CN104330482B - 一种利用hplc同时测定茶叶中17种特征成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用HPLC同时测定茶叶中17种特征成分的方法，包括：采用高效液相色谱法同时测定茶叶中的17种特征成分，根据17种特征成分各自的标准曲线得到茶叶样品中该17种特征成分的含量；色谱条件为：色谱柱柱温31～33℃，甲醇和1％甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长280～285nm。本发明以17种特征成分为代表建立的HPLC分析方法，可以同时对有机酸、儿茶素、黄酮、咖啡碱进行测定，增加谱图信息量的表达，并且使茶叶样品各种有效成分的分离度有所提高，较全面地反映茶叶的化学成分和品质特性，有利于茶叶质量控制，同时，也可以通过谱图建立茶叶指纹图谱，为原产地域和地理标志名茶的保护提供技术支持。

Description

一种利用HPLC同时测定茶叶中17种特征成分的方法

技术领域

本发明涉及一种茶叶的检测方法，具体涉及一种利用HPLC同时测定茶叶中有机酸、儿茶素、黄酮和咖啡因等17种特征成分的方法。

背景技术

茶叶中含有丰富的多酚类物质、黄酮类物质、有机酸和生物碱，它们是茶叶中重要的生物活性物质。多酚类物质中以儿茶素含量最高，含量约占茶多酚总量的70％左右，具有抗氧化和清除自由基的作用。茶叶中黄酮以槲皮素、山奈酚、杨梅素及其苷类为主。茶叶中的有机酸是香气和滋味的主要成分之一，参与茶树的新陈代谢，常为糖类分解的中间产物，种类较多，含量为干物质总量的3％左右。生物碱是茶树重要的代谢产物，其中咖啡碱占主体。

这四大类物质在茶叶保健功效中的具有重要作用，对其化合物分离和含量测定的报道也很多。

例如，公开号为CN103743703A的中国发明专利申请文献公开了一种采用近红外光谱快速检测茶叶中主要成分的方法，包含以下步骤：(1)茶叶样本的准备：收集了茶叶样品，编号后，装在铝箔样品袋中；密封冷藏；(2)近红外光谱的采集：基于Workflow设定标准工作流程(SOP)和分析方法，采集茶叶样品漫反射光谱图；(3)漫反射光谱光谱预处理：对光谱图进行“一阶或二阶导数+Norris滤噪”处理；(4)模型的建立：使用专门的化学计量学软件，建立起近红外光谱图与标准方法对同一样品测量出了的数据之间的数学模型；(5)模型的验证：按照与第2步完全相同的方法，在近红外仪器上测量新的茶叶样品，并用第4步建立好的模型进行测量，与按照国标标准方法测量的结果进行比较。

公开号CN103033578A的中国发明专利申请文献公开了一种基于内含成分的快速初筛茶树优异资源的方法，是取生长条件与生长势基本一致的茶树芽头第一片展开叶，用液氮冷冻处理后，将叶片捣碎，直接以甲醇快速提取，离心，取上清液，利用高效液相色谱检测茶叶中内含成分，比较各内含成分含量，从中初步筛选优异茶树种质资源，在此基础之上，采用已知方法对初筛的优异种质资源进一步进行复筛。

高效液相色谱法(HPLC)由于具有分离效能高、分析速度快等优点，在茶叶有效成分的分离检测中应用较多，但目前还没有相关报道同时检测茶叶中四大类相关物质10多种成分的研究报道。

发明内容

本发明提供了一种利用HPLC同时测定茶叶中17种特征成分的方法，以茶叶中有机酸、儿茶素、黄酮和咖啡碱为研究对象，选取17种特征成分(没食子酸、原儿茶酸、阿魏酸、香草酸、对香豆酸、芥子酸、对羟基苯甲酸苯甲酸、没食子酸儿茶素(GC)、儿茶素(C)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、槲皮素、山奈素和咖啡因(CAF))，利用HPLC法同时测定，达到四类物质同时分离的目的。

一种利用HPLC同时测定茶叶中17种特征成分的方法，包括：

采用高效液相色谱二级阵列管检测法同时测定茶叶中的17种特征成分，根据所述17种特征成分各自的标准曲线得到茶叶样品中该17种特征成分的含量；所述高效液相色谱二级阵列管检测法的条件为：采用HypersilGOLDPFP色谱柱，柱温为31～33℃，以甲醇和1％甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为280～285nm；

