CN104833756B - 一种附甘药物单酯型生物碱的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种附甘药物单酯型生物碱的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定，使用以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈﹕0.1%~0.2%的磷酸溶液=20~25﹕75~80为流动相，检测波长为222~242nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于5000，其目标成分分离度、峰形、拖尾因子均有了显著改善，且专属性、回收率、精密度、耐用性均好。
Description
技术领域
本发明涉及一种附甘药物附子生物碱的含量测定方法，属药品技术领域。
技术背景
中国发明专利（ZL201210536161.3）一种治疗过敏性鼻炎和支气管哮喘的药物,由附子6~18份，甘草9~1份为原料制成（命名为“附甘药物”），对于过敏性鼻炎和支气管哮喘有很好的疗效。
现代研究表明附子中的单酯型生物碱(苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱)是有效成分，现公开的测定单酯型生物碱的含量测定方法很多，但都不适合于本附甘药物的测定，无法在生产和使用中有效的保证产品的有效性和安全性。
《中国药典》2010年版一部中采用的高效液相色谱法测定附子药材中单酯型和双酯型生物碱，经过反复试验发现，该法测定“附甘药物”中单酯型生物碱含量，杂质分离效果不好，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱分离度不理想，阴性存在明显干扰。
现有技术乌头总生物碱含量测定方法还有：
酸碱中和法：利用生物碱的碱性，用酸直接滴定或加入定量酸液及指示剂，用氢氧化钠液回滴定，根据消耗碱液的体积计算出乌头类总生物碱的含量。此方法的优点是简单易行，不需要很昂贵的仪器设备，容易普及；缺点是操作方法比较麻烦，如果操作的平行性不好，会使误差较大。
酸性染料比色法：利用生物碱和酸性染料（如溴甲酚氯）反应生成的络合物在紫外光下有吸收，用乌头碱的标准液绘制标准曲线后，根据标准曲线法计算乌头类生物碱的含量。此方法的优点是灵敏度高、简便、准确快速。缺点是干扰因素多，水相pH值或指示剂配制、处理均影响呈色稳定性，颜色稳定时间较短，需用对照品绘制标准曲线，且专属性差。
导数分光光度法：利用设定不同的求导阶数以清除干扰组分的吸收，直接进行测定生物碱的含量。此法的优点是灵敏度很高、准确、简便。缺点是选择性差。
薄层扫描法：薄层扫描法准确度高，专属性强，重现性好。缺点是精密度低。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种附甘药物单酯型生物碱的含量测定方法，本发明杂质与附子生物碱分离效果好，阴性无干扰，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱分离度、回收率、重现性、精密度均良好。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明所述的一种附甘药物单酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：采用高效液相色谱法测定，使用以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱（简称：苯基柱）。
本发明所述的一种附甘药物附子生物碱的含量测定方法，其特征在于：色谱条件与系统适用性试验，使用苯基柱，以乙腈﹕0.1%~0.2%的磷酸溶液=20~25﹕75~80为流动相，检测波长为222~242nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备:取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含约0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，置同一100ml的量瓶中，用0.1%~0.2%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液；分别精密量取上述对照品贮备液各3~30ml、1~5ml、1~5ml，置同一200ml的量瓶中，加乙腈至40ml，用0.1%~0.2%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱3~30μg、苯甲酰乌头原碱1~5μg、苯甲酰次乌头原碱1~5μg的对照品溶液；
固相萃取柱系统适用性试验:精密量取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，混匀，室温减压回收至干，用0.1mol/L盐酸溶液适量溶解并定容至200ml，精密量取10ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，100~200mg，4~8ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml，1.25%的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加入流动相5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各10~20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，不得小于0.95；
供试品溶液的制备：取检品研细，称取0.2~0.6g，置具塞锥形瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，超声处理40分钟并时时振摇，后4000转/分钟离心30分钟，滤过，量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验，自“置于处理好的固相萃取柱”起，依法操作，制备供试品溶液；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl~25μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明所述的一种附甘药物附子生物碱的含量测定方法，其特征在于：理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于10000。
本发明所述的一种附甘药物附子生物碱的含量测定方法，其特征在于：制备供试品溶液时取样量是0.5g。
