术中小蓟在含量测定时标准品品种多，含量测定方法复杂，检测经济成本较高的问题，简化了小蓟定量检测方法，节约了小蓟的质量控制的检测经济成本。
本发明所采用的技术方案是，一测多评法评价小蓟质量的方法，具体按照以下步骤进行：
步骤1、对照品标准溶液制备
步骤1.1、分别取芦丁标准品、蒙花苷标准品以及木犀草素标准品和芹菜素标准品，用甲醇溶解后置于容量瓶、定容，即得芦丁标准溶液、蒙花苷标准溶液、木犀草素标准溶液以及芹菜素标准溶液；
步骤1.2、分别取一定量的芦丁标准溶液、蒙花苷标准溶液、木犀草素标准溶液以及芹菜素标准溶液混合后置于容量瓶中，用甲醇定容，得到混合对照品溶液；
步骤2、供试品溶液制备
称取小蓟药材，置于索氏提取器中，加入石油醚，水浴加热脱脂至无色后晾干，将晾干后的小蓟药材再置于索氏提取器中，加入甲醇，水浴加热提取，将提取液置于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到供试品溶液，备用；
步骤3、高效液相色谱测定
取步骤1.2中制备的混合对照品溶液和步骤2中制备的供试品溶液，进行色谱条件检测分析，得到混合对照品溶液的高效液相色谱图和供试品溶液的液相色谱图；
其中，色谱条件如下：
色谱柱：Agilent HC-C18；柱温：25℃-35℃；检测波长：260nm-350nm；流动相：甲醇为流动相A，0.1％冰醋酸水为流动相B；梯度洗脱70min：
步骤4、目标化合物的含量计算
步骤4.1、利用混合对照品溶液的高效液相色谱图，计算各色谱峰的峰面积，以芦丁为内参物，根据相对校正因子计算公式分别计算蒙花苷、木犀草素和芹菜素的相对校正因子；
其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积；
步骤4.2、对供试品溶液的高效液相色谱图中芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素相对保留时间进行峰定位，并结合步骤4.1中得到的蒙花苷、木犀草素和芹菜素的相对校正因子，计算供试品溶液中蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量。
本发明的特点还在于，
步骤1.1中芦丁标准溶液的浓度为0.50mg/mL、蒙花苷标准溶液的浓度为0.05mg/mL、木犀草素标准溶液的浓度为0.51mg/mL，芹菜素标准溶液浓度分别为0.41mg/mL。
步骤1.2中的混合对照品溶液中芦丁的浓度为0.050mg/mL、蒙花苷的浓度为0.005mg/mL、木犀草素的浓度为0.051mg/mL、芹菜素的浓度为0.041mg/mL。
步骤2中脱脂时的水浴温度为60℃。
步骤2中提取时的水浴温度为50℃-90℃。
步骤2中水浴提取的时间为1h-5h。
步骤2中小蓟药材、石油醚和甲醇的质量比为1:5-10:8-20。
步骤3中高效液相色谱流动相流速为0.8ml/min-1.5ml/min；进样量为10μL-20μL。
本发明的有益效果是：一测多评法评价小蓟质量的方法，以芦丁作为内参物，计算小蓟中蒙花苷、木犀草素和芹菜素的相对校正因子，并用校正因子计算蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量，不仅大幅度降低检测成本和检测时间，并且简化了小蓟的定量检测方法，提高效率，且检测灵敏度高，稳定性好，测定结果准确可靠，对小蓟的质量控制和临床疗效的保证具有重要意义。
附图说明
图1是本发明一测多评法评价小蓟质量的方法中混合对照品的HPLC图；
图2是本发明一测多评法评价小蓟质量的方法中实施例1中的供试品的HPLC图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明中小蓟的多成分的检测方法，采用一测多评的方法，以芦丁作为内参物测定小蓟中蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量，具体包括以下步骤：
步骤1、对照品标准溶液制备
步骤1.1、分别取芦丁标准品、蒙花苷标准品以及木犀草素标准品和芹菜素标准品，用甲醇溶解后置于容量瓶、定容，即得浓度为0.50mg/mL的芦丁标准溶液、浓度为0.05mg/mL的蒙花苷标准溶液、浓度为0.51mg/mL的木犀草素标准溶液，浓度为0.41mg/mL的芹菜素标准溶液；
