CN109991329A - 一测多评法评价白蔹质量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种一测多评法评价白蔹质量的方法，首先建立白蔹中3种主要药效成分的HPLC含量测定方法，以白藜芦醇作为内参物，计算其他2种活性成分的相对校正因子，并考察相对校正因子的系统适用性和方法重现性，根据相对保留时间进行色请峰定位，再结合相对校正因子算各待测成分的含量，通过一测多评法与外标法的相互验证，证明含量测定结果无显著差异。本发明方法克服了对照品成本高、不易得等难题，通过相对校正因子及色谱峰定位计算指标成分含量，实现白蔹中多种药效物质的同步测定，可节省成本、简化操作，提高效率，且检测灵敏度高，稳定性好，测定结果准确可靠，对白蔹质量控制和临床疗效的保证具有重大意义。
Description
技术领域
本发明属于药物质量控制技术领域，具体涉及一种一测多评法评价白蔹质量的方法。
背景技术
白蔹为葡萄科蛇葡萄属植物，白蔹(Ampelopsis japonica(Thunb.)Makino)的干燥块根，具有清热解毒、消痈散结、敛疮生肌等功效，临床上多用于治疗痈疽发背，疔疮，烧烫伤等症状。白蔹药材中没食子酸、原儿茶酸和白藜芦醇的含量相对较大，没食子酸具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化的作用，对心血管系统、神经系统、糖尿病、肝纤维化和肿瘤等疾病都具有防治作用；原儿茶酸对大鼠心肌缺血/再灌注损伤有保护作用，并具有抗菌、抗动脉硬化的作用；白藜芦醇可减少心肌缺血-再灌注损伤、舒张血管、抗动脉粥样硬化，并能抗菌、抗病毒，具有免疫调节作用。这些成分的药理作用均与白蔹的功效具有相关性。若通过只测定中药材中的一个成分，来实现多个成分的同步测定，则会在很大程度上简化白蔹药材的定量检测方法。
一测多评法(quantitative analysis of multicomponents by single marker，QAMS)指利用中药有效成分内在的函数关系和比例关系，只测定其中的一个成分(对照品易于得到)来实现多个成分(对照品难以得到或供应)的同步测定，是适合中药特点的多指标质量评价模式。在对照品不足的情况下，利用相对校正因子(relative correctionfactor，RCF)对药材进行质量控制是方便、快速、廉价的，其方法将会是中药多组分同步定量的发展方向。
目前，用一测多评法评价中药材质量的相关文献较少，而用一测多评法同时测定白蔹中多种不同类型成分的含量的未见报道。虽已有文献报道采用HPLC切换波长法测定白蔹中没食子酸、原儿茶醛、儿茶素和白藜芦醇的含量，但所用标准品品种多，并且含量测定方法复杂，检测经济成本较高，限制了通过对白蔹进行主要活性成分含量测定来控制其质量在实际工作中的应用。
为了更加全面有效的控制白蔹药材的质量，本实验将以没食子酸等多个有效成分为定量指标，建立白蔹一测多评的质量评价方法，考察一测多评法对白蔹的含量测定的准确性与可行性。
发明内容
本发明的目的是提供一种一测多评法评价白蔹质量的方法，解决了现有技术中白蔹在含量测定时标准品品种多，含量测定方法复杂，检测经济成本较高的问题，简化了白蔹定量检测方法，节约了白蔹的质量控制的检测经济成本。
本发明所采用的技术方案是，一测多评法评价白蔹质量的方法，具体按照以下步骤进行：
步骤1、对照品标准溶液制备
步骤1.1、分别取没食子酸标准品、白藜芦醇标准品以及原儿茶酸标准品，用甲醇溶解后置于容量瓶、定容，即得没食子酸标准溶液、白藜芦醇标准溶液以及原儿茶酸标准溶液；
步骤1.2、分别取一定量的没食子酸标准溶液、白藜芦醇标准溶液以及原儿茶酸标准溶液混合后置于容量瓶中，用甲醇定容，得到混合对照品溶液；
步骤2、供试品溶液制备
将白蔹粉碎，过40目筛网，经提取、抽滤后，将滤液置于水浴锅上蒸干得滤渣，将滤渣溶解于甲醇后置于容量瓶、定容后，过微孔滤膜，得到供试品溶液，备用；
步骤3、高效液相色谱测定
分别取步骤1.2中制备的混合对照品溶液与步骤2中制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测试，得到混合对照品溶液的高效液相色谱图和供试品溶液的高效液相色谱图；
