CN104090045B - 同时定量检测藁本内酯和洋川芎内酯a的方法 - Google Patents
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Abstract
同时定量检测藁本内酯和洋川芎内酯A的方法。以丁苯酞为替代对照品，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的高效液相色谱法，采用275～284nm范围内的单一波长，分别测定被测样品中藁本内酯（X）和洋川芎内酯A（Y）的峰面积Ax和Ay，根据替代对照品丁苯酞（Z）的浓度Cz和峰面积Az，用校正因子<i>f</i>按下述公式计算被测成分藁本内酯和洋川芎内酯A的浓度C。其中的校正因子<i>fx</i>=0.20～0.25，<i>fy</i><i></i>=0.46～0.54。该方法的检测结果稳定，与以新鲜制备的藁本内酯、洋川芎内酯A为对照品的方法检测结果一致，解决了目前必须要同时采用双波长检测和对HPLC设备要求较高和普适性差的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种以替代对照品同时对藁本内酯和洋川芎内酯A进行定量检测的简便方法。
背景技术
对照品是药品质量评价和监督检验工作的关键。在实际工作中，因有些对照品本身价格昂贵，检验成本很高，而有些对照品又由于不稳定而无法提供，这些都影响了对药品含量的测定，导致药品质量难以控制，是影响药品质量的评价和监督检验的一个重要因素。
藁本内酯、洋川芎内酯A是常用中药当归、川芎等挥发油的主要有效成分。藁本内酯和洋川芎内酯A纯品由于其稳定性差，不能作为国家法定含量测定用对照品进行相应成分的定量检测。
为解决此类问题，谢元超等人在“替代对照品法用于丹参和复方丹参片含量测定的研究”中曾提出了一种采用替代对照品进行含量测定的方法（药物分析杂志，2007,27(4):497）。其基本原理是，采用测定替代对照品相对于对照品的“相对校正因子”的方法，即用由真实对照品与替代对照品检测得到“相对校正因子”（f）：
，
然后用替代对照品结合校正因子对被测样品成分的含量进行检测的方法进行药品质量控制。上述式中Ai为替代对照品的峰面积；Ar为真实对照品的峰面积；Ci为替代对照品的浓度；Cr为真实对照品的浓度。该方法用于检测丹参和复方丹参片中丹酚酸B含量时，采用高效液相色谱方法，分别配制一定浓度的真实对照品和替代对照品的溶液，在一定的色谱条件下，以进样量为横坐标，以峰面积A为纵坐标，分别测定二者的标准曲线，将标准曲线的截距校正为0后，用两条标准曲线斜率K的比值求得校正因子（f）。实际测定样品时，即可用替代对照品进行测定，被测成分浓度C：
，
式中A为被测成分峰面积，由被测成分的浓度即可计算出该成分在被测样品中的含量。该研究结果还表明，在该方法用于检测丹参和复方丹参片中丹酚酸B含量时，校正因子（f）一般可不受色谱仪器、流动相条件及被测物溶液配制浓度等因素的影响，具有进一步研究和应用的价值。
根据上述文献报道，申请人经进一步研究和实验，申请了以丁苯酞作为替代对照品，采用高效液相色谱法（HPLC），双波长检测，测定藁本内酯含量的发明专利（授权公告号：CN101949899B）。但该方法尚存在的缺陷是，必须采用双波长检测，对HPLC设备要求较高，因此普适性差，而且仅能检测单一成分藁本内酯的含量，对如洋川芎内酯A等其它主要成分则无法检测。
发明内容
针对上述情况，本发明提供一种以丁苯酞为替代对照品，采用高效液相色谱法（HPLC），同时对藁本内酯和洋川芎内酯A进行定量检测的方法，以解决由于藁本内酯、洋川芎内酯A纯品稳定性差不能作为国家法定含量测定用对照品而进行定量检测的问题，实现对含藁本内酯和/或洋川芎内酯A成分药物的定量化检测和监控，保证药品质量。
本发明同时定量检测藁本内酯和洋川芎内酯A的方法，同样以丁苯酞为替代对照品，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的高效液相色谱法，采用275～284nm范围内的单一波长，分别测定被测样品中藁本内酯（X）和洋川芎内酯A（Y）的峰面积Ax和Ay，根据替代对照品丁苯酞（Z）的浓度Cz和峰面积Az，用校正因子f按下述公式计算被测成分藁本内酯和洋川芎内酯A的浓度C：
