CN106404935A - 一种茶多酚中ec含量的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种茶多酚中EC含量的检测方法，包括(1)设定高效液相色谱条件；(2)制备对照品溶液；(3)制备供试品溶液；(4)含量测定；分别取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱图，然后利用色谱图计算EC的含量。本发明所述检测方法以梯度洗脱方式，能有效地分离开茶多酚中较难分离的EGCG和EC两种主要成分；且该方法简便，灵敏度高，重现性好，样品分离度、对称性及峰形均较好，且保留时间适中，更加适合于常规检测，可有效用于EC含量的检测和质量控制。

Description

一种茶多酚中EC含量的检测方法
技术领域
本发明涉及一种化合物检测方法，具体涉及一种茶多酚中EC含量的检测方法。
背景技术
癌症已成为21世纪威胁人类生存的头号杀手，平均每年有600多万人死于各种癌症。中国已成为世界癌症高发国之一，每年新增200多万名癌症患者，占全球总数的20％，并且每年呈快速增长趋势。临床上目前治疗癌症的药物主要是化学药品，但由于化学药物毒性大，在杀死肿瘤细胞的同时也无选择性的杀死白细胞、淋巴细胞等自身免疫细胞，导致各种并发症和严重的不良反应，而且疗程长，费用高，在临床使用中有较大的局限性。中药在治疗癌症方面有独特的优势，以中药为代表的天然药物具有毒副作用小、作用靶点多样、耐受性好等特点，在治疗肿瘤方面越来越受到重视。
茶多酚，又名抗氧灵、维多酚、防哈灵，是茶叶中所含的一类多羟基类化合物，简称TP，主要化学成分为儿茶素类(黄烷醇类)、黄酮及黄酮醇类、花青素类、酚酸及缩酚酸类、聚合酚类等化合物的复合体。其中儿茶素类化合物为茶多酚的主体成分，占茶多酚总量的65％～80％。儿茶素类化合物主要包括儿茶素(EC)、没食子儿茶素(EGC)、儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)4种物质。研究表明，茶多酚等活性物质具解毒和抗辐射作用，能有效地阻止放射性物质侵入骨髓，并可使锶90和钴60迅速排出体外，被健康及医学界誉为“辐射克星”。
EC为茶多酚中的主要的组成成分之一，本发明的发明者研究发现，目前尚未有有效的检测方法对其进行质量控制，研究及开发一种适合于常规检测EC含量的检测方法则显得尤为重要。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种茶多酚中EC含量的检测方法,该方法操作简单，具有良好的精密度、重现性和可靠性，可用于EC含量的检测和质量控制。
技术方案：为了实现上述目的一种茶多酚中EC含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)设定高效液相色谱条件：色谱柱为C18，以浓度为0.1％-0.2％的乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，洗脱方式为梯度洗脱，流速为0.8-1.2mL·min-1，柱温为20-40℃，检测波长为275-281nm，进样量10-20μl；所述流动相A和B在液相进行过程中的体积比为(69-92)：(8-31)；
(2)制备对照品溶液：称取EC对照品，加入流动相A制成溶液，作为对照品溶液；
(3)制备供试品溶液：称取茶多酚粉末，加入流动相A，超声提取，静置，摇匀，滤过，作为供试品溶液；
(4)含量测定：分别取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱图，然后，利用色谱图计算EC的含量。
作为优选，步骤(1)所述流动相A中乙酸的浓度为0.1％。
作为优选，步骤(1)所述检测波长为278nm。
作为优选，步骤(1)所述流速为1.00mL·min-1，柱温为35℃，进样量20μl。
作为优选，所述流动相A和B在液相进行过程中0分钟开始的体积比为92：8；25分钟开始为69：31；35分钟开始后为92：8。
所述检测方法，还包括对EC对照品溶液浓度X和峰面积积分值Y进行线性回归的步骤；所述步骤为制备不同浓度的对照品溶液按上述色谱条件进行测定，得到不同的峰面积积分值，以峰面积积分值(Y)和对照品溶液浓度(X)进行线性回归，得回归方程。
所述检测方法，还包括对高效液相色谱仪进行精密度检测的步骤；所述步骤为将制备的对照品溶液，按上述色谱条件连续进样进行测定，得到不同的峰面积积分值，计算RSD，分析仪器精密度。
所述检测方法，还包括对供试品溶液的稳定性进行检测的步骤；所述步骤为制备供试品溶液，按上述色谱条件在不同时间分别进样测定，测得不同峰面积积分值，计算RSD，分析供试品溶液的稳定性。
所述检测方法，还包括检验EC含量的检测方法的重复性的步骤；所述步骤为制备多份平行供试品溶液，按上述色谱条件分别进样测定，测得不同峰面积积分值，计算RSD，分析所述方法重复性。
