CN105067725A - 一种同时测定参梅养胃颗粒中白芍、甘草和丹参的含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定参梅养胃颗粒中白芍、甘草和丹参的含量的方法，通过采用合适的色谱条件，实现了同时测定参梅养胃颗粒中白芍、甘草和丹参的含量的方法。本发明操作简便，分析数据准确，既节省了分析人员的分析时间，提高了工作效率，延长了色谱柱的使用寿命，降低了成本，同时保证了制剂的稳定性，提高了可控性。

Description

一种同时测定参梅养胃颗粒中白芍、甘草和丹参的含量的方法

技术领域

本发明涉及一种中药复方制剂的含量测定方法，特备涉及一种同时测定参梅养胃颗粒中白芍、甘草和丹参的含量的方法。

背景技术

参梅养胃颗粒的性状为棕色的颗粒；味微苦；功能主治：养阴和胃，用于胃痛灼热，嘈杂似饥，口咽干燥，大便干结；浅表性胃炎，胃阴不足型慢性胃炎及各种胃部不适症。其药物成分为北沙参、山楂、乌梅、红花、莪术、土木香、蒲公英、丹参、甘草、白芍、当归。目前，市面上销售有江苏中兴药业有限公司提供的参梅养胃颗粒，批号：150303，150401，150410，规格16g×6袋。

目前，参梅养胃颗粒的药物疗效已经得到临床的肯定，但药物的疗效只有在质量可控的前提下才能得到保证，药物原有的质量控制方法及其简单粗糙，更不能全面、准确的反应和控制该复方制剂的质量。目前，还没有一种可以同时测定参梅养胃颗粒中白芍、甘草和丹参的含量的方法。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种可以同时测定参梅养胃颗粒中白芍、甘草和丹参的含量的方法。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明提供了一种同时测定参梅养胃颗粒中白芍、甘草和丹参的含量的方法，按照高效液相色谱法测定，参照中国药典2010年版一部附录VID，其中，色谱条件与系统适用性试验：

以用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积分数为0.17％磷酸为流动相B进行梯度洗脱，线性梯度洗脱方式为：0～5min，10％A→15％A；5～14min，15％A→25.5A；14～20min，25.5％A→25.5％A；20～35min，25.5％A→50％A；35～40min，50％→50％；检测波长为232nm；流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃；进样体积：10μL；

对照品溶液的制备：精密秤取适量芍药苷、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸铵作为对照品，加入甲醇制成对照品储备液，各储备液浓度为：芍药苷，220.4μg·mL^-1；甘草苷，181.2μg·mL^-1；丹酚酸B，186.6μg·mL^-1；甘草酸铵，163.6μg·mL^-1，取不同体积的上述储备液加甲醇稀释后，制成不同浓度的对照品混合溶液；

供试品溶液的制备：精密称取参梅养胃颗粒1g，精确至0.0001g，加入25mL甲醇，超声处理40min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

优选地，在对照品储备液的制备中，加入的甲醇的体积分数为60％～100％。

更优选地，在对照品储备液的制备中，加加入的甲醇的体积分数为90％甲醇。

优选地，在供试品溶液的制备中，加入的甲醇的体积分数为60％～100％。

更优选地，在供试品溶液的制备中，加入的甲醇的浓度为90％甲醇。

优选地，在供试品溶液的制备中，功率为300～500W，频率50～100KHz，超声时间20～60min。

更优选地，在供试品溶液的制备中，功率为300W，频率50KHz，超声时间40min。

在一种更优选的实施方式中，本发明同时测定参梅养胃颗粒中白芍、甘草和丹参的含量的方法，按照下述步骤进行：按照高效液相色谱法测定，参照中国药典2010年版一部附录VID，其中，色谱条件与系统适用性试验：

以用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积分数为0.17％磷酸为流动相B进行梯度洗脱，线性梯度洗脱方式为：0～5min，10％A→15％A；5～14min，15％A→25.5A；14～20min，25.5％A→25.5％A；20～35min，25.5％A→50％A；35～40min，50％→50％；检测波长为232nm；流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃；进样体积：10μL；