所述17种特征成分为：没食子酸、原儿茶酸、没食子酸儿茶素、对羟基苯甲酸、香草酸、儿茶素、表没食子儿茶素、咖啡因、对香豆酸、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、阿魏酸、没食子儿茶素没食子酸酯、芥子酸、表儿茶素没食子酸酯、槲皮素和山奈素。

本发明流动相优选为甲醇和1％甲酸水溶液。

色谱柱主要是硅胶基质，低pH值能帮助抑制硅羟基的活性，减小拖尾，从而改善峰形，提高分离度。在分析有机酸时，pH值低于3时，色谱柱较稳定，出峰效果较好。本发明在研究时对比了0.1％甲酸(pH2.65)和1％甲酸(pH2.10)作为流动相对分离效果的影响。0.1％甲酸与甲醇作流动相时，EGC和咖啡因难分离，且部分峰有前拖尾现象；1％甲酸作流动相时，分离效果比较好，无拖尾现象(如图2所示)。乙腈和甲醇对分离度的影响也不同，乙腈作流动相时，儿茶素与EGC不能分离，且有机酸出峰太早，甲醇作流动相时，17种物质均能分离。因此，本发明优选甲醇和1％甲酸水溶液作为流动相。

作为优选，梯度洗脱过程如表1所示，流动相中甲醇的浓度分别为：

0～5min，保持5％甲醇；5～15min，5％～10％甲醇；15～25min，10％～15％甲醇；25～45min，15％～30％甲醇；45～70min，30％～65％甲醇；70～71min，65％～5％甲醇；71～72min，5％甲醇。

表1梯度洗脱程序

甲醇浓度对保留时间影响最大，当甲醇初始浓度大于5％时，保留时间缩短，但有机酸类与儿茶素类出峰会有部分重叠，综合考虑检测时间和分离度两方面，甲醇初始浓度定为5％；甲醇浓度在5％～10％时，保证多数有机酸会出峰；甲醇浓度从10％到25％是儿茶素类的出峰浓度；对于黄酮类组分，黄酮苷元出峰时间较晚，选择甲醇比例30％～65％，尽可能保证黄酮类完全出峰。

进一步优选，流动相的流速为1mL/min；检测时进样量为10μL；色谱柱的规格为100mm×4.6mm，3μm。

作为优选，所述柱温为32℃。

本发明的柱温为31～33℃，优选为32℃。本发明研究了柱温在25℃，30℃，35℃时对各组分分离度的影响，发现柱温为25℃时，EGC与咖啡因不能完全分离；柱温为30℃时，EGC与咖啡因色谱峰仍有部分重叠；柱温为35℃时，EGC与咖啡因基线分离，但EGCG与阿魏酸色谱峰重合；在32℃时，17种成分基本达到基线分离，标准图谱如图2所示。因此，本发明柱温选择32℃为佳。

作为优选，所述检测波长为280nm。

本发明检测波长为280～285nm，优选为280nm。高效液相色谱法与二极管阵列检测器联用，可对被分离组分在紫外-可见波长范围内扫描获得其吸收光谱。本发明对17个标准物质在200～700nm进行光谱扫描，发现儿茶素类和咖啡因均在280nm处有较高灵敏度，有机酸的最大吸收波长在320nm左右，黄酮类的最大吸收波长为360nm。但有机酸和黄酮在280nm处的紫外吸收也相对较高，而且稳定，因此，综合考虑，本发明确定280nm为检测波长能有效保证各组分检测灵敏度。

所述茶叶样品的处理方法如下：

茶叶样品均匀粉碎，称取粉碎后的样品，采用50％乙醇水溶液进行超声提取，超声提取后用水定容，上清液经0.22μm有机滤膜过滤，备用。

优选地，所述超声提取的时间为30min。

具体步骤为：称取1.0000g(精确到0.0001g)茶粉，加入50％乙醇水溶液50mL，超声波振荡提取30min，加水定容至100mL，上清液经0.22μm有机滤膜过滤后备用。