其中，色谱条件如下：
色谱柱：Agilent HC-C18；柱温：25℃-35℃；检测波长：280-320nm；流动相：乙腈为流动相A，0.2％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱过程如下：
步骤4、目标化合物的含量计算
步骤4.1、利用混合对照品溶液的高效液相色谱图，计算各色谱峰的峰面积，并以白藜芦醇为内参物，根据相对校正因子计算公式分别计算没食子酸、原儿茶酸的相对校正因子；
其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积，fs/k为校正因子，取平均值作为定量用；
步骤4.2、对供试品溶液的高效液相色谱图中白藜芦醇、没食子酸和原儿茶酸的相对保留时间进行峰定位，并结合步骤4.1中得到的没食子酸和原儿茶酸的相对校正因子，计算供试品溶液中没食子酸与原儿茶酸的含量。
本发明的特点还在于，
步骤1中没食子酸标准溶液的浓度为0.100mg/ml，白藜芦醇标准溶液的浓度为0.416mg/ml，原儿茶酸标准溶液的溶度为0.416mg/ml，混合对照品溶液中没食子酸的浓度为0.040mg/ml，白藜芦醇的浓度为0.0416mg/ml，原儿茶酸的溶度为0.083mg/ml。
步骤2中白蔹供试品的提取过程为：精密称取白蔹过筛粉末，加入75％的乙醇，称重后，超声或者回流提取，用75％的乙醇补足失重，抽滤。
步骤3中高效液相色谱的流动相流速为0.5mL/min-1.5mL/min，进样量为10μL-20μL。
步骤2中水浴锅的温度为80℃-90℃。
步骤2中微孔滤膜的孔径为0.22μm-0.45μm。
75％的乙醇与白蔹过筛粉末的质量比为5-10:1
回流或超声时间为0.5h-2h。
供试品为白蔹药材、炮制品、提取物或相关制剂。
本发明的有益效果是：
(1)本发明一种一测多评法评价白蔹质量的方法，基于高效液相色谱技术，结合一测多评法，该方法准确、可靠，适用于白蔹药材中多成分的含量测定，有利于白蔹药材及相关制剂的全面质量控制，且本方法检测灵敏度高，稳定性好，操作简便，易于掌握，便于进一步推广；
(2)本发明一种一测多评法评价白蔹质量的方法，以白藜芦醇作为内参物，计算白蔹中没食子酸和原儿茶酸的相对校正因子，并用校正因子计算没食子酸、原儿茶酸的含量，不仅大幅度降低检测成本和检测时间，并且简化了白蔹的定量检测方法，简化方法，提高效率，对白蔹的质量控制和临床疗效的保证具有重要意义。
附图说明
图1是本发明一测多评法评价白蔹质量的方法测试过程中混合对照品溶液的高效液相色谱图；
图2是本发明一测多评法评价白蔹质量的方法实施例1中的白蔹供试品的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明所采用的一测多评法评价白蔹质量的方法，以白藜芦醇作为内参物，分别建立没食子酸、原儿茶酸的相对校正因子，用校正因子计算没食子酸、原儿茶酸的含量，实现白蔹的质量控制，具体包括以下步骤：
步骤1、对照品标准溶液制备
步骤1.1、分别取没食子酸标准品、白藜芦醇标准品以及原儿茶酸标准品，溶解后置于容量瓶、用甲醇定容，即得浓度为0.100mg/ml的没食子酸标准溶液、浓度为0.416mg/ml的白藜芦醇标准溶液以及浓度为0.416mg/ml的原儿茶酸标准溶液；
步骤1.2、分别取一定量的没食子酸标准溶液、白藜芦醇标准溶液以及原儿茶酸标准溶液混合后置于容量瓶中，用甲醇定容，得到没食子酸的浓度为0.040mg/ml，白藜芦醇的浓度为0.0416mg/ml，原儿茶酸的溶度为0.083mg/ml的混合对照品溶液；
步骤2、供试品溶液制备
将白蔹粉碎，过筛40目网，精密称取一定量的白蔹过筛粉末，加入白蔹过筛粉末质量5-10倍的75％的乙醇使溶解，称重后，回流或超声0.5h-2h，再用75％的乙醇补足失重，抽滤后，将滤液置于80℃-90℃的水浴锅上蒸干得滤渣，将滤渣溶解于甲醇后置于容量瓶、定容后，过孔径为0.22μm-0.45μm的微孔滤膜，得到供试品溶液，备用；
其中，供试品为白蔹药材、炮制品、提取物或相关制剂；
步骤3、高效液相色谱测定