其中，校正因子fx=0.20～0.25；fy=0.46～0.54，校正因子f按下式计算得到：
，
式中Aa为藁本内酯对照品的峰面积，Ca为藁本内酯对照品的浓度；Ab为洋川芎内酯A对照品的峰面积，Cb为洋川芎内酯A对照品的浓度；Az为丁苯酞对照品的峰面积，Cz为丁苯酞对照品的浓度。
实验证明，在上述方法中，特别推荐的几种优选方式可包括：
在检测波长为280nm时，校正因子fx=0.23，fy=0.49；
在检测波长为275nm时，校正因子fx=0.25，fy=0.54；
在检测波长为284nm时，校正因子fx=0.20，fy=0.46。
发明人的深入研究发现，丁苯酞的结构稳定，已是国家法定的对照品，容易获得，价格低廉，且丁苯酞（butylphthalide）与藁本内酯（ligustilide）和洋川芎内酯A（senkyunolideA）均属于苯酞内酯类成分，有相似的化学结构、理化性质和色谱行为。例如，丁苯酞、藁本内酯和洋川芎内酯A的紫外吸收光谱分别如图1中的A、B和C所示。因此，以丁苯酞作为检测藁本内酯和洋川芎内酯A的替代对照品是合适的。
分别取丁苯酞、洋川芎内酯A和藳本内酯对照品溶液适量，在200-400nm范围内扫描，测得其紫外吸收光谱见图1。由图1可见，丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯在280nm附近均有较强的吸收，即为共同吸收波长或波段，经进一步研究优选275～284nm进行单波长检测测定洋川芎内酯A和藳本内酯的含量。
与目前已有报道的研究一致，本发明所述的校正因子（f）一般不受色谱仪器、流动相条件及被测物溶液配制浓度等因素的影响。因此，在本发明上述检测方法中所述的高效液相色谱法中，同样可以采用以甲醇-水形式，或乙腈-水形式的流动相，以等度或梯度方式洗脱。在此基础上，更优选的方式是，在采用甲醇-水为流动相时，甲醇-水的体积比为(30~70):(70~30)；采用以乙腈-水为流动相时，乙腈-水的体积比为(30~60):(70~40)。其中，更好的方式，是使所述的流动相中的水为pH值2-4的酸性水溶液，如以常用较温和的0.02%-0.1%磷酸、0.1%-1%醋酸等酸化的水，可有利于改善样品的HPLC分离效果，提高分离度。
大量的实验结果验证表明，对含藁本内酯和/或洋川芎内酯A成分样品的含量，采用本发明上述方法与以新鲜制备的藁本内酯、洋川芎内酯A为对照品的方法检测结果一致，检测结果稳定和满意。
以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。
附图说明
图1是丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的紫外吸收光谱。
图2是实施例1对照品溶液和供试品溶液的HPLC图谱。
具体实施方式
实施例1
对川芎中藁本内酯、洋川芎内酯A的定量检测：
按照中国药典2010年版一部附录ⅥD规定的高效液相色谱法测定。
1.1色谱条件和系统适用性试验
色谱柱：AgilentEclipseXDB-C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：甲醇-水（50:50）；流速为1.0ml/min；柱温为35℃，检测波长为280nm；理论板数按藁本内酯峰计算应不低于3000。
1.2溶液的配制
1.2.1对照品溶液精密称取丁苯酞对照品49.85mg，置25ml量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得丁苯酞对照品储备溶液；精密称取藁本内酯对照品22.54mg，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得藁本内酯对照品储备溶液；精密称取洋川芎内酯A对照品12.06mg，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得洋川芎内酯A对照品储备溶液。分别精密量取上述对照品储备溶液各1ml，置同一10ml棕色量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液（每1ml含丁苯酞199.4μg，含藁本内酯80.67μg，含洋川芎内酯A43.46μg）。