本发明的检测方法在本发明的检测条件下，不需要对样品做特殊处理，就能将有机酸、儿茶素、黄酮、咖啡碱四种不同类别的17种物质很好的分开，节省了检测时间和成本。

基于本发明的实验结果，本发明检测方法的最佳色谱条件如下：

色谱柱：HypersilGOLDPFP色谱柱(100mm×4.6mm，3μm)；

流动相：甲醇+1％甲酸溶液；

梯度洗脱程序(如表1所示)：0～5min，保持5％(体积比)甲醇；5～15min，5％～10％甲醇；15～25min，10％～15％甲醇；25～45min，15％～30％甲醇；45～70min，30％～65％甲醇；70～71min，65％～5％甲醇；71～72min，保持5％甲醇；

检测波长：280nm；

柱温：32℃；

流速：1mL/min；

进样量：10μL。

在上述最优的色谱条件组合下，本发明的方法只需对茶叶样品做简单处理，就能够很好的同时分离茶叶中的17种特征成分。

在上述色谱条件下，本发明方法检出限：没食子酸0.010g/mL，原儿茶酸没食子酸儿茶素(GC)0.94g/mL、对羟基苯甲酸香草酸儿茶素(C)表没食子儿茶素咖啡因(CAF)0.066g/mL、对香豆酸表儿茶素(EC)表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)阿魏酸没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)芥子酸表儿茶素没食子酸酯(ECG)槲皮素山奈素

与现有的测定方法相比，本发明具有如下有益效果：

茶叶中多种成分同时测定，简化了检测方法，缩短检测时间，提高检测效率。以17种特征成分为代表建立的HPLC分析方法，可以同对有机酸、儿茶素、黄酮、咖啡碱进行测定，大大增加了谱图信息量的表达，并且使茶叶样品各种有效成分的分离度有所提高，较全面地反映了茶叶的化学成分和品质特性，有利于茶叶的质量控制。

本发明方法具有较好的精密度、稳定性和重复性，适用于茶叶中有机酸、儿茶素类、咖啡碱和黄酮类成分的分析。并且，运用此方法首次在径山茶中检测到香草酸成分。

附图说明

图1是0.1％甲酸+甲醇做流动相时的标准品色谱图。

图2是17种混标溶液的HPLC图；

其中：1—没食子酸、2—原儿茶酸、3—没食子儿茶素(GC)、4—对羟基苯甲酸、5—香草酸、6—儿茶素、7—表没食子儿茶素(EGC)、8—咖啡因(CAF)、9—对香豆酸(4-Hydroxycinnamicacid)、10—表儿茶素(EC)、11—表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、12—阿魏酸、13—没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、14—芥子酸、15—表儿茶素没食子酸酯(ECG)、16—槲皮素、17—山奈素

图3是径山茶样品的HPLC图(色谱峰对应的成分名称与图2一致)。

图4-1～图4-17是17种标准物质的标准曲线图(其中，图4-1～4-17与图2中1～17一一对应)。

具体实施方式

除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682-2008的要求。

甲醇：色谱纯；乙醇：分析纯；甲酸：分析纯。

50％乙醇溶液(体积分数)：分别量取乙醇和水各500mL混合，备用。

1％甲酸溶液(体积分数)：量取10mL甲酸，加入1000mL高纯水中，经水相微孔滤膜(0.45μm)过滤。

测试仪器：高效液相色谱仪：高效液相色谱仪配有四元泵、二极管阵列检测器；天平：感量为0.0001g；超声波清洗仪；粉碎机。

实施例1

标准溶液的配制：

(1)标准品：没食子酸(98.0％，购自比利时Acros公司)，咖啡因(99.0％，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司)，山奈素(≥99％、购自上海诗丹德生物技术有限公司)，儿茶素(C)(≥98％)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)(≥95％)、表儿茶素(EC)(≥98％)、没食子儿茶素(GC)(≥95％)、表没食子儿茶素(EGC)(≥95％)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)(≥98％)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)(≥98％)，购自Sigma公司；槲皮素(≥98％)、原儿茶酸(≥98％)、阿魏酸(≥98％)、对香豆酸(≥98％)、香草酸(98％)、芥子酸(98％)、对羟基苯甲酸(99％)，购自国家标准物质研究中心。