本发明所述的一种附甘药物附子生物碱的含量测定方法，其特征在于：供试品溶液的制备过程中，所用固相萃取柱填料为混合型阳离子交换反相吸附剂，规格为100~200mg，容积为4~8ml，并预先依次用乙腈、水各6ml洗脱处理。
本发明所述的一种附甘药物附子生物碱的含量测定方法，其特征在于：供试品溶液的制备过程中，固相萃取柱的洗脱过程依次为水3ml，1.25%的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液。
本发明提供了根据特定的处方制备的附甘药物中单酯型生物碱的含量测定方法；本发明与现有技术的区别在于采用了苯基柱，相比于以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其目标成分分离度、峰形、拖尾因子均有了显著改善，且专属性、回收率、重现性、精密度均好。
以下通过试验例和方法学研究进一步说明本发明的有益效果。试验例和方法学研究旨在进一步说明本发明的有益效果，而非本发明的限制。
一、制备样品
1、制备附甘颗粒剂
取附子15kg，甘草6kg，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮2小时，第二次加6倍量水，煎煮1小时，合并两次煎液，滤过，浓缩、减压干燥，粉碎，加入糊精适量，混匀，湿法制粒，干燥，整粒，得附甘药物的颗粒剂。
2、制备不含附子的阴性颗粒剂
取甘草300g，照制备附甘颗粒剂的方法制成不含附子的阴性颗粒剂。
二、药典法和本发明法单酯型生物碱含量测定适用性比较
《中国药典》2010年版一部第二增补本附桂骨痛颗粒项下附子单酯型生物碱含量测定法（以下简称“药典法”）与本发明附子单酯型生物碱含量测定法，用于附甘颗粒剂附子单酯型生物碱含量测定的适用性比较比较。
1、“药典法”测定附甘颗粒剂单酯型生物碱适用性试验
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱（以下简称：C18柱）；以乙腈-0.1%磷酸溶液(22:78)为流动相；检测波长为232nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算均不低于10000。
对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含约0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取各对照品贮备液15ml、2ml、3ml，置同一200ml的量瓶中，加乙腈至40ml，用0.1%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱15μg、苯甲酰乌头原碱2μg、苯甲酰次乌头原碱3μg的对照品溶液。
供试品溶液的制备：取附甘颗粒研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率400W，频率40kHz)40分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，离心(转速为每分钟5000转)30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，加在固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，容量为6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml、氨溶液(5→100)、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，继用乙腈-浓氨试液(90:10)的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入乙腈-0.1%磷酸溶液(20:80)的混合溶液5ml使溶解，滤过，取续滤液，即得。
测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。测定了3个不同厂家的C18柱，供试品溶液拖尾因子结果见表1。
表1不同厂牌C18柱拖尾因子测定结果
结果显示，“药典法”测定本品单脂型生物碱含量时，3个不同厂牌的C18柱，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱色谱峰均拖尾严重，峰型差，影响峰面积的准确测量，因此，C18柱不适用于附甘药物单酯型生物碱的含量测定。
2、本发明方法测定附甘颗粒剂单酯型生物碱适用性试验
按照上述“药典法”所述实验方法，液相条件、对照品溶液制备方法、供试品溶液制备方法、测定法均不变，只是将色谱柱改为以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱（以下简称：苯基柱），对附甘颗粒单酯型生物碱进行含量测定。测定了3个不同厂家的苯基柱，供试品溶液拖尾因子结果见表2：
表2不同厂牌苯基柱拖尾因子测定结果
结果表明，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱色谱峰拖尾因子均在0.95~1.05，色谱峰峰形好，系统适用性良好，表明本发明方法适用于附甘颗粒剂单酯型生物碱含量测定。
三、药典法和本发明法单脂型生物碱含量测定专属性试验比较
1、“药典法”测定附甘颗粒剂单酯型生物碱专属性试验
取附甘颗粒剂和不含附子的阴性颗粒剂，按照“药典法”所述液相条件及供试品溶液制备方法进行试验。结果，供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应位置处有色谱峰，但峰形较差，拖尾严重，苯甲酰新乌头原碱色谱峰分离度小于1.5；阴性样品溶液在与苯甲酰新乌头原碱对照品色谱相应位置处有色谱峰检出，表明“药典法”测定附甘颗粒中单酯型生物碱专属性差。详细结果见表3。
表3“药典法”专属性结果
注：分离度是用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度的指标，指表中“--”表示此目标峰前没有色谱峰检出，因此积分表中不显示分离度这一指标。
2、本发明方法测定附甘颗粒剂单酯型生物碱专属性试验
另取附甘颗粒剂和不含附子的阴性颗粒剂，按照按本发明方法所述液相条件及供试品溶液制备方法进行试验。结果，供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应位置处有色谱峰，且峰形良好，分离度良好，阴性样品溶液在与对照品溶液相应位置处无色谱峰检出，表明本发明方法测定附甘颗粒中单酯型生物碱专属性良好。详细结果见表4。
表4本发明方法专属性结果
四、本发明单酯型生物碱含量测定方法学研究
1、本发明单酯型生物碱含量测定方法详细描述如下：