步骤1.2、分别取一定量的芦丁标准溶液、蒙花苷标准溶液、木犀草素标准溶液以及芹菜素标准溶液混合后置于容量瓶中，用甲醇定容，得到混合对照品溶液，其中混合对照品溶液中芦丁的浓度为0.050mg/mL、蒙花苷的浓度为0.005mg/mL、木犀草素的浓度为0.051mg/mL、芹菜素的浓度为0.041mg/mL；
步骤2、供试品溶液制备
称取小蓟药材，置于索氏提取器中，加入小蓟药材质量5-10倍的石油醚，于60℃水浴加热脱脂至无色后晾干，将晾干后的小蓟药材再置于索氏提取器中，加入小蓟药材质量8-20倍的甲醇，于50℃-90℃水浴加热提取1h-5h，将提取液置于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，备用；
步骤3、高效液相色谱测定
取步骤1.2中制备的混合对照品溶液和步骤2中制备的供试品溶液，进行色谱条件检测分析，得到混合对照品溶液的高效液相色谱图和供试品溶液的液相色谱图；
其中，色谱条件如下：
色谱柱：Agilent HC-C18；柱温：25℃-35℃；检测波长：260nm-350nm；流动相：甲醇为流动相A，0.1％冰醋酸水为流动相B；动相流速为0.8ml/min-1.5ml/min；进样量为10μL-20μL；梯度洗脱70min：
步骤4、目标化合物的含量计算
步骤4.1、利用混合对照品溶液的高效液相色谱图，计算各色谱峰的峰面积，以芦丁为内参物，根据相对校正因子计算公式分别计算蒙花苷、木犀草素和芹菜素的相对校正因子；
其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积；
步骤4.2、对供试品溶液的高效液相色谱图中芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素相对保留时间进行峰定位，并结合步骤4.1中得到的蒙花苷、木犀草素和芹菜素的相对校正因子，计算供试品溶液中蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量。
下面通过具体实施例对本发明的一测多评法评价小蓟质量的方法进行详细说明：
实施例1
本发明中小蓟的多成分的检测方法，采用一测多评的方法，以芦丁作为内参物测定小蓟中蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量，具体包括以下步骤：
步骤1、对照品标准溶液制备
步骤1.1、精密称取芦丁标准品、蒙花苷标准品、木犀草素标准品和芹菜素标准品，分别置于10mL量瓶中，加入甲醇溶解，定容至刻度，得到浓度为0.50mg/mL的芦丁标准溶液、浓度为0.05mg/mL的蒙花苷标准溶液、浓度为0.51mg/mL的木犀草素标准溶液和浓度为0.41mg/mL的芹菜素标准溶液；
步骤1.2、分别取上述芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素标准品溶液各1mL，置于10mL容量瓶中，加入甲醇，定容至刻度，配制成质量浓度为芦丁0.050mg/mL、蒙花苷0.005mg/mL、木犀草素0.051mg/mL、芹菜素0.041mg/mL的混合对照品溶液。
步骤2、供试品溶液的制备
精密称定小蓟药材5g，置于索氏提取器中，加入小蓟药材质量5倍的石油醚，60℃水浴加热脱脂至无色，脱酯后晾干，将晾干后的小蓟药材再置于索氏提取器中，加入小蓟药材质量8倍分析甲醇，50℃水浴加热提取1h，将提取液倒入100mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。
步骤3、高效液相色谱测定
取步骤1.2中制备的混合对照品溶液和步骤2制备的供试品溶液，进行色谱条件检测分析，得到混合对照品溶液的高效液相色谱图和供试品溶液的液相色谱图，如图1和图2所示；
色谱柱：Agilent HC-C18(250mm×4.6mm，5um)；流动相：甲醇(A)，0.1％冰醋酸水(B)，进样量10μl；检测波长：260nm；柱温：25℃；流速：0.8ml/min，梯度洗脱70min；
步骤4、目标化合物的含量计算
步骤4.1、利用不同体积的混合对照品溶液的色谱峰面积，以芦丁为内参物，根据相对校正因子计算公式分别计算蒙花苷、木犀草素和芹菜素的相对校正因子，结果见表1；
其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积，结果见表1。
表1蒙花苷、木犀草素、芹菜素的相对较正因子
