CN110161166A - 一种茶多酚中egcg含量的快速检测方法 - Google Patents

一种茶多酚中egcg含量的快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分析化学领域，尤其涉及超高效液相色谱快速检测技术，具体是一种以茶多酚为原料，利用超高效液相色谱检测技术，高效快速检测茶多酚中EGCG含量的方法，采用C18色谱柱，以一定比例的水‑冰醋酸‑甲醇为流动相，通过梯度洗脱的方式，实现茶多酚中EGCG含量的快速检测，该色谱条件下EGCG的理论塔板数大于16000，分离度大于3。采用本检测方法，使较难分离的EGCG、EC和咖啡因得到有效分离，且检测时间短，灵敏度高，重现性好，高效快捷，可用于EGCG的含量检测和质量控制。

Description

一种茶多酚中EGCG含量的快速检测方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，尤其涉及超高效液相色谱快速检测技术，具体是一种以茶多酚为原料，利用超高效液相色谱检测技术，高效快速检测EGCG含量的方法。
背景技术
茶多酚（tea polyenohs，Tp）主要由儿茶素、黄酮、酚酸、花色素4大类物质组成。而儿茶素（catechins）占茶多酚总量的 60%～80%。现代研究表明，儿茶素既是理想的天然抗氧化剂，又是一类极有价值的天然药物原料，它具有抗肿瘤、降血压、降血脂、抗氧化、抗衰老以及抑菌、抗艾滋病病毒等功效。茶多酚中儿茶素类单体化合物主要有表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）等，其中最具生物活性的是EGCG。
近年来，世界发达国家积极推进儿茶素产品的开发应用，以其作为天然抗氧化剂和自由基清除剂，已广泛应用于食品加工、医药保健和日用化工等领域，尤其是FDA确认儿茶素具有药效功能后，国际市场对其需求量日增。研究各种儿茶素的药理活性和协同作用以及其在体内的代谢情况，开发儿茶素类新药，均需大量高纯度的各类儿茶素单体。尤其是酯型儿茶素EGCG，其功效远远大于其他儿茶素组分，已成为临床应用研究的焦点。
检索到有关茶多酚中EGCG含量的检测方法文献如下：
1、“高效液相色谱法测定茶多酚中EGCG和RECG的含量”，刘锦文等，《食品工业科技》，2010年第11期，摘要：建立茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和表儿茶素没食子酸酯（ECG）的高效液相色谱含量测定方法。方法：以Diamonsil C18（4.6mm×200mm，5μm）为色谱柱，流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液（68:32），流速为1.0mL/min，检测波长为279nm，柱温25℃，进样量为20μL。结果：EGCG的进样量在0.1-6μg范围内，ECG的进样量在0.05-1.2μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。平均加样回收率分别为EGCG：97.57％、ECG：96.60％，RSD分别为EGCG：1.93％、ECG：1.53％。结论：本方法简便，准确，重复性好，可作为茶多酚中EGCG和ECG的含量测定方法。
2、“反相高效液相色谱法测定茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯的含量”，王菊萍等，第16卷第15期，2006年8月，摘要：采用反相高效液相色谱法测定茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的含量。方法以甲醇：水：乙酸=26:73.5:0.5(体积比)为流动相(1.0mL／min)，C18柱(250.0mm × 4.6 mm，5μm)，UV检测器(278nm)。结果EGCG在0.1503-0.6517mg／mL范围内线性关系良好(r=0.9995)，平均回收率为100.26％，RSD为0.86％。结论该法简便、快速，可作为测定茶多酚中EGCG含量的方法。