色谱条件与系统适用性试验：以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈-0.1%的磷酸溶液=23﹕77为流动相；检测波长为232nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算不低于5000。
对照品溶液的制备取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含约0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，置同一100ml的量瓶中，用0.1%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液。分别精密量取各对照品贮备液15ml、2ml、3ml，置同一200ml的量瓶中，加乙腈至40ml，用0.1%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱15μg、苯甲酰乌头原碱2μg、苯甲酰次乌头原碱3μg的对照品溶液。
固相萃取柱系统适用性试验：精密量取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，混匀，室温减压回收至干，用0.1mol/L盐酸溶液适量溶解并定容至200ml，精密量取10ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml，1.25%的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加入流动相5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液。
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，均不小于0.95。
供试品溶液的制备取附甘颗粒，研细，称取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理40分钟并时时振摇，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸溶液补足减失的重量，摇匀，以每分钟4000转离心30分钟，滤过，精密量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验项下的方法，自“置于处理好的固相萃取柱”起，依法操作，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2、固相萃取柱系统适用性试验
取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品，照上述方法进行固相萃取柱系统适用性试验。
结果：固相萃取柱系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积比值均大于0.95，详细结果见表5。
表5固相萃取柱系统适用性结果
| 苯甲酰新乌头原碱 | 苯甲酰乌头原碱 | 苯甲酰次乌头原碱 | |
| 对照品溶液 | 546918 | 264040 | 307307 |
| 供试品溶液 | 541539 | 264615 | 304233 |
| 比值 | 0.99 | 1.00 | 0.99 |
3、准确度实验
对照品贮备液的制备：取苯甲酰新乌头原碱对照品适量，精密称定，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml约含3.7μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取研细的附甘颗粒约0.25g，精密称定6份，分别精密加入上述对照品贮备液25ml，照本发明方法所述供试品溶液的制备方法，自“密塞，称定重量”起，依法操作，得供试品溶液。
液相条件及测定法同本发明方法所述，测定，计算回收率，结果见表6。
表6准确度试验结果
结果，准确度良好。
4、精密度
4.1重复性
取研细的附甘颗粒约0.5g，精密称定6份，按照本发明所述方法测定，结果见表7。
表7重复性试验结果
| 试验号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(%) |
| 结果(mg/g) | 0.4424 | 0.4426 | 0.4395 | 0.4415 | 0.4410 | 0.4392 | 0.32 |
结果表明，重复性良好。
4.2不同仪器
分别在不同仪器上对同一供试品进行测定，考察仪器变动对精密度的影响，结果见表8。
表8不同仪器试验结果
结果，不同仪器之间精密度良好。
4.3不同试验人员
由不同人员对同一供试品进行测定，考察人员变动对精密度的影响，结果见表9。
表9不同人员试验结果
结果，不同人员之间精密度良好。
4.4不同日期
由同一分析人员分别在不同日期对同一供试品进行测定，考察日期变动对精密度的影响，结果见表10。
表10不同时间试验结果
结果，不同日期之间精密度良好。
5、耐用性
5.1溶液稳定性
取供试品溶液室温放置，分别于第0、3、6、9、12小时吸取20μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱峰面积，结果见表11。
表11溶液稳定性试验
| 放置时间(小时) | 0 | 3 | 6 | 9 | 12 | RSD |
| 苯甲酰新乌头原碱 | 376669 | 375633 | 375647 | 374682 | 375416 | 0.19% |
| 苯甲酰乌头原碱 | 36058 | 36014 | 35985 | 36207 | 36009 | 0.25% |
| 苯甲酰次乌头原碱 | 71361 | 71082 | 70975 | 70650 | 69394 | 1.1% |
结果，供试品溶液在12小时内稳定。
5.2检测波长
取本品供试品溶液，分别在227nm、232nm、237nm波长下进行测定，结果见表12。
表12不同波长试验结果
结果，波长耐用性良好。
5.3流速
取本品供试品溶液，分别采用0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min流速进行测定，结果见表13。
表13不同流速试验结果
结果，流速耐用性良好。
5.4流动相比例
取本品供试品溶液，采用不同流动相比例进行测定，结果见表14。
表14不同流动相比例试验结果
结果，流动相比例耐用性良好。
5.5柱温
取本品供试品溶液，分别采用25℃、30℃、35℃柱温进行测定，结果见表15。
表15不同柱温试验结果
结果，柱温耐用性良好。
5.6色谱柱厂牌
取本品供试品溶液，采用不同厂牌的色谱柱进行测定，结果见表16。
表16不同色谱柱试验结果
结果，色谱柱耐用性良好。
6、线性
6.1苯甲酰新乌头原碱