步骤4.2、对供试品溶液的高效液相色谱图中芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素相对保留时间进行峰定位，并结合步骤4.1中得到的蒙花苷、木犀草素和芹菜素的相对校正因子，计算供试品溶液中蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量。
步骤5、含量测定方法学考察
(1)线性拟合度考察
精密吸取本实施例中配置的混合对照品溶液1mL分别稀释0倍、5倍、10倍、15倍、20倍分别进样，以浓度对峰面积积分值进行回归处理得到芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素的标准曲线，结果见表2。
表2芦丁、蒙花苷、木犀草素、芹菜素的标准曲线表
表中建立的四个线性回归方程的R2大于0.999，因此表明：三种标准品的线性关系良好。
(2)供试品溶液稳定性考察
于配制后的0、2、8、12、24、36h分别精密吸取本实施例中的供试品溶液10μL进行测定，记录芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素的峰面积，RSD分别为1.38％、1.26％、1.58％和1.12％，均小于2％，结果表明制备的供试品溶液在36h内稳定。
(3)仪器的精密度考察
精密吸取本实施例中的混合对照品溶液10μL，在本实施例中的色谱条件下，重复进样5次，测得各目标化合物的峰面积，计算峰面积的RSD值，算得芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素峰面积的RSD值分别为0.90％、0.09％、0.23％、1.12％，均小于2.0％，表明该仪器的精密度良好。
(4)方法的准确度考察
精密量取本实施例中制备的已测定含量的小蓟药材提取液5mL，6份，分别置于10mL容量瓶中，平均分成3组，第一组加入1mL混合对照品溶液，第二组加入2mL混合对照品溶液，第三组加入3mL混合对照品溶液。依法测定峰面积，计算回收率，芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素的平均加样回收率分别为102.04％、96.77％、96.78％、95.94％，表明该方法的准确度良好。
步骤6、校正因子重现性考察
(1)色谱柱及高效液相色谱仪考察：精密吸取本实施例中配置的对照品溶液10μL，分别考察Shimadzu LC-2010AHT、Agilent1220LC两台不同品牌的高效液相色谱仪，WelchUltisil AQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、InertsilODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同型号的色谱柱对相对校正因子的影响，结果表明在不同的不同品牌的额高效液相色谱仪、不同的色谱柱下测定的相对校正因子基本一致，说明fs/k的系统耐受性较好，结果见表3和表4。
表3不同色谱柱对相对较正因子的影响
表4不同高效液相色谱仪对相对校正因子的影响(n＝3)
步骤7、色谱峰专属性考察
精密吸取本实施例中制备的混合对照品溶液10μL，测定的内参物芦丁的相对保留时间作为定位标准，并且在Shimadzu LC-2010A HT、Agilent1220LC两台不同品牌的高效液相色谱仪上，在Welch Ultisil AQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同规格的色谱柱上对其相对保留时间进行考察，根据相对保留时间即可正确判断出目标峰蒙花苷、木犀草素和芹菜素的准确峰位置，相对保留时间测定结果见表5。
表5不同仪器和不同色谱柱测得的相对保留时间
结果表明，不同仪器和色谱柱下各成分的相对保留时间的RSD均小于5％，因此利用相对保留时间作为小蓟目标色谱峰定位的方法是可行的。因此，在对照品短缺的情况下，在一测多评法的实际应用中可参考药材的典型色谱图，利用其相对保留值进行定位，根据内参物的保留时间，并结合待测成分色谱峰的紫外吸收特征，能正确判断目标成分色谱峰的位置。
实施例2
本发明中小蓟的多成分的检测方法，采用一测多评的方法，以芦丁作为内参物测定小蓟中蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量，具体包括以下步骤：