分别取步骤1.2中制备的混合对照品溶液与步骤2中制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测试，得到混合对照品溶液的高效液相色谱图和供试品溶液的高效液相色谱图；
其中，色谱条件如下：
色谱柱：Agilent HC-C18(4.6×250nm,5μm)；柱温：25℃-35℃；检测波长：280nm-320nm；流动相：乙腈为流动相A，0.2％磷酸水溶液为流动相B；流动相流速：0.5mL/min-1.5mL/min；进样量：10μL-20μL；梯度洗脱过程如下：
步骤4、目标化合物的含量计算
步骤4.1、利用混合对照品溶液的高效液相色谱图，计算各色谱峰的峰面积，并以白藜芦醇为内参物，根据相对校正因子计算公式分别计算没食子酸、原儿茶酸的相对校正因子；
其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积，fs/k为校正因子，取平均值作为定量用；
步骤4.2、对供试品溶液的高效液相色谱图中白藜芦醇、没食子酸和原儿茶酸的相对保留时间进行峰定位，并结合步骤4.1中得到的没食子酸和原儿茶酸的相对校正因子，计算供试品溶液中没食子酸与原儿茶酸的含量。
下面通过具体实施例对本发明的一测多评法评价白蔹质量的方法进行详细说明：
实施例1
一测多评法评价白蔹质量的方法，采用一测多评的方法，以白藜芦醇作为内参物，分别建立没食子酸、原儿茶酸的相对校正因子，用校正因子计算没食子酸、原儿茶酸的含量，实现白蔹的质量控制，具体包括以下步骤：
步骤1、对照品标准溶液制备
步骤1.1、精密称定没食子酸标准品0.0025g、白藜芦醇标准品0.0104g、和原儿茶酸标准品0.0103g分别置于25ml容量瓶中，用甲醇定容，制备成浓度为0.100mg/ml的没食子酸标准品溶液、浓度为0.416mg/ml的白藜芦醇标准品溶液和溶度为0.412mg/ml的原儿茶酸标准品溶液，备用；
步骤1.2、精密量取上述的没食子酸标准品溶液4ml、白藜芦醇标准品溶液1ml、原儿茶酸标准品溶液2ml于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到混合对照品溶液，其中，没食子酸的浓度为0.040mg/ml，白藜芦醇的浓度为0.0416mg/ml，原儿茶酸的溶度为0.083mg/ml；
步骤2、供试品溶液制备
将白蔹药材粉碎，过40目筛网，精密称取10g白蔹过筛粉末置于100ml锥形瓶中，加入白蔹过筛粉末质量10倍的75％的乙醇使溶解，称重后，回流或超声提取1h，再用75％的乙醇补足失重，抽滤后，将滤液置于80℃的水浴锅上蒸干得滤渣，再将滤渣用甲醇溶解后置于50ml容量瓶中并定容至刻度，用0.22μm的微孔滤膜过滤，得到供试品溶液，备用；
步骤3、高效液相色谱测定
分别取步骤1.2中制备的混合对照品溶液与步骤2中制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测试，得到混合对照品溶液的高效液相色谱图和供试品溶液的高效液相色谱图，如图1和图2所示；
其中，色谱条件如下：
色谱柱：Agilent HC-C18(4.6×250nm,5μm)；柱温：25℃；检测波长：290nm；流动相：乙腈为流动相A，0.2％磷酸水溶液为流动相B；流动相流速：0.5mL/min；进样量为10μL；梯度洗脱过程如下：
表1流动相梯度洗脱程序表
步骤4、目标化合物的含量计算
步骤4.1、利用混合对照品溶液6μL、8μL、10μL、15μL、20μL不同体积的高效液相色谱图上的峰面积，并以白藜芦醇作为内参物，根据相对校正因子计算公式分别计算没食子酸、原儿茶酸的相对校正因子(结果见表2)；
其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积，fs/k为校正因子，取平均值作为定量用；
表2没食子酸、原儿茶酸的相对校正因子
步骤4.2、对供试品溶液的高效液相色谱图中白藜芦醇、没食子酸和原儿茶酸的相对保留时间进行峰定位，并结合步骤4.1中得到的没食子酸和原儿茶酸的相对校正因子，计算供试品溶液中没食子酸与原儿茶酸的含量。