取苯甲酰新乌头原碱对照品适量，精密称定，用乙腈-0.1%磷酸溶液(20﹕80)分别制备每1ml含苯甲酰新乌头原碱3.3、9.8、16.3、22.9和32.7μg的溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积。以苯甲酰新乌头原碱对照品溶液浓度为横坐标，以相对应峰面积为纵坐标，进行线性回归，得线性回归方程：y=29732x－11339，r=0.9997。
结果，苯甲酰新乌头原碱在3.3~33.0μg/ml之间与峰面积呈良好的线性关系。
6.2苯甲酰乌头原碱
取苯甲酰乌头原碱对照品适量，精密称定，用乙腈-0.1%磷酸溶液(20﹕80)分别制备每1ml含苯甲酰乌头原碱0.8、1.6、2.4、5.6和8.0μg的溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积。以苯甲酰乌头原碱对照品溶液浓度为横坐标，以相对应峰面积为纵坐标，进行线性回归，得线性回归方程：y=245551x－2211.9，r=0.9999。
结果，苯甲酰乌头原碱在0.8~8.0μg/ml之间与峰面积呈良好的线性关系。
6.3苯甲酰次乌头原碱
取苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，用乙腈-0.1%磷酸溶液(20﹕80)分别制备每1ml含苯甲次乌头原碱0.8、1.6、2.4、4.0、5.6和8.0μg的溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积。以苯甲酰次乌头原碱对照品溶液浓度为横坐标，以相对应峰面积为纵坐标，进行线性回归，得线性回归方程：y=23916x－3973.3，r=0.9995。
结果，苯甲酰次乌头原碱在0.8～8.0μg/ml之间与峰面积呈良好的线性关系。
7、范围
分别按0.5g的80%、100%、120%称取本品内容物，制备供试品溶液，测定单酯型生物碱含量，结果见表17。
表17范围试验结果
结果，在0.5g±20%的取样范围内未发现测定结果有明显差异。
下面通过具体实施例近一步说明本发明，具体实施例使用的“苯基柱”为非同一型号或同一型号不同使用时间，具体体现在理论板数不同，但每一图谱的理论板数、拖尾因子及分离度等均符合规定。
具体实施方式
实施例1：附甘颗粒剂单酯型生物碱含量测定
1）制备颗粒剂：取附子6kg，甘草1kg，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮2小时，第二次加6倍量水，煎煮1小时，合并两次煎液，滤过，浓缩、减压干燥，粉碎，加入糊精适量，混匀，湿法制粒，干燥，整粒，得附甘药物的颗粒剂。
2）含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱（WelchUlimatePhenyl-Ether，新柱）；以乙腈-0.1%的磷酸溶液=20﹕80为流动相；检测波长为222nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为13427。
对照品溶液的制备取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，置同一100ml的量瓶中，用0.1%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液；分别精密量取上述对照品贮备液各5ml、1ml、1ml，置同一200ml的量瓶中，加乙腈至40ml，用0.1%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱5μg、苯甲酰乌头原碱1μg、苯甲酰次乌头原碱1μg的对照品溶液。
固相萃取柱系统适用性试验精密量取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，混匀，室温减压回收至干，用0.1mol/L盐酸溶液适量溶解并定容至200ml，精密量取10ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，100mg，4ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml，1.25%的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加入流动相5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，不得小于0.95。，
供试品溶液的制备：取附甘颗粒研细，称取0.2g，置具塞锥形瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，超声处理40分钟并时时振摇，后4000转/分钟离心30分钟，滤过，量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验，自“置于处理好的固相萃取柱”起，依法操作，制备供试品溶液。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：
Ⅰ：固相萃取柱系统适用性溶液与对照品峰面积及相应比值见表18
表18固相萃取柱系统适用性结果
| 苯甲酰新乌头原碱 | 苯甲酰乌头原碱 | 苯甲酰次乌头原碱 | |
| 对照品溶液 | 251061 | 132029 | 150097 |
| 供试品溶液 | 246577 | 130708 | 145594 |
| 比值 | 0.98 | 0.99 | 0.97 |
Ⅱ：附甘颗粒含量测定结果
3个单酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批附甘颗粒剂单酯型生物碱含量为765μg/袋，详细结果见表19。
表19附甘颗粒单酯型生物碱含量结果
实施例2：附甘颗粒剂单酯型生物碱含量测定
1）制备颗粒剂：取附子18kg，甘草9kg，加水煎煮两次，第一次加10倍量水，煎煮1.5小时，第二次加8倍量水，煎煮1小时，合并两次煎液，滤过，浓缩、减压干燥，粉碎，加入糊精适量，混匀，湿法制粒，干燥，整粒，得附甘药物的颗粒剂。
2）含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱（WelchUlimatePhenyl-Ether，使用2个月）；以乙腈-0.14%的磷酸溶液=23﹕77为流动相；检测波长为232nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为10141。