步骤1、对照品标准溶液制备
步骤1.1、精密称取芦丁标准品、蒙花苷标准品、木犀草素标准品和芹菜素标准品，分别置于10mL量瓶中，加入甲醇溶解，定容至刻度，得到浓度为0.50mg/mL的芦丁标准溶液、浓度为0.05mg/mL的蒙花苷标准溶液、浓度为0.51mg/mL的木犀草素标准溶液和浓度为0.41mg/mL的芹菜素标准溶液；
步骤1.2、分别取上述芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素标准品溶液各1mL，置于10mL容量瓶中，加入甲醇，定容至刻度，配制成质量浓度为芦丁0.050mg/mL、蒙花苷0.005mg/mL、木犀草素0.051mg/mL、芹菜素0.041mg/mL的混合对照品溶液。
步骤2、供试品溶液的制备
精密称定小蓟药材5g，置于索氏提取器中，加入小蓟药材质量10倍的石油醚，60℃水浴加热脱脂至无色，脱酯后晾干，将晾干后的小蓟药材再置于索氏提取器中，加入小蓟药材质量20倍分析甲醇，70℃水浴加热提取5h，将提取液倒入100mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。
步骤3、高效液相色谱测定
色谱柱：Agilent HC-C18(250mm×4.6mm，5um)；流动相：甲醇(A)，0.1％冰醋酸水(B)，进样量20μl；检测波长：350nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；梯度洗脱70min：
步骤4、目标化合物的含量计算
步骤4.1、利用不同体积的混合对照品溶液的色谱峰面积，以芦丁为内参物，根据相对校正因子计算公式分别计算蒙花苷、木犀草素和芹菜素的相对校正因子，结果见表1；
其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积，结果见表1；
步骤4.2、对供试品溶液的高效液相色谱图中芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素相对保留时间进行峰定位，并结合步骤4.1中得到的蒙花苷、木犀草素和芹菜素的相对校正因子，计算供试品溶液中蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量。
步骤5、含量测定方法学考察
(1)线性拟合度考察
配置质量浓度芦丁为0.05mg/mL、蒙花苷为0.05mg/mL、木犀草素为0.012mg/mL、芹菜素为0.041mg/mL的混合对照品溶液。精密吸取上述混合对照品溶液1mL分别稀释0倍、5倍、10倍、15倍、20倍分别进样，以浓度对峰面积积分值进行回归处理得到芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素的标准曲线，结果见表2。
(2)供试品溶液稳定性考察
于配制后的0、2、8、12、24、36h分别精密吸取该实施例中的供试品溶液10μL进行测定，记录芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素的峰面积，RSD分别为1.38％、1.26％、1.58％和1.12％，均小于2％，结果表明制备的供试品溶液在36h内稳定。
(3)仪器的精密度考察
精密吸取本实施例中的混合对照品溶液10μL，在上述色谱条件下，重复进样5次，测得各目标化合物的峰面积，计算峰面积的RSD值，算得芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素峰面积的RSD值分别为0.90％、0.09％、0.23％、1.12％，均小于2.0％，表明该仪器的精密度良好。
(4)方法的准确度考察
精密量取一批本实施例中制备的已测定含量的小蓟药材提取液5mL，6份，分别置于10mL容量瓶中，平均分成3组，第一组加入1mL混合对照品溶液，第二组加入2mL混合对照品溶液，第三组加入3mL混合对照品溶液。依法测定峰面积，计算回收率，芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素的平均加样回收率分别为102.04％、96.77％、96.78％、95.94％，表明该方法的准确度良好。
步骤6、校正因子重现性考察
