CN101732431A

CN101732431A - 液相色谱分离制备中药附子中主要酯型生物碱的方法

Info

Publication number: CN101732431A
Application number: CN200910247705A
Authority: CN
Inventors: 杨春艳; 乔德水; 高雪芹
Original assignee: Jiangsu Wanbang Biological Pharmaceutical Co Ltd; Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Wanbang Biological Pharmaceutical Co Ltd; Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2009-12-30
Publication date: 2010-06-16

Abstract

本发明涉及一种液相色谱分离制备中药附子中主要酯型生物碱的方法，本发明在分析色谱基础上采用线性放大并优化，建立制备色谱，对中药附子中主要酯型生物碱进行分离制备，从中药附子中分离制备6个单酯型二萜类生物碱和3个双酯型二萜类生物碱，其中6个单酯型生物碱是首次分离得到，纯度均达99.3％以上，所述的分析色谱及制备色谱的色谱柱中的固定相均为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相均为有机相-醋酸盐缓冲体系，所述的有机相占流动相比例为20～70％，有机相为甲醇或乙腈，所述的醋酸盐缓冲体系为醋酸铵-醋酸缓冲体系，检测波长为230～240nm，用流动相溶解并稀释中药附子总生物碱粗提物作为分析色谱和制备色谱的供试品。

Description

液相色谱分离制备中药附子中主要酯型生物碱的方法

技术领域

本发明涉及一种中药附子主要酯型生物碱的分离制备方法，特别涉及一种液相色谱分离制备中药附子中主要酯型生物碱的方法。

背景技术

生物碱为中药附子的主要有效成分，在附子药材及其提取物中，生物碱主要为双酯型、单酯型乌头碱类生物碱，其中主要的九种乌头碱类生物碱的具体结构如下：

附子中主要生物碱的分离制备，最早在陈嬿等的研究中(中国乌头的研究IX：川乌附子中的生物碱[J]，药学学报，1965，12：435)就有以柱层析方法分离生物碱的。之后的文献报道(Konno C，et al.Struture of senbusine A，B and C，Diterpinic alkaloids ofAconitum carmichaeli roots from China[J]，Nat Prod，1982，45：128；王洁之，韩公羽，四川江油附子脂溶性生物碱的研究[J]，药学学报，1985，20(1)：71～73；张卫东，韩公羽，梁华清，四川江油附子生物碱成分的研究[J]，药学学报，1992，27(9)：670～673)也分离得到各生物碱，并且得到了一些新的生物碱化合物，但是都是脂型、双酯型或醇胺型的生物碱。

现有技术一般运用柱层析技术对附子相关生物碱进行分离纯化，柱层析原理也是源于色谱技术，但是其存在操作复杂，效率低，且有机溶剂耗用量大等缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种液相色谱分离制备中药附子中主要酯型生物碱的方法，采用高效液相制备色谱技术，从中药附子中分离得到6个单酯型二萜类生物碱和3个双酯型二萜类生物碱。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是：一种液相色谱分离制备中药附子中主要酯型生物碱的方法，用于从中药附子中分离制备主要酯型生物碱，在分析色谱基础上采用线性放大并优化，建立制备色谱，对中药附子中主要酯型生物碱进行分离制备：

所述的分析色谱及制备色谱，其色谱柱中的固定相均为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相均为有机相-醋酸盐缓冲体系，所述的有机相占流动相比例为20～70％，有机相为甲醇或乙腈，所述的醋酸盐缓冲体系为醋酸铵-醋酸缓冲体系，检测波长为230～240nm，用流动相溶解并稀释中药附子总生物碱粗提物作为分析色谱和制备色谱的供试品，其中，

分析色谱中，供试品以流动相溶解、稀释成质量浓度为0.6～1.2g·mL^-1，进样体积为10～30μL，流动相流速为0.4～1.0mL·min^-1；

制备色谱中，进样浓度为0.8～1.0g·mL^-1，至少进样量为分析色谱进样量乘以相应线性放大系数，其中，线性放大系数按下式计算：

Sf＝π(Dp)²/π(Da)²＝(Dp/Da)²

式中：Sf为线性放大系数；Dp为制备色谱柱内径；Da为分析色谱柱内径；

供试品经制备色谱分别收集得到的各主要酯型生物碱流分，先以15～30℃温度旋转蒸发浓缩，后以冷冻干燥机冷冻干燥制得的物质，经结构确证分别为：苯甲酰新乌头原碱(Benzoylmesaconine)，苯甲酰乌头原碱(Benzoylaconine)，苯甲酰次乌头原碱(Benzoylhypaconine)，去乙酸新乌头碱(Deacetoxymesaconitine)，去乙酸乌头碱(Deacetoxyaconitine)，去乙酸次乌头碱(Deacetoxyhypaconitine)，新乌头碱(mesaconine)、次乌头碱(hypaconine)、乌头碱(aconine)。