对照品溶液的制备取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含约0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，置同一100ml的量瓶中，用0.14%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液；分别精密量取上述对照品贮备液各15ml、2ml、2ml，置同一200ml的量瓶中，加乙腈至40ml，用0.14%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱15μg、苯甲酰乌头原碱2μg、苯甲酰次乌头原碱2μg的对照品溶液；
固相萃取柱系统适用性试验精密量取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，混匀，室温减压回收至干，用0.1mol/L盐酸溶液适量溶解并定容至200ml，精密量取10ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，200mg，8ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml，1.25%的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加入流动相5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，均大于0.95。
供试品溶液的制备：取附甘颗粒研细，称取0.6g，置具塞锥形瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，超声处理40分钟并时时振摇，后4000转/分钟离心30分钟，滤过，量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验，自“置于处理好的固相萃取柱”起，依法操作，制备供试品溶液。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：3个单酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批附甘颗粒剂单酯型生物碱含量为803μg/袋。
实施例3：附甘颗粒剂单酯型生物碱含量测定
1）制备颗粒剂：取附子10kg，甘草5kg，加水煎煮三次，第一次加8倍量水，煎煮1.5小时，第二次加8倍量水，煎煮1小时，第三次加6倍量水，煎煮1小时，合并三次煎液，滤过，浓缩、减压干燥，粉碎，加入糊精适量，混匀，湿法制粒，干燥，整粒，得附甘药物的颗粒剂。
2）含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱（VenusilXBPPolar-Phenyl，新柱）；以乙腈-0.2%的磷酸溶液=25﹕75为流动相；检测波长为242nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为14065。
对照品溶液的制备取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含约0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，置同一100ml的量瓶中，用0.2%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液；分别精密量取上述对照品贮备液各30ml、5ml、5ml，置同一200ml的量瓶中，加乙腈至40ml，用0.2%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱30μg、苯甲酰乌头原碱5μg、苯甲酰次乌头原碱5μg的对照品溶液。
固相萃取柱系统适用性试验精密量取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，混匀，室温减压回收至干，用0.1mol/L盐酸溶液适量溶解并定容至200ml，精密量取10ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml，1.25%的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加入流动相5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，均大于0.95。
供试品溶液的制备：取附甘颗粒剂研细，称取0.4g，置具塞锥形瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，超声处理40分钟并时时振摇，后4000转/分钟离心30分钟，滤过，量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验，自“置于处理好的固相萃取柱”起，依法操作，制备供试品溶液；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：3个单酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批附甘颗粒剂单酯型生物碱含量为835μg/袋。
实施例4：附甘片剂单酯型生物碱含量测定
1）制备片剂：取附子10kg，甘草4kg，加水煎煮3次。第一次加入原药材质量的10倍量的水，煎煮2h，第二、三次分别各加8倍量的水，分别煎煮1.5h，合并3次煎煮液，过滤，取滤液减压浓缩至相对密度为1.12（60℃），加入乙醇，便加便搅拌混匀，使含醇量达70%，静置24h,滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.25（60℃）,60℃以下减压干燥，粉碎，加入淀粉适量，制粒，加入滑石粉适量，混匀，压片，得附甘药物的片剂。
2）含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱（VenusilXBPPolar-Phenyl，使用6个月）；以乙腈-0.15%的磷酸溶液=23﹕77为流动相；检测波长为232nm；理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为5906。
对照品溶液的制备取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含约0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，置同一100ml的量瓶中，用0.15%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液；分别精密量取上述对照品贮备液各15ml、2ml、4ml，置同一200ml的量瓶中，加乙腈至40ml，用0.15%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱15μg、苯甲酰乌头原碱2μg、苯甲酰次乌头原碱4μg的对照品溶液。