1.2.2供试品溶液取川芎粉末（过四号筛）约0.2g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理（100W，40KHz）30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，置棕色瓶中，即得。
1.3线性关系考察、检测限和定量限测定
精密吸取上述混合对照品溶液1、2、5、10、15、20μl，按1.1色谱条件分别测定丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的峰面积，重复3次，取平均值。以进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，计算标准曲线，结果见表1。当信噪比(S/N)为3时的被测物浓度为检测限，信噪比(S/N)为10时的被测浓度为定量限，据此测得丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的检测限和定量限见表1。
表1丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的标准曲线、检测限和定量限
| 成分 | 线性方程 | r | 线性范围/μg | 检测限/ng | 定量限/ng |
| 丁苯酞 | Y=539.52X-0.266 | 0.9999 | 0.1994-3.988 | 2.0 | 6.2 |
| 藁本内酯 | Y=2389X-2.0671 | 0.9999 | 0.08067-1.6134 | 0.8 | 2.5 |
| 洋川芎内酯A | Y=1101.5X-0.6444 | 0.9999 | 0.04346-0.8692 | 0.9 | 3.0 |
1.4校正因子的测定及测定方法耐用性考察
根据1.3项下的测定结果，计算藁本内酯对丁苯酞的校正因子fx和洋川芎内酯A对丁苯酞的校正因子fy，结果见表2。
1.5仪器波长对f值测定的影响
精密吸取1.2.1项下的混合对照品溶液，分别在278、279、280、281、282nm波长处测定丁苯酞对照品、藁本内酯对照品和洋川芎内酯A对照品的峰面积，计算校正因子，结果见表3。结果表明波长变化（±2nm）对fx和fy值的影响不大，RSD分别为1.52%和0.82%。
1.6仪器流速对f值测定的影响
分别在0.9、0.98、1.0、1.02、1.1mL/min测定丁苯酞对照品、藁本内酯对照品和洋川芎内酯A对照品的峰面积，计算校正因子，结果见表4。结果表明流速变化对fx和fy值的影响不大，RSD分别为0.07%和0.05%。
1.7仪器柱温对f值测定的影响
分别在26、29、32、35、38℃测定丁苯酞对照品、藁本内酯对照品和洋川芎内酯A对照品的峰面积，计算校正因子，结果见表5。结果表明温度变化对fx和fy值的影响不大，RSD分别为0.29%和0.52%。
1.8流动相组成比例对f值测定的影响
在流动相以甲醇-水的比例为50:50，52:48，54:46时，分别测定丁苯酞对照品、藁本内酯对照品和洋川芎内酯A对照品的峰面积，计算校正因子，结果见表6。表明流动相比例变化对fx和fy值的影响不大，RSD分别为1.69%和0.31%。
1.9不同品牌或不同批号的同类型色谱柱对f值测定的影响
用同一台液相色谱仪(Agilent1200)，分别用不同品牌或不同批号的同类型色谱柱，测定丁苯酞对照品、藁本内酯对照品和洋川芎内酯A对照品的峰面积，计算校正因子，结果见表7。表明不同品牌或不同批号的同类型色谱柱对fx和fy值的影响不大，RSD分别为1.06%和0.23%。
1.10不同液相色谱仪对f值测定的影响
用AgilentEclipseXDB-C18（4.6mm×150mm,5μm）色谱柱，柱号：USKH051741，分别在3台高效液相色谱仪：Agilent1200(色谱仪1)；Waters1525-2487(色谱仪2)；Agilent1100(色谱仪3)上测定。计算校正因子，结果见表8。表明不同高效液相色谱仪对fx和fy值的影响不大，RSD分别为1.67%和1.26%。
1.11精密度试验
精密吸取同一供试品溶液10μL，按1.1色谱条件连续进样6次，记录峰面积，洋川芎内酯A和藁本内酯峰面积的RSD分别为1.07%和0.06%，表明仪器精密度良好，结果见表9。
表9精密度试验结果