3、“HPLC法快速测定茶多酚中儿茶素类及咖啡因含量”，李萌等，中国医药导刊，2007年第9卷第6期(总第53期)，摘要：建立茶多酚中4种儿茶素类成分(EGC、EGCG、EC、ECG)和咖啡因的HPLC等度洗脱一次进样检测方法。方法：采用C18色谱柱，流动相为水：甲醇：乙酸=73:23:2的等度洗脱反相HPLC法在16min内完成检测。结果：样品分析时，除EGCG的色谱峰分离度>1外，其它各组分的分离度均>1.5；各组分的加样回收率在98.88％-101.85%之间。结论：该检测方法准确、稳定、重复性好，可正确定量茶多酚中的5种组分。
4、“高效液相色谱法测不同茶叶中EGCG的含量”，孙晓琴等，绵阳师范学院学报，2010年11月，第29卷第11期，摘要：采用高效液相色谱法对不同茶叶中的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的含量进行分析。采用Cl8色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流动相为甲醇：水：乙酸(23:75:2，V/V)，流速1.0 mL/min，柱温35℃，检测波长为272nm。EGCG线性范围为0.11-1.71μg，相关系数r=0.9996，平均回收率98.7％，RSD为0.7％。本方法分析速度快，灵敏度高，分离效果好，可作为测定茶叶中EGCG含量的方法。
现有技术中，EGCG的含量检测，主要是采用高效液相色谱法。但是，目前的检测方法溶剂种类较多，配制复杂，且检测时间较长，流速快，溶剂消耗量大，检测成本高，不适用于常规检测和质量控制。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，以茶多酚为原料，基于超高效液相色谱快速检测技术，采用C18色谱柱，以一定比例的水-冰醋酸-甲醇为流动相，通过梯度洗脱的方式，实现EGCG含量的高效快速检测。
为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：
一种茶多酚中EGCG含量的快速检测方法，包括以下步骤：
（1）超高效液相色谱条件设定；色谱柱为C18柱，以浓度为1.0-2.5%的醋酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，洗脱方式为梯度洗脱，流速为0.3-0.8mL/min，柱温为20-40℃，检测波长272-280nm，进样量0.05-0.50μL；所述流动相A和B在洗脱过程中的体积百分比为（75-95）:（5-25）；
（2）对照品溶液的配制：精密称取EGCG、EC、EGC、GCG、ECG和咖啡因对照品适量，加入无水乙醇进行溶解并定容，作为对照品溶液；
（3）供试品溶液的配制：精密称取适量茶多酚，加入无水乙醇进行溶解并定容，作为供试品溶液；
（4）标准曲线的绘制：精密称取EGCG对照品若干份，配制成相应级别的对照品溶液，分别进样，测定，以EGCG的量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程；
（5）含量测定：取茶多酚供试品溶液，按色谱条件进样，将进样结果代入回归方程计算出供试品中EGCG的含量。
作为优选，步骤（1）所述流动相A中醋酸的浓度为1.0%。
作为优选，步骤（1）所述流速为0.55mL/min，柱温为35℃，检测波长为276nm，进样量为0.50μL，运行时间9min。
作为优选，步骤（1）所述梯度洗脱，具体洗脱条件为：
所述快速检测方法，还包括系统适用性试验的步骤。具体为：取茶多酚供试品溶液，按色谱条件进样，记录色谱图，计算理论塔板数和分离度。
所述快速检测方法，还包括对超高效液相色谱仪进行精密度检测的步骤。具体为：取对照品溶液，按色谱条件重复测定6次，计算峰面积的RSD，分析仪器的精密度。
所述快速检测方法，还包括对供试品溶液的稳定性进行检验的步骤。具体为：取同一供试品溶液，按色谱条件分别在不同时间段进样测定，计算其中EGCG的含量，进而计算RSD，分析供试品溶液的稳定性。
所述快速检测方法，还包括检测方法重复性的检验步骤。具体为取同一批样品若干份，制备供试品溶液，进样测定，计算其中EGCG的含量，进而计算出RSD，分析所述检测方法的重复性。
所述快速检测方法，还包括进行加样回收率试验的步骤。具体为：精密称取已测知含量的同一批样品若干份，分别精密加入EGCG对照品溶液适量，制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率。