准确称取固体标准品(没食子酸(G)、原儿茶酸、没食子酸儿茶素(GC)、对羟基苯甲酸、香草酸、儿茶素(C)、表没食子儿茶素(EGC)、咖啡因(CAF)、香豆酸、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、阿魏酸、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、芥子酸、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、槲皮素、山奈素)各0.0020g，分别用乙醇定容至10mL，配制成各标准物质含量为2.000g/L的标准储备液。

(2)混合标准工作液：精密吸取各标准储备溶液置于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.06g/L的混合标准溶液，经有机相微孔滤膜(0.22μm)过滤后，按如下色谱条件进行分析测试，得到相应的图谱，以浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标作图绘制标准曲线，17种成分的标准曲线如图4-1～图4-17所示，各成分的线性方程与相关系数与表2中线性方程及相关系数一致。

色谱柱：HypersilGOLDPFP色谱柱(100mm×4.6mm，3μm)

流动相：甲醇(A)+1％甲酸溶液(B)

梯度洗脱程序(如表1所示)：0～5min，保持5％A；5～15min，5％～10％A；15～25min，10％～15％A；25～45min，15％～30％A；45～70min，30％～65％A；70～71min，65％～5％A；71～72min，保持5％A。检测波长：280nm

柱温：32℃

流速：1mL/min

进样量：10μL。

混合标准工作液的HPLC图如图2所示。

样品处理：

茶叶样品均匀粉碎，称取1.0000g(精确到0.0001g)样品于小烧杯中，加入50％乙醇水溶液50mL，置超声波振荡提取30min，转移到100mL容量瓶，加水定容，上清液经0.22μm有机滤膜过滤后上机测试。

高效液相色谱条件：

色谱柱：HypersilGOLDPFP色谱柱(100mm×4.6mm，3μm)

流动相：甲醇A+1％甲酸溶液B

梯度洗脱程序：0～5min，保持5％A；5～15min，5％～10％A；15～25min，10％～15％A；25～45min，15％～30％A；45～70min，30％～65％A；70～71min，65％～5％A；71～72min，保持5％A。检测波长：280nm

柱温：32℃

流速：1mL/min

进样量：10μL。

测定：

取处理液和混合标准工作液各10μL，依次注入高效液相色谱仪进行分离，以其标准溶液峰面积和保留时间为依据定性，以峰面积求出样液中被测物质含量，供计算。

结果计算：

样品中没食子酸(G)、原儿茶酸、没食子酸儿茶素(GC)、对羟基苯甲酸、香草酸、儿茶素(C)、表没食子儿茶素(EGC)、咖啡因(CAF)、对香豆酸、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、阿魏酸、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、芥子酸、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、槲皮素、山奈素的含量按下式计算：

$X=\frac{c\×V\×1000}{m\×1000}$

式中：

X—样品中待测组分含量，单位为克每千克(g/kg)；

C—由对应标准曲线得出的样液中待测物的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

V—样品定容体积，单位为毫升(mL)；

m—样品质量，单位为克(g)。

各种物质的线性范围、回归方程、相关系数和检出限，精密度如表2所示：

表217种混标的线性范围、回归方程、相关系数、检出限及精密度

*Y：peakarea；X：massconcentration，mg/L

精密度、稳定性和重复性试验

精密度试验：取同一样品按上述样品处理方法制备样液，连续进样6次，每次10L，在相同的色谱条件下分析样液中检出成分的含量，计算其相对标准偏差RSD值。实验结果得出，茶样中含有没食子酸、GC、香草酸、儿茶素、EGC、咖啡因、对香豆酸、EC、EGCG、GCG、ECG和山奈素共12种成分，各成分含量的RSD值为0.081％～2.06％(详见表4)，表明精密度良好。

稳定性试验：取刚制备好的样液，每隔0、2、4、8、12、24h进样一次，每次10L，根据样液中检出成分的含量，计算其RSD值。茶样中12种成分含量的RSD值为0.10％～2.79％(详见表4)。结果表明，供试品溶液在24h内测定的色谱结果是稳定的。