步骤5、含量测定方法学考察
(1)线性拟合度考察
吸取混合对照品溶液1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl分别进样，以进样量对峰面积积分值进行线性回归处理，得到没食子酸标准品、原儿茶酸标准品、白藜芦醇标准品的标准曲线；
结果见下表3：
表3没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇的标准曲线
表中建立的三个线性回归方程的R2大于0.999，因此表明：三种标准品的线性关系良好。
(2)供试品溶液稳定性考察
于配制后的0h、2h、8h、12h、24h、36h分别精密吸取供试品溶液10μL进行测定，记录峰面积，经计算得到没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇的RSD分别为1.41％、1.66％、1.98％，均小于2％，结果表明制备的供试品溶液在36h内稳定。
(3)仪器的精密度考察
取该实施例中的混合对照品溶液，重复进样6次，记录各成分的峰面积，没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇的峰面积的RSD分别为0.33％，0.33％，0.28％，均小于3.0％，表明该仪器的精密度良好。
(4)方法的准确度考察
取同一批已测定含量的白蔹药材粉末6份，精密称定，分别精密加入一定量的没食子酸标准品溶液、原儿茶酸标准品溶液、白藜芦醇标准品溶液，测定其含量，分别计算其回收率，没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇的平均加样回收率分别为99.77％、99.10％、98.59％，均在95％～105％范围内，RSD分别为1.83％、2.88％、1.19％，均小于3％，表明该方法的准确度良好。
步骤6、校正因子重现性考察
色谱柱及高效液相色谱仪考察：精密吸取混合对照品溶液10μL，分别考察Shimadzu LC-2010AHT、Agilent1220LC两台不同品牌的高效液相色谱仪，Welch UltisilAQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同型号的色谱柱对相对校正因子的影响，结果表明在不同品牌的高效液相色谱仪、不同的色谱柱下测定的相对校正因子基本一致，说明fs/k的系统耐受性较好，结果见表4：
表4不同仪器和不同色谱柱对校正因子的影响
步骤7、色谱峰专属性考察
精密吸取混合对照品溶液10μL，测定的内参物白藜芦醇的相对保留时间作为定位标准，并且在Shimadzu LC-2010A HT、Agilent1220LC两台两台不同品牌的高效液相色谱仪上，在Welch Ultisil AQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同规格的色谱柱上对其相对保留时间进行考察，根据相对保留时间即可正确判断出目标峰没食子酸、原儿茶酸的准确峰位置，相对保留时间测定结果见表5。
表5不同仪器和不同色谱柱测得的相对保留时间
结果表明，不同仪器和色谱柱下各成分的相对保留时间的RSD均小于5％，因此利用相对保留时间作为白蔹目标色谱峰定位的方法是可行的。
因此，在对照品短缺的情况下，在一测多评法的实际应用中可参考药材的典型色谱图，利用其相对保留值进行定位，根据内参物的保留时间，并结合待测成分色谱峰的紫外吸收特征，能正确判断目标成分色谱峰的位置。
实施例2
一测多评法评价白蔹质量的方法，采用一测多评的方法，以白藜芦醇作为内参物，分别建立没食子酸、原儿茶酸的相对校正因子，用校正因子计算没食子酸、原儿茶酸的含量，实现白蔹的质量控制，具体包括以下步骤：
步骤1、对照品溶液制备
步骤1.1、精密称定没食子酸标准品0.0025g、白藜芦醇标准品0.0104g、和原儿茶酸标准品0.0103g分别置于25ml容量瓶中，用甲醇定容，制备成浓度为0.100mg/ml的没食子酸标准品溶液、浓度为0.416mg/ml的白藜芦醇标准品溶液和溶度为0.412mg/ml的原儿茶酸标准品溶液，备用；