对照品溶液的制备：精密秤取适量芍药苷、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸铵作为对照品，加90％甲醇制成对照品储备液，各储备液浓度为：芍药苷，220.4μg·mL-1；甘草苷，181.2μg·mL-1；丹酚酸B，186.6μg·mL-1；甘草酸铵，163.6μg·mL-1，取不同体积的上述储备液加90％甲醇(体积分数)稀释后，制成不同浓度的对照品混合溶液；

供试品溶液的制备：精密称取参梅养胃颗粒1g，精确至0.0001g，加入25mL90％甲醇(体积分数)，超声处理，功率300W，频率50KHz，40min，放冷，加90％甲醇(体积分数)至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

有益效果：与现有技术相比，本发明首次提出了一种可以同时测定参梅养胃颗粒中白芍、甘草和丹参的含量的方法，使用同一色谱条件即可实现同时测定，操作简便，分析数据准确，既节省了分析人员的分析时间，提高了工作效率，延长了色谱柱的使用寿命，降低了成本，同时保证了制剂的稳定性，提高了可控性。

附图说明

图1为参梅养胃颗粒供试品的紫外扫描图；

图2为甲醇浓度对提取率的影响，其中，A为芍药苷，B为甘草苷，C为丹酚酸B，D为甘草酸铵；

图3为液固比对提取率的影响，其中，A为芍药苷，B为甘草苷，C为丹酚酸B，D为甘草酸铵；

图4为超声时间对提取率的影响，其中，A为芍药苷，B为甘草苷，C为丹酚酸B，D为甘草酸铵；

图5为芍药苷(A)、甘草苷(B)、丹酚酸B(C)和甘草酸铵(D)标准曲线；

图6为样品(A)、对照品(B)、缺白芍阴性样品(C)、缺丹参阴性样品(D)、缺甘草阴性样品(E)及阴性样品(F)的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例详细说明本发明，但不用于限制本发明。

本发明提供了一种同时测定参梅养胃颗粒中白芍、甘草和丹参的含量的方法。

1.1仪器与色谱条件AgilentLC1260高效液相色谱系统(安捷伦科技有限公司)，自动进样；色谱柱：KromasilC₁₈(150nm×4.6nm，5μm)；流动相：乙腈(A)：0.17％磷酸水溶液(B)，线性梯度洗脱(0～5min，10％A→15％A；5～14min，15％A→25.5A，14～20min，25.5％A→25.5％A，20～35min，25.5％A→50％A；35～40min，50％A→50％A)；检测波长：232nm；流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃；进样体积：10μL。H66MC超声清洗机(无锡超声仪器厂)；METTLERAE240分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；1810-B型自动双重纯水蒸馏器(上海申立玻璃仪器公司)；旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；紫外分光光度计(SHIMADZU，UV-2550)；RO-MB-10D纯水仪(杭州永豪工贸有限公司)；芍药苷对照品(中国食品药品鉴定研究所，批号：110736-201438，供含量测定用)；甘草苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111610-201106，供含量测定用)；丹酚酸B对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111562-201313，供含量测定用)；甘草酸铵对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110731-201418)；甘草酸铵对照品：批号110731-201418(供含量测定用，中国食品药品鉴定研究所提供)；

参梅养胃颗粒(江苏中兴药业有限公司提供，批号：150303，150401，150410，规格16g×6袋)；乙腈(色谱纯，TediaCompany)，甲醇(色谱纯，TediaCompany)，磷酸(分析纯，中国苏州振亚化工场)，水(超纯水，实验室自制)。

1.2检测波长确定取供试品溶液，用紫外分光光度仪进行光谱检测，结果表明，图谱显示提取液在232nm及321nm处有最大吸收，查阅《中国药典》(2010版一部)可知，芍药苷检测波长为230nm，丹酚酸B检测波长为286nm，甘草苷和甘草酸铵检测波长为237nm，根据仪器条件及紫外扫描结果，选取232nm为检测波长。(见图1)。

1.3提取条件优化

1.3.1最佳提取浓度的确定

取150303批样品颗粒，研细，取粉末五份，每份1.0g，精密称定，置50mL容量瓶中，加20mL不同浓度(60％，70％，80％，90％，100％)的甲醇溶液，超声处理(功率300W，频率50KHz)40min，放冷，加相应提取溶剂至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“1.1项下”色谱条件进样，结果图2所示。