本发明中，线性放大技术基本假设为分析色谱系统和制备色谱系统化学性质和传质过程保持不变，分析色谱系统的进样量、流量等乘以线性放大系数即为制备色谱系统的相应参数。

制备色谱中，由于所分离的附子生物碱难溶于水及有机溶剂含量较低的流动相，因此制备液相色谱的进样浓度较分析色谱优化为0.8～1.0g·mL^-1，然而，制备色谱的流量受设备自身条例制约，因此，本发明中至少制备色谱的进样量为分析色谱进样量乘以相应线性放大系数，流速限定在色谱仪流速范围内。

本发明在分析色谱基础上采用线性放大并优化，建立制备色谱，对中药附子中主要酯型生物碱进行分离、制备，可建立中药附子中生物碱指纹图谱。

在上述方案中，有机相占流动相具体比例可以为20，30，40，50，60或70％；

分析色谱中，供试品的进样浓度为0.6，0.8，1.0或1.2g·mL^-1，进样体积可以为10，12，15，18，20，22，25，28或30μL，流动相流速为0.4，0.6，0.8或1.0mL·min^-1；

制备色谱中，进样浓度为0.8，0.9或1.0g·mL^-1。

本发明的制备色谱方法采用反相高效液相色谱法，固定相为分析色谱同一填料的十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为分析色谱同一流动相体系，检测波长为分析色谱同一波长，进样量为分析色谱进样量乘以相应线性放大系数，流量为分析色谱流速乘以相应线性放大系数。

在上述方案的基础上，所述的有机相占流动相体积百分比为30～60％。

有机相占流动相体积百分比进一步优选为36～52％。

所述的线性放大技术中分析色谱条件优化步骤为：

中药附子粗提物样品适量以流动相溶解，稀释成质量浓度(每mL含生药材克数)0.8g·mL^-1，1.0g·mL^-1，1.2g·mL^-1，过0.22μm滤膜注入液相色谱中，按L9(3⁴)设计正交表进行试验。由于进样量增大，会造成峰重叠、峰前延或拖尾，故选择较稳定的一个有效成分色谱峰作为研究对象。由于分离度R和分离因子α、容量因子k′、理论塔板数N有关，而本发明设计的实验中发现容量因子k′均大于5，k′、分离因子α对分离度R的影响较小，故可以从理论塔板数N的变化来表征分离度R的变化。故正交试验以这个有效成分色谱峰的理论塔板数为考察指标，结果见

表2 分析柱色谱条件优化试验方差表

表3分析柱色谱条件优化试验因素-水平表、表2表1分析柱色谱条件优化试验正交试验设计及结果和表2分析柱色谱条件优化试验方差表。

如表中所示，由于分离度R越大说明色谱峰分离越好即该色谱条件越好，由表2，表3可看出，影响因素排序为B＞C＞A，故进样体积影响分离度最大，其次是流动相流速，最后是进样浓度，因此，分析色谱中，最优的分离条件为：进样体积20μL，进样浓度为1.2g·mL^-1，流动相流速为0.6mL·min^-1。

其中：

表1 分析柱色谱条件优化试验因素-水平表

表2 分析柱色谱条件优化试验方差表

表3 分析柱色谱条件优化试验正交试验设计及结果

在上述方案的基础上，制备色谱中，进样体积为20～100mL，具体为20，40，50，60，80或100mL，进样体积优选50～100mL。

在上述方案的基础上，所述的醋酸铵-醋酸缓冲体系中，醋酸铵的摩尔浓度为10～40mmol/L，以醋酸调节有机相-醋酸盐缓冲体系的pH值为5.0～7.0。

具体的，醋酸铵的摩尔浓度可以为10，15，20，25，30，35或40mmol/L，以醋酸调节有机相-醋酸盐缓冲体系的pH值为5.0，5.2，5.5，5.8，6，6.0，6.2，6.5，6.8或7.0。