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD (%) |
| 洋川芎内酯A | 233.2 | 233.2 | 238 | 232.7 | 232.6 | 237.5 | 1.07 |
| 藁本内酯 | 941.2 | 941.3 | 940 | 940.7 | 940.8 | 940.2 | 0.06 |
1.12稳定性试验
取同一供试品溶液，室温下放置，分别在0、2、4、6、8、24h进样测定峰面积，洋川芎内酯A和藁本内酯峰面积的RSD分别为0.41%和0.27%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好，结果见表10。
表10稳定性试验结果
| 时间（h） | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 24 | RSD (%) |
| 洋川芎内酯A | 252.9 | 253.9 | 255.3 | 254.9 | 255 | 255.8 | 0.41 |
| 藁本内酯 | 1049.7 | 1050.3 | 1055.3 | 1052.7 | 1055.8 | 1056.1 | 0.27 |
1.13重复性试验
取川芎药材粉末(批次：NO.1)0.2g，精密称定，共6份，按1.2.2供试品溶液的制备项下方法制备样品，测定，洋川芎内酯A和藁本内酯的平均含量分别为0.5814%和1.1114%，RSD分别为0.72%和0.68%。表明该方法的重复性良好，结果见表11。
表11重复性试验结果
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD (%) |
| 洋川芎内酯A/% | 0.5790 | 0.5785 | 0.5897 | 0.5810 | 0.5801 | 0.5801 | 0.72 |
| 藁本内酯/% | 1.1079 | 1.1076 | 1.1268 | 1.1087 | 1.1089 | 1.1082 | 0.68 |
1.14加样回收试验
取川芎药材粉末(批次：NO.01)0.1g，精密称定，共6份，分别精密加入含洋川芎内酯A(0.3911mg/ml)和藁本内酯(0.7422mg/ml)的对照品溶液各1.5ml，按1.2.2供试品溶液的制备项下方法制备样品，测定并计算加样回收率，洋川芎内酯A和藁本内酯的平均回收率分别为100.2%和97.4%，RSD分别为1.16%和1.24%，结果见表12和表13。
1.15样品含量测定
1.15.1用替代对照品测定川芎中藁本内酯、洋川芎内酯A含量
取5批川芎样品，按1.2.2项下供试品溶液配制方法操作制成供试品溶液。在1.1项色谱条件下，精密吸取供试品溶液和丁苯酞对照品溶液各5-10μl，注入液相色谱仪，在280nm处检测记录色谱图，测定藁本内酯、洋川芎内酯A和丁苯酞的峰面积。按外标法以丁苯酞为替代对照品进行计算，所得结果分别乘以fx0.23、fy0.49即得到藳本内酯和洋川芎内酯A含量，结果见表14。
1.15.2用对照品测定川芎中藁本内酯、洋川芎内酯A含量
在进行上述1.15.1项测定的同时，精密吸取藳本内酯对照品溶液（0.08067mg/ml）和洋川芎内酯A对照品溶液（0.04346mg/ml）各5μl，注入液相色谱仪，在280nm处检测记录色谱图。按外标法计算藳本内酯、洋川芎内酯A的含量。结果见表15。结果显示，两种方法所测得的含量无明显差异。
在上述操作条件下，对照品溶液和供试品溶液的HPLC图谱如图2所示，图中的A和B分别为混合对照品和川芎供试品的HPLC图谱。
实施例2
对当归中藁本内酯、洋川芎内酯A的定量检测：
照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥD）测定。
2.1色谱条件和系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（30:70）为流动相；流速为1.5ml/min；柱温为40℃，检测波长为280nm；理论板数按藁本内酯峰计算应不低于3000。
2.2溶液的配制
对照品溶液和供试品溶液配制同实施例1。
2.3线性关系考察