步骤1.2、精密量取上述的没食子酸标准品溶液4ml、白藜芦醇标准品溶液1ml、原儿茶酸标准品溶液2ml于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到混合对照品溶液，其中，没食子酸的浓度为0.040mg/ml，白藜芦醇的浓度为0.0416mg/ml，原儿茶酸的溶度为0.083mg/ml；
步骤2、供试品溶液制备
将白蔹提取物粉碎，过40目筛网，精密称定白蔹过筛粉末10g置于50ml锥形瓶中，加入白蔹过筛粉末质量5倍的75％的乙醇，称重后，回流或超声提取2h，再用75％的乙醇补足失重，抽滤后，将滤液置于90℃的水浴锅上蒸干得到滤渣，将滤渣于25ml容量瓶中用甲醇溶解并定容至刻度，用0.45μm的微孔滤膜过滤，得到供试品溶液，备用；
步骤3、高效液相色谱测定
分别取步骤1.2中制备的混合对照品溶液与步骤2中制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测试，得到混合对照品溶液的高效液相色谱图和供试品溶液的高效液相色谱图；
其中，色谱条件如下：
Agilent HC-C18(250mm×4.6mm，5um)；检测波长：280nm；柱温：30℃；流动相流速：1.5ml/min；流动相：乙腈(A)，0.2％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱50min，乙腈体积分数为梯度增加；进样量15μl。
步骤4、目标化合物的含量计算
步骤4.1、利用混合对照品溶液的高效液相色谱图，计算各色谱峰的峰面积，并以白藜芦醇为内参物，根据相对校正因子计算公式分别计算没食子酸、原儿茶酸的相对校正因子；结果见实施例1中的表2；
其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积，fs/k为校正因子；
步骤4.2、对供试品溶液的高效液相色谱图中白藜芦醇、没食子酸和原儿茶酸的相对保留时间进行峰定位，并结合步骤4.1中得到的没食子酸和原儿茶酸的相对校正因子，计算供试品溶液中没食子酸与原儿茶酸的含量。
步骤5、含量测定方法学考察
(1)线性拟合度考察
精密吸取混合对照品溶液1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl分别进样，以进样量对峰面积积分值进行线性回归处理，得到没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇的标准曲线，结果见实施例1中的表3。
(2)供试品溶液稳定性考察
于配制后的0、2、8、12、24、36h分别精密吸取供试品溶液10μL进行测定，记录峰面积，没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇的RSD分别为1.51％、1.28％、1.79％，均小于2％，结果表明制备的供试品溶液在36h内稳定。
(3)仪器的精密度考察
取该实施例中的混合对照品溶液，重复进样6次，记录各成分的峰面积，没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇的峰面积的RSD分别为0.39％，0.56％，0.48％，均小于3.0％，表明该仪器的精密度良好。
(4)方法的准确度考察
取同一批已测定含量的白蔹药材粉末6份，精密称定，分别精密加入一定量的没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇对照品溶液，测定其含量，分别计算其回收率，没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇的平均加样回收率分别为98.77％、99.90％、101.90％，均在95％～105％范围内，RSD分别为2.83％、2.58％、2.19％，均小于3％，表明该方法的准确度良好。
步骤6、校正因子重现性考察