在上述方案的基础上，所述中药附子总提取物的制备方法为：将附子(黑顺片)粉碎成粗粉，取粗粉置于锥形瓶中(200g平均分为10份，每份20g)，粗粉以浓氨水(4mL)润湿，静置20～40min，加200mL无水乙醚，超声处理8～15min，于2～5℃低温冷藏至少24h，过滤，用无水乙醚少量多次洗涤残渣，合并滤液及洗涤液，旋转蒸发至干，以稀盐酸溶液溶解转移出，以氨试液调pH值为4.8～5.2，用D101树脂柱吸附，按顺序以1倍树脂柱体积的水、2倍树脂柱体积的40％乙醇、8倍树脂柱体积的70％乙醇、3倍树脂柱体积的95％乙醇，进行梯度洗脱，收集70％乙醇洗脱液于旋转蒸发仪蒸至近干，转移至培养皿，30～40℃真空干燥至恒重，作为附子总生物碱粗提物供分析液相分析及制备液相制备用。

在上述方案的基础上，所述的浓缩过程为：将各生物碱流分以15～30℃温度旋转蒸发浓缩，所述的冷冻过程为：用冷冻干燥机在-40～-30℃预冻4～6小时，抽真空，压力不大于25Pa，再在-20～-15℃保持4～6小时，最后升温干燥至20～25℃保持4～6小时。

本发明的有益效果是：

通过本发明的方法可分离制备6个单酯型二萜类生物碱和3个双酯型二萜类生物碱，其中6个单酯型生物碱是首次分离得到，纯度均达99.3％以上，本发明应用线性放大技术，在高效液相分析色谱上摸索出好的中药附子主要生物碱分离条件，经过适当优化可以顺利放大到制备色谱，节省时间和成本，快速、高效，易于中药现代化、工业化和产业化。

附图说明

图1为本发明高效液相分析色谱分离附子生物碱色谱图谱。

图2为本发明高效液相制备色谱分离制备附子生物碱色谱图谱。

具体实施方式

以下将进一步结合实例来详细描述具体实施方案，以下的实施例并非限定本发明方案。

一种液相色谱分离制备中药附子中主要酯型生物碱的方法，从中药附子中分离制备主要酯型生物碱，在分析色谱基础上采用线性放大并优化，建立制备色谱，对中药附子中主要酯型生物碱进行分离制备，其中：

在分析色谱色谱柱中的固定相均为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相均为有机相-醋酸盐缓冲体系，所述的有机相占流动相比例为20～70％，有机相为甲醇或乙腈，所述的醋酸盐缓冲体系为醋酸铵-醋酸缓冲体系，检测波长为230～240nm，用流动相溶解并稀释中药附子总生物碱粗提物作为分析色谱和制备色谱的供试品；

本发明的制备色谱方法，采用反相高效液相色谱法，固定相为分析色谱同一填料的十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为分析色谱同一流动相体系，检测波长为分析色谱同一波长，进样量为分析色谱进样量乘以相应线性放大系数，制备色谱中，至少进样量大致符合分析色谱进样量乘以相应线性放大系数的规律；

供试品进行备色谱分别收集得到的各主要酯型生物碱流分，先以15～30℃温度旋转蒸发浓缩，后以冷冻干燥机冷冻干燥制得。

附子总生物碱粗提物的处理方法：

附子黑顺片粉碎成粗粉，取200g粗粉平均分置于十个250mL具塞锥形瓶中，每20g附子粗粉以4mL浓氨水润湿，静置30min，加200mL无水乙醚，超声10min，于4℃低温冷藏24h，过滤，无水乙醚少量多次洗涤残渣，合并滤液及洗涤液，35℃旋转蒸发至干，以1.00％稀盐酸溶液溶解转移出，以氨试液调pH至5.0，上D101树脂柱，按顺序以1BV(柱体积)水、2BV 40％乙醇、8BV 70％乙醇、3BV 95％乙醇梯度洗脱，收集70％乙醇洗脱液于旋转蒸发仪蒸至近干，转移至培养皿，35℃低温真空干燥至恒重，即得附子总生物碱粗提物，为粉末状；分析色谱样品处理：

称取附子总生物碱提取物粉末适量，以分析色谱流动相溶解并稀释成浓度为0.6～1.2g·mL^-1，进样体积10～30μL；

制备色谱样品处理：

称取附子总生物碱提取物粉末适量，以分析色谱流动相溶解并稀释成浓度为0.8～1.0g·mL^-1，进样体积为50～100mL。

分析色谱仪器：

Waters高效液相色谱仪包括Waters 1525双色谱泵，Waters2487DualλAbsorbance紫外检测器，Waters 717plus自动进样器，Waters in-line脱气机，Waters Breeze色谱工作站。