所述检测方法，还包括进行加样回收率实验的步骤；所述步骤为取已知含量的EC样品，加入相应量的对照品，按上述方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算加样回收率。
所述检测方法，还包括进行EC定量限测定的步骤；所述步骤为将制备的对照品溶液稀释测定，测得信噪比10∶1时，分析EC的最低检测浓度。
所述检测方法，还包括EC检测限测定的步骤；所述步骤为将制备的对照品溶液稀释测定，测得信噪比3：1时，分析EC的最低检测浓度。
有益效果：与现有技术相比，本发明的茶多酚中EC含量的检测方法具有以下优点；本发明所述检测方法以梯度洗脱方式，能有效地分离开茶多酚中较难分离的EGCG和EC两种主要成分；且该方法简便，灵敏度高，重现性好，样品分离度、对称性及峰形均较好，且保留时间适中，更加适合于常规检测，可有效用于EC含量的检测和质量控制。
附图说明
图1为EC的结构示意图；
图2为实施例4EC对照品溶液的高效液相色谱图；
图3为实施例7EC样品重复性检测的高效液相色谱图；
图4为某一批次的EC样品的高效液相色谱图；
图5为另一批次的EC样品的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
检测方法
(1)设定高效液相色谱条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18：4.6×250mm，5um，以浓度为0.1％的乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，洗脱方式为梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1，柱温为35℃，检测波长为278nm，进样量20μl，流动相A和B在液相进行过程中0分钟开始的体积比为92：8；25分钟开始为69：31；35分钟开始后为92：8；理论板数按EC计算应不低于2000。
(2)制备对照品溶液：称取EC对照品25mg，精密称定，置于50ml容量瓶中，加入流动相A，稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.400mg·ml-1的溶液，作为对照品溶液
(3)制备供试品溶液:称取供试品粉末30mg，置于50ml容量瓶中，加入流动相A30ml，超声提取20min，静置，再用流动相A稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
(4)含量测定：分别取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱图，然后利用色谱图计算EC的含量。
实施例2
设定高效液相色谱条件中：以浓度为0.2％的乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，洗脱方式为梯度洗脱，流速为1.2mL·min-1，柱温为40℃，检测波长为281nm，进样量15μl。其他步骤与实施例1相同。
实施例3
设定高效液相色谱条件中：以浓度为0.15％的乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，洗脱方式为梯度洗脱，流速为0.8mL·min-1，柱温为20℃，检测波长为275nm，进样量10μl。其他步骤与实施例1相同。
实施例4：对EC对照品溶液浓度X和峰面积积分值Y进行线性回归
精密量取对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mL，置于10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得到含EC分别为0.004、0.008、0.02、0.04、0.08mg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取上述各对照品溶液20μL，按实施例1色谱条件进行测定，分别得到峰面积积分值为135112、309673、734238、1478214、2966634，以峰面积积分值(Y)对对照品溶液浓度(X)进行线性回归，得回归方程为A＝37105X-3222.3(R＝0.9999)。
图2为EC对照品溶液的高效液相色谱图。
如图2所示：EC检测浓度在0.004-0.080mg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
实施例5：对高效液相色谱仪进行精密度检测
精密吸取浓度为0.400mg·mL-1的对照品溶液20μL，按实施例1色谱条件连续进样6次，测定峰面积积分值分别为：15067888、15014204、15056252、15009851、15001185、15063647。结果，RSD＝0.2％，表明仪器精密度良好。
实施例6：对供试品溶液的稳定性进行检测