精密吸取上述混合对照品溶液1、2、5、10、15、20μl，按1.1色谱条件项下分别测定丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的峰面积，重复3次，取平均值。以进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，计算标准曲线，结果见表15。
表15丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的标准曲线
| 成分 | 线性方程 | r | 线性范围/μg |
| 丁苯酞 | Y=359.1X-1.304 | 0.9999 | 0.1994-3.988 |
| 藁本内酯 | Y=1549.3X-4.671 | 0.9999 | 0.08067-1.6134 |
| 洋川芎内酯A | Y=728.3X-0.702 | 0.9999 | 0.04346-0.8692 |
2.4校正因子的测定
根据2.3项下的测定结果，计算藁本内酯对丁苯酞的校正因子fx=0.234和洋川芎内酯A对丁苯酞的校正因子fy=0.494。
2.5精密度实验
取2.2项下的混合对照品溶液，在2.1项色谱条件下，重复进样6次，记录洋川芎内酯A、藳本内酯和丁苯酞的峰面积，测定结果表明RSD分别为1.26%、0.95%和1.26%。
2.7重复性试验
取同一批药材样品，按2.2项下供试品溶液配制方法操作，平行测定6份，计算藳本内酯的含量为0.93%，RSD为1.63%；当归不含洋川芎内酯A。
2.8回收率试验
取当归药材粉末(批次：NO.01)0.1g，精密称定，共6份，分别精密加入含藁本内酯(0.7422mg/ml)的对照品溶液1.5ml，照2.2供试品溶液的制备项下方法制备样品，测定并计算加样回收率，藁本内酯的平均回收率97.4%，RSD1.24%。
2.9样品溶液稳定性考察
取2.7项下药材提取液1份，精密吸取5μl，分别在0、2、4、8、24h进行测定，记录藳本内酯的峰面积，结果表明当归药材样品溶液在24h内稳定性良好，RSD为0.86%。
2.10样品含量测定
2.10.1用替代对照品测定当归中藁本内酯含量
取5批当归样品，按2.2项下供试品溶液配制方法操作制成供试品溶液。在2.1项色谱条件下，精密吸取供试品溶液和丁苯酞对照品溶液各5-10μl，注入液相色谱仪，在280nm处检测记录色谱图，测定藁本内酯和丁苯酞的峰面积。按外标法以丁苯酞为替代对照品进行计算，所得结果分别乘以fx0.23即得到藳本内酯含量，结果见表16。
2.10.2用对照品测定当归中藁本内酯含量
在上述2.10.1项测定的同时，精密吸取藳本内酯对照品溶液（0.08067mg/ml）5μl，注入液相色谱仪，在280nm处检测记录色谱图。按外标法计算藳本内酯的含量。结果见表16。结果显示，两种方法所测得的含量无明显差异。
实施例3
对川芎中藁本内酯、洋川芎内酯A成分的定量检测：
照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥD）测定。
3.1色谱条件和系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（70:30）为流动相；流速为0.6ml/min；柱温为15℃，检测波长为275nm；理论板数按藁本内酯峰计算应不低于3000。
3.2溶液的配制
对照品溶液和供试品溶液配制同实施例1。
3.3线性关系考察
精密吸取上述混合对照品溶液1、2、5、10、15、20μl，按3.1色谱条件项下分别测定丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的峰面积，重复3次，取平均值。以进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，计算标准曲线，结果见表17。
表17丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的标准曲线
| 成分 | 线性方程 | r | 线性范围/μg |
| 丁苯酞 | Y=913.7X+1.660 | 0.9999 | 0.1994-3.988 |
| 藁本内酯 | Y=3625.1X-19.283 | 0.9999 | 0.08067-1.6134 |
| 洋川芎内酯A | Y=1692.4X-0.902 | 0.9999 | 0.04346-0.8692 |