固相萃取柱系统适用性试验精密量取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，混匀，室温减压回收至干，用0.1mol/L盐酸溶液适量溶解并定容至200ml，精密量取10ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，150mg，6ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml，1.25%的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加入流动相5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，均大于0.95。
供试品溶液的制备：取附甘片研细，称取约0.4g，置具塞锥形瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，超声处理40分钟并时时振摇，后4000转/分钟离心30分钟，滤过，量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验，自“置于处理好的固相萃取柱”起，依法操作，制备供试品溶液。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：3个单酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批附甘片剂单酯型生物碱含量为267μg/片。
实施例5：附甘胶囊剂单酯型生物碱含量测定
1）制备胶囊剂：取附子18kg，甘草6kg，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮2小时，第二次加6倍量水，煎煮1小时，合并两次煎液，过滤，取滤液减压浓缩至相对密度为1.15（60℃），加入乙醇，便加便搅拌混匀，使含醇量达80%，静置12h，滤过，滤液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为1.2（60℃）,60℃以下减压干燥，粉碎，加入微粉硅胶适量，制粒，减压干燥，装入胶囊，得附甘药物的胶囊剂。
2）含量测定：
色谱条件与系统适用性试验以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱（WelchUlimateXB-Phenyl，使用1个月）；以乙腈-0.12%的磷酸溶液=22﹕78为流动相；检测波长为230nm；理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为12004。
对照品溶液的制备取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含约0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，置同一100ml的量瓶中，用0.12%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液；分别精密量取上述对照品贮备液各20ml、3ml、5ml，置同一200ml的量瓶中，加乙腈至40ml，用0.12%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱20μg、苯甲酰乌头原碱3μg、苯甲酰次乌头原碱5μg的对照品溶液。
固相萃取柱系统适用性试验精密量取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，混匀，室温减压回收至干，用0.1mol/L盐酸溶液适量溶解并定容至200ml，精密量取10ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，100mg，4ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml，1.25%的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加入流动相5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，均大于0.95。
供试品溶液的制备：取本品内容物，称取约0.3g，置具塞锥形瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，超声处理40分钟并时时振摇，后4000转/分钟离心30分钟，滤过，量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验，自“置于处理好的固相萃取柱”起，依法操作，制备供试品溶液。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：3个单酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批附甘胶囊剂单酯型生物碱含量为273μg/粒。
实施例6：附甘口服液单酯型生物碱含量测定
1）制备口服液剂：取附子3kg，甘草1.2kg，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮2小时，第二次加6倍量水，煎煮1小时，合并两次煎液，过滤，取滤液减压浓缩至相对密度为1.12（60℃），加入乙醇，便加便搅拌混匀，使含醇量达75%，静置24h，滤过，滤液回收乙醇，浓缩，加入蔗糖及抑菌剂适量，煮沸、定容，滤过，灌装，得附甘药物的口服液剂。
2）含量测定：
色谱条件与系统适用性试验以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱（WelchUlimateXB-Phenyl，使用4个月）；以乙腈-0.16%的磷酸溶液=24﹕76为流动相；检测波长为237nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算为7480。
对照品溶液的制备取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含约0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，置同一100ml的量瓶中，用0.16%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液；分别精密量取上述对照品贮备液各17ml、4ml、3ml，置同一200ml的量瓶中，加乙腈至40ml，用0.16%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱17μg、苯甲酰乌头原碱4μg、苯甲酰次乌头原碱3μg的对照品溶液。