精密量取同一供试品溶液20μL，分别在0、2、4、6、8、12、24h按实施例1色谱条件进样测定，测得峰面积积分值分别为：15023546、15020217、15018955、15000503、15021305、15022587、15021849，结果：RSD＝0.1％，表明供试品溶液在24h内稳定。
实施例7：检验EC的含量检测方法的重复性
称取同一EC样品粉末约30mg，平行6份，精密称定，按实施例1所述方法制备供试品溶液，精密吸取20μL，按按实施例1色谱条件测定。图3为EC样品的高效液相色谱图。如图3所示：上述平行六份样品，最终测得峰面积积分值分别为：14830292、14930292、14883765、14812486、14829659、14873144；结果，RSD＝0.3％，表明本发明所述方法重复性较好。
实施例8：加样回收率实验
取已知含量的EC样品9份，每份约10mg，精密称定，加入相应量的对照品，按实施例1方法制备供试品溶液，按按实施例1色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。
表1加样回收率试验结果(n＝9)
实施例9：EC定量限的测定
将对照品溶液稀释测定，测得信噪比为10∶1时，EC的最低检测浓度为0.13μg·mL-1。
实施例10：EC检测限的测定
将对照品溶液稀释测定，测得信噪比为3∶1时，EC的最低检测浓度为0.045μg·mL-1。
试验例1：样品含量测定
取2个不同批次的供试品粉末各约30mg，精密称定，按照实施例1的方法制成供试品溶液，分别取供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，按实施例1的色谱条件进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱图，然后，利用色谱图计算EC的含量。
图4为某一批次的EC样品的高效液相色谱图序号为1，批次20160201；图5为另一批次的EC样品的高效液相色谱图序号为1，批次20160202。
根据图4和图5的高效液相色谱图，得到各批次的EC样品含量测定结果如表2所示：
表2不同批次的EC样品含量测定结果
序号 批次 含量
1 20160201 70.2％
2 20160202 71.5％
上述EC含量测定方法实现了对EC的质量检测，经过试验表明，该方法线性关系、重现性、精密度、稳定性、回收率均较好，且本发明所述方法准确、简便、快捷，能够更有效、全面的控制EC的质量。

Claims (10)

1.一种茶多酚中EC含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)设定高效液相色谱条件：色谱柱为C18，以浓度为0.1％-0.2％的乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，洗脱方式为梯度洗脱，流速为0.8-1.2mL·min-1，柱温为20-40℃，检测波长为275-281nm，进样量10-20μl；所述流动相A和B在液相进行过程中的体积比为(69-92)：(8-31)；
(2)制备对照品溶液：称取EC对照品，加入流动相A制成溶液，作为对照品溶液；
(3)制备供试品溶液：称取茶多酚粉末，加入流动相A，超声提取，静置，摇匀，滤过，作为供试品溶液；
(4)含量测定：分别取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，进行高效液相色谱仪的操作，并记录色谱图，然后，利用色谱图计算EC的含量。
2.根据权利要求1所述的一种茶多酚中EC含量的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述流动相A中乙酸的浓度为0.1％。
3.根据权利要求1所述的一种茶多酚中EC含量的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述检测波长为278nm。
4.根据权利要求1所述的一种茶多酚中EC含量的检测方法，其特征在于，还包括对EC对照品溶液浓度X和峰面积积分值Y进行线性回归的步骤。
5.根据权利要求1所述的一种茶多酚中EC含量的检测方法，其特征在于，还包括对高效液相色谱仪进行精密度检测的步骤。
6.根据权利要求1所述的一种茶多酚中EC含量的检测方法，其特征在于，还包括对供试品溶液的稳定性进行检测的步骤。
7.根据权利要求1所述的一种茶多酚中EC含量的检测方法，其特征在于，还包括检验EC含量的检测方法的重复性的步骤。
8.根据权利要求1所述的一种茶多酚中EC含量的检测方法，其特征在于，还包括进行加样回收率实验的步骤。
9.根据权利要求1所述的一种茶多酚中EC含量的检测方法，其特征在于，还包括进行EC定量限测定的步骤。
10.根据权利要求1所述的一种茶多酚中EC含量的检测方法，其特征在于，还包括EC检测限测定的步骤。
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