3.4校正因子的测定
根据3.3项下的测定结果，计算藁本内酯对丁苯酞的校正因子fx=0.250和洋川芎内酯A对丁苯酞的校正因子fy=0.542。
3.5样品含量测定
3.5.1用替代对照品测定川芎中藁本内酯、洋川芎内酯A含量
取5批川芎样品（同实施例1编号01-05），按3.2项下供试品溶液配制方法操作制成供试品溶液。在3.1项色谱条件下，精密吸取供试品溶液和丁苯酞对照品溶液各5-10μl，注入液相色谱仪，在275nm处检测记录色谱图，测定藁本内酯、洋川芎内酯A和丁苯酞的峰面积。按外标法以丁苯酞为替代对照品进行计算，所得结果分别乘以fx0.25、fy0.54即得到藳本内酯和洋川芎内酯A含量，结果见表18。
3.5.2用对照品测定川芎中藁本内酯、洋川芎内酯A含量
在上述3.5.1项测定的同时，精密吸取藳本内酯对照品溶液（0.08067mg/ml）和洋川芎内酯A对照品溶液（0.04346mg/ml）5μl，注入液相色谱仪，在275nm处检测记录色谱图。按外标法计算藳本内酯、洋川芎内酯A的含量。结果见表18。结果显示，两种方法所测得的含量无明显差异，且与实施例1测定结果基本相同。
实施例4
对当归油中藁本内酯成分的定量检测：
照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥD）测定。
4.1色谱条件和系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～15min，42%A；15min～30min，42%～60%A）；流速为1.0ml/min；柱温为35℃，检测波长为280nm；理论板数按藁本内酯峰计算应不低于3000。
4.2溶液的配制
对照品溶液配制同实施例1。
供试品溶液的配制取当归油约0.1g，精密称定，置50ml量瓶中，加无水乙醇约45ml，超声处理（功率100W，频率40kHz）10分钟，放冷，加无水乙醇至刻度，摇匀，取1ml置10ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.3线性关系考察
精密吸取上述混合对照品溶液1、2、5、10、15、20μl，按4.1项色谱条件项下分别测定丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的峰面积，重复3次，取平均值。以进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，计算标准曲线，结果见表19。
表19丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的标准曲线
| 成分 | 线性方程 | r | 线性范围/μg |
| 丁苯酞 | Y=514.0X-3.718 | 0.9999 | 0.1994-3.988 |
| 藁本内酯 | Y=2282.4X-7.264 | 0.9999 | 0.08067-1.6134 |
| 洋川芎内酯A | Y=1057.5X-0.925 | 0.9999 | 0.04346-0.8692 |
4.4校正因子的测定
根据4.3项下的测定结果，计算藁本内酯对丁苯酞的校正因子fx=0.225和洋川芎内酯A对丁苯酞的校正因子fy=0.488。
4.5仪器波长对f值测定的影响
精密吸取4.2项下的混合对照品溶液，分别在278、279、280、281、282nm波长处测定丁苯酞对照品、藁本内酯对照品和洋川芎内酯A对照品的峰面积，计算校正因子，结果见表20。表明波长变化（±2nm）对fx和fy值的影响不大，RSD分别为0.23%和0.59%。
4.6流动相组成比例对f值测定的影响
以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，按表21的梯度条件洗脱，分别测定丁苯酞对照品、藁本内酯对照品和洋川芎内酯A对照品的峰面积，计算校正因子，结果见表21。结果表明在同一台高效液相色谱仪上，流动相比例变化对fx和fy值的影响不大，RSD分别为1.11%和1.44%。
4.7样品含量测定
4.7.1用替代对照品测定当归油中藁本内酯含量