1.3.2最佳液固比的确定

取150303批样品颗粒，研细，取粉末五份，每份1.0g，精密称定，置50mL容量瓶中，按不同液固比(10，15，20，25，30)，分别加90％甲醇溶液，即分别加入10ml、15ml、20ml、25ml、30ml的90％甲醇溶液超声处理(功率300W，频率50KHz)40min，放冷，加90％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“1.1项下”色谱条件进样，结果图3所示。

1.3.3最佳超声时间的确定

取150303批样品颗粒，研细，取粉末五份，每份1.0g，精密称定，置50mL容量瓶中，加25mL90％甲醇溶液，超声处理(功率300W，频率50KHz)相应时间(20min，30min，40min，50min，60min)，放冷，加90％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“1.1项下”色谱条件进样，结果图4所示。

1.4溶液的制备

对照品溶液的制备精密秤取适量芍药苷、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸铵对照品，加90％甲醇制成对照品储备液。各储备液浓度为：芍药苷，220.4μg·mL^-1；甘草苷，181.2μg·mL^-1；丹酚酸B，186.6μg·mL^-1；甘草酸铵，163.6μg·mL^-1。取不同体积的上述储备液加甲醇稀释后，制成不同浓度的对照品混合溶液。

供试品溶液的制备精密称取参梅养胃颗粒1g(精确至0.0001g)，加入25mL90％甲醇，超声处理(功率300W，频率50KHz)40min，放冷，加90％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.5线性关系考察按上述方法制备储备液，精密量取上述储备液，二倍稀释(1，2，4，8，16)，按照上述色谱条件，于高效液相色谱仪中测定，记录峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，对照品浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，见图5。芍药苷、甘草苷、丹酚酸B和甘草酸铵的回归方程及线性范围分别为Y＝14.06X+9.462(1.38～22.04μg/mL，R²＝0.999)；Y＝23.51X+2.066(0.27～4.35μg/mL，R²＝0.997)；Y＝16.83X+2.52(1.17～18.06μg/mL，R²＝0.999)；Y＝4.663X+0.7(0.61～9.82μg/mL，R²＝0.999)。

1.6检测限与定量限测定先进样一针空白溶剂，测出噪音水平，在进样已知低浓度的对照品溶液，根据其对应的峰高值，将对照品溶液稀释至约3倍信噪比的浓度(S/N＝3)，即为检测限(LOD)；约10倍信噪比的浓度(S/N＝10)即为定量限(LOQ)。在选定的色谱条件下，芍药苷的检测限与定量限分别为8.82ng和26.45ng，甘草苷的检测限与定量限分别为0.04ng和0.12ng，丹酚酸B的检测限与定量限分别为0.06ng和0.14ng，甘草酸铵的检测限与定量限分别为1.28ng和4.34ng，并且在定量限浓度下重复进样6次，芍药苷峰面积的RSD为1.5％，甘草苷峰面积的RSD为1.6％，丹酚酸B峰面积的RSD为2.3％，甘草酸铵峰面积的RSD为1.2％。

1.7空白试验按处方中药味的比例，分别自配仅不含白芍、仅不含甘草、仅不含丹参及同时不含白芍、甘草、丹参的群药，按其工艺制成空白制剂，再按供试品溶液的制备方法制备并测定，结果不含白芍空白溶液在芍药苷对照品相同保留时间处未显明显的色谱峰，不含甘草空白溶液在甘草苷和甘草酸铵对照品相同保留时间处未显明显的色谱峰，不含丹参空白溶液在丹酚酸B对照品相同保留时间处未显明显的色谱峰，不含白芍、甘草及丹参空白溶液同时在芍药苷、甘草苷和甘草酸铵及丹酚酸B对照品相同保留时间处未显明显的色谱峰，认为无干扰。对照品、供试品、阴性供试品色谱图见图6。

1.8精密度试验精密吸取同一供试品溶液(批号150303)10μL，重复进样5次，求得芍药苷、甘草苷、丹酚酸B及甘草酸铵RSD分别为0.82％，2.53％，1.22％，2.36％，见表1。

表1仪器精密度试验结果

1.9重复性试验称取同一批号(批号150303)样品五份，每份一袋，按上述方法制备同一浓度供试品溶液，并按上述HPLC条件进行测定记录峰面积，结果见表2，芍药苷、甘草苷、丹酚酸B及甘草酸铵RSD分别为2.60％，3.29％，2.76％，3.04％。