本发明的有益效果：
1、本发明选用醋酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，甲醇作为流动相，为类质子溶剂，可形成氢键，在本发明中可提高选择性。甲醇的脱洗能力强，甲醇与水混合时发热，多余的溶解空气较易变为脱出气泡，脱气容易。醋酸水溶液可根据pKa调节pH值，一定程度上抑制样品组分的解离。
现有技术中多采用添加乙腈作为流动相，本发明选择在不选用乙腈的情况下，仍然能达到很好的检测效果，并且优于现有技术。而不选用乙腈是由于乙腈一般是（由氨和丙烯）大规模生产丙烯腈的副产物。其中可能含有多种很少量的杂质，其中一些杂质不仅会造成较高的基线和鬼峰，进而影响定性定量分析，而且会污染分析柱、堵塞系统，导致仪器出现故障。并且乙腈水溶液容易分解为醋酸与氨，在分析时导致基线太高，容易对结果分析造成影响。并且乙腈属于属高度危险品、中等毒类，对皮肤和黏膜有刺激作用，对操作人员容易造成健康危害。
2、本发明采用梯度脱洗，是指在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比的洗脱方式。本发明的梯度洗脱与现有技术的洗脱不同，现有技术的洗脱的梯度变化是按一定梯度往上升或按一定梯度往下降。而本发明的具体洗脱条件为：流动相A与流动相B的体积百分比以5%的梯度变化幅度，从95%:5%一直变化到75%:25%，再梯度回到95%:5%。梯度洗脱能够规避掉等度洗脱的问题，例如梯度洗脱的样品峰，无论先出峰还是后出峰的组分，它们的峰形基本都能保证尖锐对称。其次本发明的梯度脱洗能保证在较短的时间内，让样品中强保留组分也能被洗脱出来。
3、理论塔板数（theoretical plate number,N）用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。本发明在设定的色谱条件下EGCG的理论塔板数大于16000，分离度大于3。表明本发明的色谱柱的分离效果好，分离度优异。
4、本发明采用超高效液相色谱检测技术，使用较简单的溶剂配比，以梯度洗脱的方式，能有效的分离茶多酚中EGCG、EC、EGC、GCG、ECG和咖啡因，其中EGCG、EC和咖啡因是较难分离的，如果分离不完全，有残留的EC或咖啡因，容易影响EGCG的检测，而本发明分离EGCG、EC和咖啡因的分离率高，无残留，可以实现EGCG的精确定量。
5、本发明使用的流动相的流速为0.3-0.8mL/min，进样量0.05-0.50μL，流速慢，进样量少，且本发明的检测时间为9分钟，与现有技术相比，大大减少了检测时间，检测时间短，从而流量小，减少了溶剂的使用量，避免不必要的浪费，进而减小对环境的污染，对操作人员身体健康的危害。
6、本发明使用的流动相配比简单，所采用方法简便、快速，准确，稳定，检测灵敏度高，重现性好，分离度优异，对称性及峰形很好，保留时间适中，检测时间短，检测效率高，操作简便，检测成本低，可有效用于EGCG含量的快速测定和质量控制。
附图说明
图1为EGCG对照品超高效液相色谱图；
图2为EGC对照品超高效液相色谱图；
图3为咖啡因对照品超高效液相色谱图；
图4为EC对照品超高效液相色谱图；
图5为GCG对照品超高效液相色谱图；
图6为ECG对照品超高效液相色谱图；
图7为茶多酚样品超高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。
实施例1：
（1）超高效液相色谱条件的设定：
采用安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱（2.1×50 mm,1.8μm），以甲醇－1%醋酸为流动相，流速为0.55mL/min，柱温为35℃，检测波长为276nm，进样量为0.50μL，采用梯度洗脱的方式，具体洗脱条件见下表：
（2）对照品溶液的配制：分别精密称取EGCG、EC、EGC、GCG、ECG和咖啡因对照品1.29、1.02、1.43、1.10、1.03、0.25mg，加入无水乙醇进行溶解并定容至5mL，作为对照品溶液；
（3）供试品溶液的配制：精密称取茶多酚4.14mg，加入无水乙醇进行溶解并定容至5mL，作为供试品溶液；
（4）系统适用性试验：