取3批当归油样品，按4.2项下供试品溶液配制方法操作制成供试品溶液。在4.1项色谱条件下，精密吸取供试品溶液和丁苯酞对照品溶液各5-10μl，注入液相色谱仪，在280nm处检测记录色谱图，测定藁本内酯和丁苯酞的峰面积。按外标法以丁苯酞为替代对照品进行计算，所得结果分别乘以fx0.23即得到藳本内酯含量，结果见表22。
4.7.2用对照品测定当归油中藁本内酯含量
在上述4.7.1项测定的同时，精密吸取藳本内酯对照品溶液（0.08067mg/ml）5μl，注入液相色谱仪，在280nm处检测记录色谱图。按外标法计算藳本内酯的含量。结果见表24。结果显示，两种方法所测得的含量无明显差异。
实施例5
对川芎根茎油中藁本内酯、洋川芎内酯A成分的定量检测：
照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥD）测定。
5.1色谱条件和系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（30:70）为流动相；流速为1.5ml/min；柱温为40℃，检测波长为284nm；理论板数按藁本内酯峰计算应不低于3000。
5.2溶液的配制
对照品溶液配制同实施例1。
供试品溶液的配制同实施例4。
5.3线性关系考察
精密吸取上述混合对照品溶液1、2、5、10、15、20μl，按4.1色谱条件项下分别测定丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的峰面积，重复3次，取平均值。以进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，计算标准曲线，结果见表23。
表23丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的标准曲线
| 成分 | 线性方程 | r | 线性范围/μg |
| 丁苯酞 | Y=308.7X+1.207 | 0.9999 | 0.1994-3.988 |
| 藁本内酯 | Y=1530.2X-0.692 | 0.9999 | 0.08067-1.6134 |
| 洋川芎内酯A | Y=666.9X-0.6444 | 0.9999 | 0.04346-0.8692 |
5.4校正因子的测定
根据5.3项下的测定结果，计算藁本内酯对丁苯酞的校正因子fx=0.204和洋川芎内酯A对丁苯酞的校正因子fy=0.464。
5.5样品含量测定
5.5.1用替代对照品测定川芎油中藁本内酯和洋川芎内酯A含量
取3批川芎油样品，按5.2项下供试品溶液配制方法操作制成供试品溶液。在5.1项色谱条件下，精密吸取供试品溶液和丁苯酞对照品溶液各5-10μl，注入液相色谱仪，在284nm处检测记录色谱图，测定藁本内酯、洋川芎内酯A和丁苯酞的峰面积。按外标法以丁苯酞为替代对照品进行计算，所得结果分别乘以fx0.20、fy0.46即得到藳本内酯和洋川芎内酯A含量，结果见表24。
5.5.2用对照品测定川芎油中藁本内酯和洋川芎内酯A含量
在上述5.5.1项测定的同时，精密吸取藳本内酯对照品溶液（0.08067mg/ml）和洋川芎内酯A对照品溶液（0.04346mg/ml）5μl，注入液相色谱仪，在284nm处检测记录色谱图。按外标法计算藳本内酯、洋川芎内酯A的含量。结果见表26。结果显示，两种方法所测得的含量无明显差异。
实施例6
对川芎地上部分挥发油中藁本内酯、洋川芎内酯A成分的定量检测：
照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥD）测定。
6.1色谱条件和系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（60:40）为流动相；流速为0.6ml/min；柱温为15℃，检测波长为280nm；理论板数按藁本内酯峰计算应不低于3000。
6.2溶液的配制
对照品溶液配制同实施例1。
供试品溶液的配制同实施例4。
6.3线性关系考察
精密吸取上述混合对照品溶液1、2、5、10、15、20μl，按2.3色谱条件项下分别测定丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的峰面积，重复3次，取平均值。以进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，计算标准曲线，结果见表25。