色谱柱及高效液相色谱仪考察：精密吸取混合对照品溶液10μL，分别考察Shimadzu LC-2010AHT、Agilent1220LC两台不同品牌的高效液相色谱仪，Welch UltisilAQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同型号的色谱柱对相对校正因子的影响，结果表明在不同品牌的高效液相色谱仪、不同的色谱柱下测定的相对校正因子基本一致，说明fs/k的系统耐受性较好，结果见实施例中的表4：
步骤7、色谱峰专属性考察
精密吸取混合对照品溶液10μL，测定的内参物白藜芦醇的相对保留时间作为定位标准，并且在Shimadzu LC-2010A HT、Agilent1220LC两台两台不同品牌的高效液相色谱仪上，在Welch Ultisil AQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同规格的色谱柱上对其相对保留时间进行考察，根据相对保留时间即可正确判断出目标峰没食子酸、原儿茶酸的准确峰位置，相对保留时间测定结果见实施例1中的表5。
结果表明，不同仪器和色谱柱下各成分的相对保留时间的RSD均小于5％，因此利用相对保留时间作为白蔹目标色谱峰定位的方法是可行的。
因此，在对照品短缺的情况下，在一测多评法的实际应用中可参考药材的典型色谱图，利用其相对保留值进行定位，根据内参物的保留时间，并结合待测成分色谱峰的紫外吸收特征，能正确判断目标成分色谱峰的位置。
实施例3
采用一测多评的方法，以白藜芦醇作为内参物，分别建立没食子酸、原儿茶酸的相对校正因子，用校正因子计算没食子酸、原儿茶酸的含量，实现白蔹的质量控制，具体包括以下步骤：
步骤1、对照品溶液制备
步骤1.1、精密称定没食子酸标准品0.0025g、白藜芦醇标准品0.0104g、和原儿茶酸标准品0.0103g分别置于25ml容量瓶中，用甲醇定容，制备成浓度为0.100mg/ml的没食子酸标准品溶液、浓度为0.416mg/ml的白藜芦醇标准品溶液和溶度为0.412mg/ml的原儿茶酸标准品溶液，备用；
步骤1.2、精密量取上述的没食子酸标准品溶液4ml、白藜芦醇标准品溶液1ml、原儿茶酸标准品溶液2ml于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到混合对照品溶液，其中，没食子酸的浓度为0.040mg/ml，白藜芦醇的浓度为0.0416mg/ml，原儿茶酸的溶度为0.083mg/ml；
步骤2、供试品溶液制备
将白蔹药材粉碎，过40目筛网，精密称定白蔹过筛粉末10g置于100ml锥形瓶中，加入白蔹过筛粉末质量8倍的75％的乙醇，称重后，回流或超声提取0.5h，用75％的乙醇补足失重，抽滤后，将滤液置于85℃的水浴锅上蒸干得到滤渣，将滤渣用甲醇溶解后置于100ml容量瓶中用甲醇定容至刻度，用0.35μm的微孔滤膜过滤，得到供试品溶液，备用。
步骤3、高效液相色谱测定
分别取步骤1.2中制备的混合对照品溶液与步骤2中制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测试，得到混合对照品溶液的高效液相色谱图和供试品溶液的高效液相色谱图；
其中，色谱条件如下：
Agilent HC-C18(250mm×4.6mm，5um)；检测波长：320nm；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；流动相：乙腈(A)，0.2％磷酸水溶液(B)，梯度洗脱50min，乙腈体积分数为梯度增加；进样量20μl。
步骤4、相对校正因子的计算
步骤4.1、利用混合对照品溶液的高效液相色谱图，计算各色谱峰的峰面积，并以白藜芦醇为内参物，根据相对校正因子计算公式分别计算没食子酸、原儿茶酸的相对校正因子，结果见实施例1中的表2；
其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积，fs/k为校正因子；
步骤4.2、对供试品溶液的高效液相色谱图中白藜芦醇、没食子酸和原儿茶酸的相对保留时间进行峰定位，并结合步骤4.1中得到的没食子酸和原儿茶酸的相对校正因子，计算供试品溶液中没食子酸与原儿茶酸的含量。
步骤5、含量测定方法学考察
(1)线性拟合度考察