(1)色谱柱及高效液相色谱仪考察：精密吸取本实施例中的对照品溶液10μL，分别考察Shimadzu LC-2010AHT、Agilent1220LC两台不同品牌的高效液相色谱仪，WelchUltisil AQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、InertsilODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同型号的色谱柱对相对校正因子的影响，结果表明在不同的不同品牌的额高效液相色谱仪、不同的色谱柱下测定的相对校正因子基本一致，说明fs/k的系统耐受性较好，结果见表3和表4。
步骤7、色谱峰专属性考察
精密吸取本实施例中制备的混合对照品溶液10μL，测定的内参物芦丁的相对保留时间作为定位标准，并且在Shimadzu LC-2010A HT、Agilent1220LC两台不同品牌的高效液相色谱仪上，在Welch Ultisil AQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同规格的色谱柱上对其相对保留时间进行考察，根据相对保留时间即可正确判断出目标峰蒙花苷、木犀草素和芹菜素的准确峰位置，相对保留时间测定结果见表5。
结果表明，不同仪器和色谱柱下各成分的相对保留时间的RSD均小于5％，因此利用相对保留时间作为小蓟目标色谱峰定位的方法是可行的。因此，在对照品短缺的情况下，在一测多评法的实际应用中可参考药材的典型色谱图，利用其相对保留值进行定位，根据内参物的保留时间，并结合待测成分色谱峰的紫外吸收特征，能正确判断目标成分色谱峰的位置。
实施例3
本发明中小蓟的多成分的检测方法，采用一测多评的方法，以芦丁作为内参物测定小蓟中蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量，具体包括以下步骤：
步骤1、对照品标准溶液制备
步骤1.1、，精密称取芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素标准品，分别置于10mL量瓶中，加入甲醇溶解，定容至刻度，得到浓度为0.50mg/mL的芦丁标准溶液、浓度为0.05mg/mL的蒙花苷标准溶液、浓度为0.51mg/mL的木犀草素标准溶液和浓度为0.41mg/mL的芹菜素标准溶液；
步骤1.2、分别取上述芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素标准品溶液各1mL，置于10mL容量瓶中，加入甲醇，定容至刻度，配制成质量浓度为芦丁0.050mg/mL、蒙花苷0.005mg/mL、木犀草素0.051mg/mL、芹菜素0.041mg/mL的混合对照品溶液。
步骤2、供试品溶液的制备
精密称定小蓟药材5g，置于索氏提取器中，加入小蓟药材质量8倍的石油醚，60℃水浴加热脱脂至无色，脱酯后晾干，将晾干后的小蓟药材再置于索氏提取器中，加入小蓟药材质量10倍的分析甲醇，90℃水浴加热提取3h，将提取液倒入100mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。
步骤3、高效液相色谱测定
色谱柱：Agilent HC-C18(250mm×4.6mm，5um)；流动相：甲醇(A)，0.1％冰醋酸水(B)，进样量15μl；检测波长：330nm；柱温：35℃；流速：1.5ml/min，梯度洗脱70min：
步骤4、目标化合物的含量计算
步骤4.1、利用高效液相色谱测定不同体积的混合对照品溶液的色谱峰面积，以芦丁为内参物，根据相对校正因子计算公式分别计算蒙花苷、木犀草素和芹菜素的相对校正因子，结果见表1；
其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积；
步骤4.2、对供试品溶液的高效液相色谱图中芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素相对保留时间进行峰定位，并结合步骤4.1中得到的蒙花苷、木犀草素和芹菜素的相对校正因子，计算供试品溶液中蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量。
步骤5、含量测定方法学考察
(1)线性拟合度考察