表25丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的标准曲线
| 成分 | 线性方程 | r | 线性范围/μg |
| 丁苯酞 | Y=846.2X+5.736 | 0.9999 | 0.1994-3.988 |
| 藁本内酯 | Y=3641.6X-2.629 | 0.9999 | 0.08067-1.6134 |
| 洋川芎内酯A | Y=1719.1X+1.337 | 0.9999 | 0.04346-0.8692 |
6.4校正因子的测定
根据6.3项下的测定结果，计算藁本内酯对丁苯酞的校正因子fx=0.232和洋川芎内酯A对丁苯酞的校正因子fy=0.491。
6.5样品含量测定
6.5.1用替代对照品测定川芎油中藁本内酯和洋川芎内酯A含量
取3批川芎油样品，按6.2项下供试品溶液配制方法操作制成供试品溶液。在6.1项色谱条件下，精密吸取供试品溶液和丁苯酞对照品溶液各5-10μl，注入液相色谱仪，在280nm处检测记录色谱图，测定藁本内酯、洋川芎内酯A和丁苯酞的峰面积。按外标法以丁苯酞为替代对照品进行计算，所得结果分别乘以fx0.23、fy0.49即得到藳本内酯和洋川芎内酯A含量，结果见表26。
6.5.2用对照品测定川芎油中藁本内酯和洋川芎内酯A含量
在上述6.5.1项测定的同时，精密吸取藳本内酯对照品溶液（0.08067mg/ml）和洋川芎内酯A对照品溶液（0.04346mg/ml）5μl，注入液相色谱仪，在280nm处检测记录色谱图。按外标法计算藳本内酯、洋川芎内酯A的含量。结果见表26。结果显示，两种方法所测得的含量无明显差异。
在上述实施例1～例6的操作条件下，对照品溶液和供试品溶液中的检测成分达到色谱基线分离，且线性关系、精密度、稳定性、重现性、回收率等方法学考察结果均符合现行版《中国药典》附录ⅩⅧA“中药质量标准分析方法验证指导原则”的要求。
Claims (8)
1.同时定量检测藁本内酯和洋川芎内酯A的方法，其特征是以丁苯酞为替代对照品，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的高效液相色谱法，采用275～284nm范围内的单一波长，分别测定被测样品中藁本内酯（X）和洋川芎内酯A（Y）的峰面积Ax和Ay，根据替代对照品丁苯酞（Z）的浓度Cz和峰面积Az，用校正因子f按下述公式计算被测成分藁本内酯和洋川芎内酯A的浓度C：
其中，校正因子fx=0.20～0.25；fy=0.46～0.54，校正因子f按下式计算得到：
，
式中Aa为藁本内酯对照品的峰面积，Ca为藁本内酯对照品的浓度；Ab为洋川芎内酯A对照品的峰面积，Cb为洋川芎内酯A对照品的浓度；Az为丁苯酞对照品的峰面积，Cz为丁苯酞对照品的浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是检测波长为280nm时，校正因子fx=0.23，fy=0.49。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是检测波长为275nm时，校正因子fx=0.25，fy=0.54。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是检测波长为284nm时，校正因子fx=0.20，fy=0.46。
5.如权利要求1至4之一所述的方法，其特征是所述的高效液相色谱法中以甲醇-水或乙腈-水为流动相。
6.如权利要求5所述的方法，其特征是以甲醇-水为流动相时，甲醇-水的体积比为(30~70):(70~30)；以乙腈-水为流动相时，乙腈-水的体积比为(30~60):(70~40)。
7.如权利要求1至4之一所述的检测方法，其特征是所述的高效液相色谱法中以甲醇-酸性水溶液或乙腈-酸性水溶液为流动相，其中酸性水溶液的pH值为2-4。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征是以甲醇-酸性水溶液为流动相时，甲醇-酸性水溶液的体积比为(30~70):(70~30)；以乙腈-酸性水溶液为流动相时，乙腈-酸性水溶液的体积比为(30~60):(70~40)。
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