精密吸取混合对照品溶液1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl分别进样，以进样量对峰面积积分值进行线性回归处理，得到没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇的标准曲线，结果见实施例1中的表3。
(2)供试品溶液稳定性考察
于配制后的0h、2h、8h、12h、24h、36h精密吸取供试品溶液10μL分别进行测定，记录峰面积，没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇的RSD分别为1.51％、1.28％、1.79％，均小于2％，结果表明制备的供试品溶液在36h内稳定。
(3)仪器的精密度考察
取对照品溶液，重复进样6次，记录各成分的峰面积，没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇的峰面积的RSD分别为0.39％，0.56％，0.48％，均小于3.0％，表明该仪器的精密度良好。
(4)方法的准确度考察
取同一批已测定含量的白蔹药材粉末6份，精密称定，分别精密加入一定量的没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇对照品溶液，测定其含量，分别计算其回收率，没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇的平均加样回收率分别为98.77％、99.90％、101.90％，均在95％～105％范围内，RSD分别为2.83％、2.58％、2.19％，均小于3％，表明该方法的准确度良好。
步骤6、校正因子重现性考察
色谱柱及高效液相色谱仪考察：精密吸取混合对照品溶液10μL，分别考察Shimadzu LC-2010AHT、Agilent1220LC两台不同品牌的高效液相色谱仪，Welch UltisilAQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同型号的色谱柱对相对校正因子的影响，结果表明在不同品牌的高效液相色谱仪、不同的色谱柱下测定的相对校正因子基本一致，说明fs/k的系统耐受性较好，结果见实施例中的表4：
步骤7、色谱峰专属性考察
精密吸取混合对照品溶液10μL，测定的内参物白藜芦醇的相对保留时间作为定位标准，并且在Shimadzu LC-2010A HT、Agilent1220LC两台两台不同品牌的高效液相色谱仪上，在Welch Ultisil AQ-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Agilent HC-C18柱(4.6×250nm,5μm)、Inertsil ODS-3(4.6×250nm,5μm)3种不同规格的色谱柱上对其相对保留时间进行考察，根据相对保留时间即可正确判断出目标峰没食子酸、原儿茶酸的准确峰位置，相对保留时间测定结果见实施例1中的表5。
结果表明，不同仪器和色谱柱下各成分的相对保留时间的RSD均小于5％，因此利用相对保留时间作为白蔹目标色谱峰定位的方法是可行的。
因此，在对照品短缺的情况下，在一测多评法的实际应用中可参考药材的典型色谱图，利用其相对保留值进行定位，根据内参物的保留时间，并结合待测成分色谱峰的紫外吸收特征，能正确判断目标成分色谱峰的位置。
本发明的实验过程中还对该方法的重复性进行考察，对一测多评法与外标法测定结果比较，具体如下：
(1)重复性进行考察
取同一批白蔹药材粉末6份，进行测定，结果没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇的RSD分别为1.83％、3.65％、2.62％，表明该方法的重复性良好。
(2)一测多评法与外标法测定结果比较
分别取9批白蔹药材粉末，粉碎后过40目筛，分别采用一测多评法和外标法计算不同产地白蔹中没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇的含量，结果见表6。
表6白蔹药材中没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇的含量测定