配置质量浓度芦丁为0.05mg/mL、蒙花苷为0.05mg/mL、木犀草素为0.012mg/mL、芹菜素为0.041mg/mL的混合对照品溶液。精密吸取上述混合对照品溶液1mL分别稀释0倍、5倍、10倍、15倍、20倍分别进样，以浓度对峰面积积分值进行回归处理得到芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素的标准曲线，结果见表2。
表中建立的四个线性回归方程的R2大于0.999，因此表明：三种标准品的线性关系良好。
(2)供试品溶液稳定性考察
于配制后的0、2、8、12、24、36h分别精密吸取本实施例中的供试品溶液10μL进行测定，记录芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素的峰面积，RSD分别为1.38％、1.26％、1.58％和1.12％，均小于2％，结果表明制备的供试品溶液在36h内稳定。
(3)仪器的精密度考察
精密吸取本实施例中的混合对照品溶液10μL，在本实施例中的色谱条件下，重复进样5次，测得各目标化合物的峰面积，计算峰面积的RSD值，算得芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素峰面积的RSD值分别为0.90％、0.09％、0.23％、1.12％，均小于2.0％，表明该仪器的精密度良好。
(4)方法的准确度考察
精密量取本实施例中制备的已测定含量的小蓟药材提取液5mL，6份，分别置于10mL容量瓶中，平均分成3组，第一组加入1mL混合对照品溶液，第二组加入2mL混合对照品溶液，第三组加入3mL混合对照品溶液。依法测定峰面积，计算回收率，芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素的平均加样回收率分别为102.04％、96.77％、96.78％、95.94％，表明该方法的准确度良好。
步骤6、校正因子重现性考察
(1)色谱柱及高效液相色谱仪考察：精密吸取对照品溶液10μL，分别考察ShimadzuLC-2010AHT、Agilent1220LC两台不同品牌的高效液相色谱仪，Welch Ultisil AQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同型号的色谱柱对相对校正因子的影响，结果表明在不同的不同品牌的额高效液相色谱仪、不同的色谱柱下测定的相对校正因子基本一致，说明fs/k的系统耐受性较好，结果见表3和表4。
步骤7、色谱峰专属性考察
精密吸取本实施例中制备的混合对照品溶液10μL，测定的内参物芦丁的相对保留时间作为定位标准，并且在Shimadzu LC-2010A HT、Agilent1220LC两台不同品牌的高效液相色谱仪上，在Welch Ultisil AQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同规格的色谱柱上对其相对保留时间进行考察，根据相对保留时间即可正确判断出目标峰蒙花苷、木犀草素和芹菜素的准确峰位置，相对保留时间测定结果见表5。
结果表明，不同仪器和色谱柱下各成分的相对保留时间的RSD均小于5％，因此利用相对保留时间作为小蓟目标色谱峰定位的方法是可行的。因此，在对照品短缺的情况下，在一测多评法的实际应用中可参考药材的典型色谱图，利用其相对保留值进行定位，根据内参物的保留时间，并结合待测成分色谱峰的紫外吸收特征，能正确判断目标成分色谱峰的位置。
除了每一个实施例中的含量测定方法学考察、校正因子重现性考察和色谱峰专属性考察，我们还做了方法的重复性考察和一测多评法与外标法测定结果比较，具体如下：
(1)方法的重复性考察
精密称取同一批小蓟药材5g，共5份，按照本发明的方法分别制备供试品溶液，测定记录各供试品溶液的目标化合物峰面积，计算得到芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素峰面积的RSD值分别为1.67％、3.24％、2.44％、3.24％，表明该方法的重复性良好。
(2)一测多评法与外标法测定结果比较
分别取10个产地的小蓟药材粉末(过40目筛)，分别采用一测多评法和外标法计算不同产地小蓟中芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量，结果见表6。
表6外标法和QAMS法计算小蓟中芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素的量的比较