表2重复性试验结果

1.10加样回收率试验精密称取已知量的同一批次样品(批号：150303)9份，每份1g，置于50mL容量瓶中，平均分为3组，分别精密加入于样品中所含芍药苷、甘草苷、丹酚酸B及甘草酸铵量的80％、100％、120％的对照品溶液，按供试品制备方法制备成同一浓度样品溶液，依法测定，根据标准曲线，按峰面积分别计算芍药苷、甘草苷、丹酚酸B及甘草酸铵的加样回收率，结果见表3～表6。

表3芍药苷加样回收率结果

表4甘草苷加样回收率结果

表5丹酚酸B加样回收率结果

表6甘草酸铵加样回收率结果

1.11样品测定按上述方法分别制备混标溶液和供试品溶液，并采用上述HPLC条件依次对3批样品(批号150303，150401，150410)进行含量测定，结果见表7。

表7参梅养胃颗粒中芍药苷、丹酚酸B及甘草酸铵测定结果(n＝3)

本发明首次提出了一种可以同时测定参梅养胃颗粒中白芍、甘草和丹参的含量的方法，使用同一色谱条件即可实现同时测定，操作简便，分析数据准确，既节省了分析人员的分析时间，提高了工作效率，延长了色谱柱的使用寿命，降低了成本，同时保证了制剂的稳定性，提高了可控性。

Claims (8)

1.一种同时测定参梅养胃颗粒中白芍、甘草和丹参的含量的方法，其特征在于，按照高效液相色谱法测定，参照中国药典2010年版一部附录VID，其中，色谱条件与系统适用性试验：

以用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积分数为0.17％磷酸为流动相B进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱方式为：0～5min，10％A→15％A；5～14min，15％A→25.5A；14～20min，25.5％A→25.5％A；20～35min，25.5％A→50％A；35～40min，50％→50％；检测波长为232nm；流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃；进样体积：10μL；

对照品溶液的制备：精密秤取适量芍药苷、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸铵作为对照品，加甲醇制成对照品储备液，各储备液浓度为：芍药苷，220.4μg·mL^-1；甘草苷，181.2μg·mL^-1；丹酚酸B，186.6μg·mL^-1；甘草酸铵，163.6μg·mL^-1，取不同体积的上述储备液加甲醇稀释后，制成不同浓度的对照品混合溶液；

供试品溶液的制备：精密称取参梅养胃颗粒1g，精确至0.0001g，加入25mL甲醇，超声处理，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在对照品储备液的制备中，加入的甲醇的体积分数为60％～100％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在对照品储备液的制备中，加入的甲醇的体积分数为90％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在供试品溶液的制备中，加入的甲醇的体积分数为60％～100％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在供试品溶液的制备中，加入的甲醇的体积分数为90％。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在供试品溶液的制备中，功率为300～500W，频率50～100KHz，超声时间20～60min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在供试品溶液的制备中，功率为300W，频率50KHz，超声时间40min。

8.一种同时测定参梅养胃颗粒中白芍、甘草和丹参的含量的方法，其特征在于，按照高效液相色谱法测定，参照中国药典2010年版一部附录VID，其中，色谱条件与系统适用性试验：

以用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积分数为0.17％磷酸为流动相B进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱方式为：0～5min，10％A→15％A；5～14min，15％A→25.5A；14～20min，25.5％A→25.5％A；20～35min，25.5％A→50％A；35～40min，50％→50％；检测波长为232nm；流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃；进样体积：10μL；

对照品溶液的制备：精密秤取适量芍药苷、甘草苷、丹酚酸B、甘草酸铵作为对照品，加90％甲醇制成对照品储备液，各储备液浓度为：芍药苷，220.4μg·mL^-1；甘草苷，181.2μg·mL^-1；丹酚酸B，186.6μg·mL^-1；甘草酸铵，163.6μg·mL^-1，取不同体积的上述储备液加体积分数90％甲醇稀释后，制成不同浓度的对照品混合溶液；

供试品溶液的制备：精密称取参梅养胃颗粒1g，精确至0.0001g，加入25mL体积分数为90％甲醇，超声处理，功率300W，频率50KHz，40min，放冷，加如体积分数为90％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。