结果表明：使用一测多评法测定的没食子酸、原儿茶酸的质量与外标法计算的没食子酸、原儿茶酸的质量无显著性差异，一测多评法测定白蔹中没食子酸、原儿茶酸的含量的方法是可行的。
本发明基于高效液相色谱技术，结合一测多评法，同时测定了白蔹中的没食子酸、原儿茶酸、白藜芦醇这三种成分的含量，并比较了外标法和一测多评法所得含量测定结果相互验证，发现两种方法得出结果并无显著性差异，表明该方法准确、可靠，适用于白蔹药材中多成分的含量测定，本发明有利于白蔹药材及相关制剂的全面质量控制，且本方法检测灵敏度高，稳定性好，操作简便，易于掌握，便于进一步推广。
Claims (9)
1.一测多评法评价白蔹质量的方法，其特征在于，具体按照以下步骤进行：
步骤1、对照品标准溶液制备
步骤1.1、分别取没食子酸标准品、白藜芦醇标准品以及原儿茶酸标准品，用甲醇溶解后置于容量瓶、定容，即得没食子酸标准溶液、白藜芦醇标准溶液以及原儿茶酸标准溶液；
步骤1.2、分别取一定量的没食子酸标准溶液、白藜芦醇标准溶液以及原儿茶酸标准溶液混合后置于容量瓶中，用甲醇定容，得到混合对照品溶液；
步骤2、供试品溶液制备
将白蔹粉碎，过40目筛网，经提取、抽滤后，将滤液置于水浴锅上蒸干得滤渣，将滤渣溶解于甲醇后置于容量瓶、定容后，过微孔滤膜，备用；
步骤3、高效液相色谱测定
分别取步骤1.2中制备的混合对照品溶液与步骤2中制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测试，得到混合对照品溶液的高效液相色谱图和供试品溶液的高效液相色谱图；
其中，色谱条件如下：
色谱柱：Agilent HC-C18；柱温：25℃-35℃；检测波长：280-320nm；流动相：乙腈为流动相A，0.2％磷酸水溶液为流动相B，梯度洗脱过程如下：
步骤4、目标化合物的含量计算
步骤4.1、利用混合对照品溶液的高效液相色谱图，计算各色谱峰的峰面积，并以白藜芦醇为内参物，根据相对校正因子计算公式分别计算没食子酸、原儿茶酸的相对校正因子；
其中，Cs为内参物质量浓度，As为内参物色谱峰面积，Ck为其它成分质量浓度，Ak为其他成分色谱峰面积，fs/k为校正因子，取平均值作为定量用；
步骤4.2、对供试品溶液的高效液相色谱图中白藜芦醇、没食子酸和原儿茶酸的相对保留时间进行峰定位，并结合步骤4.1中得到的没食子酸和原儿茶酸的相对校正因子，计算供试品溶液中没食子酸与原儿茶酸的含量。
2.根据权利要求1所述的一测多评法评价白蔹质量的方法，其特征在于，所述步骤1中没食子酸标准溶液的浓度为0.100mg/ml，白藜芦醇标准溶液的浓度为0.416mg/ml，原儿茶酸标准溶液的溶度为0.416mg/ml，混合对照品溶液中没食子酸的浓度为0.040mg/ml，白藜芦醇的浓度为0.0416mg/ml，原儿茶酸的溶度为0.083mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一测多评法评价白蔹质量的方法，其特征在于，所述步骤2中白蔹供试品的提取过程为：精密称取白蔹过筛粉末，加入75％的乙醇，称重后，超声或者回流提取，用75％的乙醇溶剂补足失重，抽滤。
4.根据权利要求1所述的一测多评法评价白蔹质量的方法，其特征在于，所述步骤3中高效液相色谱的流动相流速为0.5mL/min-1.5mL/min，进样量为10μL-20μL。
5.根据权利要求1所述的一测多评法评价白蔹质量的方法，其特征在于，所述步骤2中水浴锅的温度为80℃-90℃。
6.根据权利要求1所述的一测多评法评价白蔹质量的方法，其特征在于，所述步骤2中微孔滤膜的孔径为0.22μm-0.45μm。
7.根据权利要求3所述的一测多评法评价白蔹质量的方法，其特征在于，所述75％的乙醇与白蔹过筛粉末的质量比为5-10:1。
8.根据权利要求7所述的一测多评法评价白蔹质量的方法，其特征在于，所述回流或超声时间为0.5h-2h。
9.根据权利要求1-8任一项所述的一测多评法评价白蔹质量的方法，其特征在于，所述供试品为白蔹药材、炮制品、提取物或相关制剂。
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