结果表明：使用一测多评法测定的蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量与外标法计算的蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量无显著性差异，一测多评法测定小蓟中蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量的方法是可行的。
因此，本发明的一测多评法评价小蓟质量的方法，以芦丁作为内参物，计算小蓟中蒙花苷、木犀草素和芹菜素的相对校正因子，解决了现有技术中小蓟在含量测定时标准品品种多，含量测定方法复杂的问题，同时，使用校正因子计算蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量，能够大幅度降低检测成本和检测时间，并且简化了小蓟的定量检测方法，提高效率，且本发明的方法检测灵敏度高，稳定性好，测定结果准确可靠。
Claims (8)
1.一测多评法评价小蓟质量的方法，其特征在于，具体按照以下步骤进行：
步骤1、对照品标准溶液制备
步骤1.1、分别取芦丁标准品、蒙花苷标准品以及木犀草素标准品和芹菜素标准品，用甲醇溶解后置于容量瓶、定容，即得芦丁标准溶液、蒙花苷标准溶液、木犀草素标准溶液以及芹菜素标准溶液；
步骤1.2、分别取一定量的芦丁标准溶液、蒙花苷标准溶液、木犀草素标准溶液以及芹菜素标准溶液混合后置于容量瓶中，用甲醇定容，得到混合对照品溶液；
步骤2、供试品溶液制备
称取小蓟药材，置于索氏提取器中，加入石油醚，水浴加热脱脂至无色后晾干，将晾干后的小蓟药材再置于索氏提取器中，加入甲醇，水浴加热提取，将提取液置于容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到供试品溶液，备用；
步骤3、高效液相色谱测定
取步骤1.2中制备的混合对照品溶液和步骤2中制备的供试品溶液，进行色谱条件检测分析，得到混合对照品溶液的高效液相色谱图和供试品溶液的液相色谱图；
其中，色谱条件如下：
色谱柱：Agilent HC-C18；柱温：25℃-35℃；检测波长：260nm-350nm；流动相：甲醇为流动相A，0.1％冰醋酸水为流动相B；梯度洗脱70min：
步骤4、目标化合物的含量计算
步骤4.1、利用混合对照品溶液的高效液相色谱图，计算各色谱峰的峰面积，以芦丁为内参物，根据相对校正因子计算公式分别计算蒙花苷、木犀草素和芹菜素的相对校正因子；
其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积；
步骤4.2、对供试品溶液的高效液相色谱图中芦丁、蒙花苷、木犀草素和芹菜素相对保留时间进行峰定位，并结合步骤4.1中得到的蒙花苷、木犀草素和芹菜素的相对校正因子，计算供试品溶液中蒙花苷、木犀草素和芹菜素的含量。
2.根据权利要求1所述的一测多评法评价小蓟质量的方法，其特征在于，所述步骤1.1中芦丁标准溶液的浓度为0.50mg/mL、蒙花苷标准溶液的浓度为0.05mg/mL、木犀草素标准溶液的浓度为0.51mg/mL，芹菜素标准溶液的浓度为0.41mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的一测多评法评价小蓟质量的方法，其特征在于，所述步骤1.2中的混合对照品溶液中芦丁的浓度为0.050mg/mL、蒙花苷的浓度为0.005mg/mL、木犀草素的浓度为0.051mg/mL、芹菜素的浓度为0.041mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一测多评法评价小蓟质量的方法，其特征在于，所述步骤2中脱脂时的水浴温度为60℃。
5.根据权利要求1或4所述的一测多评法评价小蓟质量的方法，其特征在于，所述步骤2中提取时的水浴温度为50℃-90℃。
6.根据权利要求5所述的一测多评法评价小蓟质量的方法，其特征在于，所述步骤2中水浴提取的时间为1h-5h。
7.根据权利要求6所述的一测多评法评价小蓟质量的方法，其特征在于，所述步骤2中小蓟药材、石油醚和甲醇的质量比为1:5-10:8-20。
8.根据权利要求1所述的一测多评法评价小蓟质量的方法，其特征在于，所述步骤3中高效液相色谱流动相流速为0.8ml/min-1.5ml/min；进样量为10μL-20μL。
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