固相萃取柱系统适用性试验精密量取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，混匀，室温减压回收至干，用0.1mol/L盐酸溶液适量溶解并定容至200ml，精密量取10ml，置于处理好的固相萃取柱(以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，200mg，8ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱)上，依次以水3ml，1.25%的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加入流动相5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；
分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，均大于0.95。
供试品溶液的制备：量取附甘口服液3ml，置具塞锥形瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，超声处理40分钟并时时振摇，4000转/分钟离心30分钟，滤过，量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验，自“置于处理好的固相萃取柱”起，依法操作，制备供试品溶液。
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。
结果：3个单酯型生物碱理论塔板数、分离度、拖尾因子均达到要求，该批附甘糖浆剂单酯型生物碱含量为216μg/ml。
Claims (4)
1.一种附甘药物单酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：用高效液相色谱法测定附子含量，其色谱柱以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂，以乙腈﹕0.1%~0.2%的磷酸溶液=20~25﹕75~80为流动相，供试品溶液制备过程中使用以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂的固相萃取柱，规格为100-200mg、4-8ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱，加上供试品溶液后依次以水3ml，1.25%的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，测定以苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱计附子的含量。
2.根据权利要求1的一种附甘药物单酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：系统适用性试验，以乙腈﹕0.1%~0.2%的磷酸溶液=20~25﹕75~80为流动相，检测波长为222-242nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含约0.2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密量取上述对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，置同一100ml的量瓶中，用0.1%-0.2%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液；分别精密量取上述对照品贮备液各3-30ml、1-5ml、1-5ml，置同一200ml的量瓶中，加乙腈至40ml，用0.1%-0.2%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱3-30μg、苯甲酰乌头原碱1-5μg、苯甲酰次乌头原碱1-5μg的对照品溶液；固相萃取柱系统适用性试验：精密量取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的对照品贮备液各10ml、5ml和5ml，混匀，室温减压回收至干，用0.1mol/L盐酸溶液适量溶解并定容至200ml，精密量取10ml，置于处理好的固相萃取柱上，此固相萃取柱以混合型阳离子交换反相吸附剂为填充剂，规格为100-200mg、4-8ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱；依次以水3ml，1.25%的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈﹕浓氨试液=90﹕10的混合溶液10ml洗脱，收集洗脱液，于40℃以下减压回收溶剂至干，残渣加入流动相5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液；分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各10-20μl，注入液相色谱仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，不得小于0.95；供试品溶液的制备：取检品研细，称取0.2－0.6g，置具塞锥形瓶中，加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，超声处理40分钟并时时振摇，后4000转/分钟离心30分钟，滤过，量取续滤液10ml，照固相萃取柱系统适用性试验，自“置于处理好的固相萃取柱”起，依法操作，制备供试品溶液；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μl-25μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.根据权利要求2的一种附甘药物单酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于10000。
4.根据权利要求2的一种附甘药物单酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：制备供试品溶液时取样量是0.5g。
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|---|---|---|---|---|
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