重复性试验：取同一茶样，按样品处理方法平行制备6份样液，进样10L进行色谱分析，根据检出组分在样品中的含量，计算RSD值。结果得出，茶样中12种成分含量的RSD值为0.98％～4.43％(详见表3)，测定重复性良好。

表3精密度、稳定性和重复性试验结果(n＝6)

回收率实验

称取径山毛峰茶样0.5000g，在0.50、1.00mg两个加标水平下平行检测3次，加标回收率结果见表4，由于茶样本底大，所以回收率波动较大，尤其是咖啡因、EGCG等在茶叶中含量很高的成分。17种特征成分的回收率均在75.2～133％之间。

表4样品中17种特征成分的回收率和相对标准偏差(n＝3)

实施例2

按照实施例1的测定方法，得到的60个茶样特征物质含量，其中1～54号样品为径山毛峰；55～56号样品为钱塘龙井，57～58号样品为红茶，59～60号样品为安溪铁观音，具体测定结果如表5所示：

表5

(注：：GA-没食子酸；GC-没食子酸儿茶素；C-儿茶素；EGC-表没食子儿茶素；CAF-咖啡因；EC-表儿茶素；EGCG-表没食子儿茶素没食子酸酯；GCG-没食子儿茶素没食子酸酯；ECG-表儿茶素没食子酸酯。)

由上表可知，以上11种特征成分可由本发明的方法同时测出，为径山毛峰茶样所共有。其中，54号径山毛峰的谱图如图3所示。

55^#～56^#茶样为钱塘龙井，其EGCG含量明显低于径山茶，GCG含量均高于径山茶。57^#～58^#茶样为红茶，均不含GC、香草酸和儿茶素。59^#～60^#茶样为铁观音，均不含香草酸。由此可见，通过本发明的方法能够得到11种特征成分的含量，可以对径山茶与其他品种的茶进行初步区分。此外，应用本方法，首次在径山茶中检出香草酸成分。

Claims (8)

1.一种利用HPLC同时测定茶叶中17种特征成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用高效液相色谱二级管阵列检测法同时测定茶叶中的17种特征成分，根据所述17种特征成分各自的标准曲线得到茶叶样品中该17种特征成分的含量；所述高效液相色谱二级管阵列检测法的条件为：采用HypersilGOLDPFP色谱柱，柱温为31～33℃，以甲醇和1％甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为280～285nm；

所述17种特征成分为：没食子酸、原儿茶酸、没食子酸儿茶素、对羟基苯甲酸、香草酸、儿茶素、表没食子儿茶素、咖啡因、对香豆酸、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、阿魏酸、没食子儿茶素没食子酸酯、芥子酸、表儿茶素没食子酸酯、槲皮素和山奈素；

所述梯度洗脱过程中，流动相中甲醇的浓度分别为：

0～5min，5％甲醇；5～15min，5％～10％甲醇；15～25min，10％～15％甲醇；25～45min，15％～30％甲醇；45～70min，30％～65％甲醇；70～71min，65％～5％甲醇；71～72min，5％甲醇。

2.根据权利要求1所述利用HPLC同时测定茶叶中17种特征成分的方法，其特征在于，所述柱温为32℃。

3.根据权利要求1所述利用HPLC同时测定茶叶中17种特征成分的方法，其特征在于，所述检测波长为280nm。

4.根据权利要求1所述利用HPLC同时测定茶叶中17种特征成分的方法，其特征在于，流动相的流速为1mL/min。

5.根据权利要求1所述利用HPLC同时测定茶叶中17种特征成分的方法，其特征在于，检测时进样量为10μL。

6.根据权利要求1所述利用HPLC同时测定茶叶中17种特征成分的方法，其特征在于，所述色谱柱的规格为100mm×4.6mm，3μm。

7.根据权利要求1所述利用HPLC同时测定茶叶中17种特征成分的方法，其特征在于，所述茶叶样品的处理方法如下：

茶叶样品均匀粉碎，称取粉碎后的样品，采用50％乙醇水溶液进行超声提取，超声提取后加水定容，上清液经0.22μm有机滤膜过滤，备用。

8.根据权利要求7所述利用HPLC同时测定茶叶中17种特征成分的方法，其特征在于，所述超声提取的时间为30min。