取茶多酚供试品溶液，按色谱条件进样，记录色谱图，结果理论塔板数按EGCG计n＞16000，主峰与周围的峰分离度R＞3。说明在此色谱条件下，供试品分离良好。
（5）线性关系的考察
精密称取EGCG对照品，分别配制成0.0293、0.0585、0.1270、0.2550、0.3910、0.5080mg/mL6个级别的对照品溶液，分别进样，测定，以各成分的量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为：y = 1305.19696 x - 0.74893，相关系数R=0.99992，表明EGCG含量在0.016-0.254μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。
（6）精密度试验
取EGCG对照品溶液，按色谱条件重复测定6次，结果峰面积分布为336.457、336.301、336.118、335.815、336.637和336.2656，RSD为0.09%，表明方法的精密度良好。
（7）稳定性试验
取同一供试品溶液，按色谱条件分别在0，2，4，8，12，24 h进样测定，计算其中EGCG的含量，结果见表，RSD为0.21％，表明供试品溶液中EGCG在24 h内稳定。
（8）重复性试验
取同一批样品6份，制备供试品溶液，进样测定，计算其中EGCG的含量，结果见表，RSD为0.09％，表明溶液的重复性良好。
（9）加样回收率试验
精密称取已测知含量（0.443g/g）的同一批样品6份，每份约4mg，分别精密加入EGCG对照品溶液（0.521 mg/mL）适量，制备供试品溶液。进样测定，计算其中EGCG的含量，结果见表，平均回收率为100.23％（n＝6），RSD为2.18％。
（10）样品的测定
取5批样品，制备供试品溶液，按色谱条件进样，测定，用外标法计算样品中EGCG的含量（g/g）。

Claims (8)

1.茶多酚中EGCG含量的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）超高效液相色谱条件设定；色谱柱为C18柱，以浓度为1.0-2.5%的醋酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，洗脱方式为梯度洗脱，流速为0.3-0.8mL/min，柱温为20-40℃，检测波长272-280nm，进样量0.05-0.50μL；所述流动相A和B在洗脱过程中的体积百分比为（75-95）:（5-25）；
（2）对照品溶液的配制：精密称取EGCG、EC、EGC、GCG、ECG和咖啡因对照品适量，加入无水乙醇进行溶解并定容，作为对照品溶液；
（3）供试品溶液的配制：精密称取茶多酚适量，加入无水乙醇进行溶解并定容，作为供试品溶液；
（4）线性关系的考察：精密称取EGCG对照品若干份，配制成相应级别的对照品溶液，分别进样，测定，以EGCG的量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程；
（5）含量测定：取茶多酚供试品溶液，按色谱条件进样，将进样结果代入回归方程计算出供试品中EGCG的含量。
2.根据权利要求1所述的茶多酚中EGCG含量的快速检测方法，其特征在于：所述的流动相A中醋酸的浓度为1.0-2.5%。
3.根据权利要求1所述的茶多酚中EGCG含量的快速检测方法，其特征在于：所述的梯度洗脱，具体洗脱条件为：流动相A与流动相B的体积百分比以5%的梯度变化幅度，从95%:5%一直变化到75%:25%，再梯度回到95%:5%。
4.根据权利要求1所述的茶多酚中EGCG含量的快速检测方法，其特征在于：还包括进行系统适用性试验的步骤。
5.根据权利要求1所述的茶多酚中EGCG含量的快速检测方法，其特征在于：还包括对超高效液相色谱仪进行精密度检测的步骤。
6.根据权利要求1所述的茶多酚中EGCG含量的快速检测方法，其特征在于：还包括对供试品溶液的稳定性进行检验的步骤。
7.根据权利要求1所述的茶多酚中EGCG含量的快速检测方法，其特征在于：还包括检测方法重复性的检验步骤。
8.根据权利要求1所述的茶多酚中EGCG含量的快速检测方法，其特征在于：还包括进行加样回收率试验的步骤。
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