制备色谱仪器：

Waters Delta Prep 4000高效液相制备色谱仪，Waters Prep LC控制器，Waters 2487DualλAbsorbance紫外检测器，HS色谱工作站。

实施例1

采用本发明方法，分析色谱柱采用Phenomenex C18(250mm×4.6mm，10μm)，制备色谱柱采用Phenomenex C18(250mm×25mm，10μm)，流动相均为甲醇-醋酸铵缓冲液，缓冲液为20mmol/L醋酸铵-醋酸缓冲液，以醋酸调节pH值为5.3，甲醇与缓冲液的体积比为48∶52(有机相占流动相比例为48％)，检测波长234nm，分析色谱进样样品浓度为1.0g·mL^-1，进样体积20μL，流速为1mL·min^-1；制备色谱进样样品浓度为0.8g·mL^-1，进样体积80mL，流速为20mL·min^-1，所得产物的纯度、产率见表4。

制备色谱仪器的最大限定流速为20mL·min^-1。

实施例2

采用本发明方法，分析色谱柱采用Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)，制备色谱柱采用Kromasil C18(250mm×25mm，5μm)，流动相均为甲醇-醋酸铵缓冲液，缓冲液为30mmol/L醋酸铵-醋酸缓冲液，以醋酸调节pH值为5.5，甲醇与缓冲液的体积比为40∶60(有机相占流动相比例为40％)，检测波长235nm，分析色谱进样样品浓度为0.6g·mL^-1，进样体积20μL，流速为1mL·min^-1制备色谱进样样品浓度为0.8g·mL^-1，进样体积70mL，流速为20mL·min^-1所得产物的纯度、产率见表4。

实施例3

采用本发明方法，分析色谱柱采用Grace Alpha(4.6mm×250mm，10μm)，制备色谱柱采用Grace Alpha(4.6mm ×250mm，10μm)，流动相均为甲醇-醋酸铵缓冲液，缓冲液为25mmol/L醋酸铵-醋酸缓冲液，以醋酸调节pH值为6.0，甲醇与缓冲液的体积比为45∶55(有机相占流动相比例为45％)，检测波长238nm，分析色谱进样样品浓度为1.2g·mL^-1，进样体积10μL，流速为1mL·min^-1制备色谱进样样品浓度为1.0g·mL^-1，进样体积50mL，流速为20mL·min^-1所得产物的纯度、产率见表4。

实施例4

采用本发明方法，分析色谱柱采用Alltima C18(250mm×4.6mm，5μm)，制备色谱柱采用Alltima C18(250mm×25mm，5μm)，流动相均乙腈-醋酸铵缓冲液，缓冲液为28mmol/L醋酸铵-醋酸缓冲液，以醋酸调节pH值为5.0，乙腈与缓冲液的体积比为36∶64(有机相占流动相比例为36％)，检测波长240nm，分析色谱进样样品浓度为1.0g·mL^-1，进样体积20μL，流速为1mL·min^-1制备色谱进样样品浓度为1.0g·mL^-1，进样体积60mL，流速为20mL·min^-1所得产物的纯度、产率见表4。

实施例5

采用本发明方法，分析色谱柱采用Nucleosil 100-5 C18(250mm×4.6mm，10μm)，制备色谱柱采用Nucleosil 100-5 C18(250mm×25mm，10μm)，流动相均为甲醇-醋酸铵缓冲液，缓冲液为18mmol/L醋酸铵-醋酸缓冲液，以醋酸调节pH值为6.0，甲醇与缓冲液的体积比为50∶50(有机相占流动相比例为50％)，检测波长235nm，分析色谱进样样品浓度为0.8g·mL^-1，进样体积20μL，流速为1mL·min^-1制备色谱进样样品浓度为1.0g·mL^-1，进样体积90mL，流速为20mL·min^-1所得产物的纯度、产率见表4。

实施例6

采用本发明方法，分析色谱柱采用Thermo BDS Hypersil C18(250mm×4.6mm，5μm)，制备色谱柱采用Thermo BDS Hypersil C18(250mm×25mm，5μm)，乙腈-醋酸铵缓冲液为流动相，缓冲液为35mmol/L醋酸铵-醋酸缓冲液，以醋酸调节pH值为5.5，乙腈与缓冲液的体积比为38∶62(有机相占流动相比例为38％)，检测波长230nm，分析色谱进样样品浓度为0.8g·mL^-1，进样体积20μL，流速为1mL·min^-1制备色谱进样样品浓度为0.8g·mL^-1，进样体积100mL，流速为20mL·min^-1所得产物的纯度、产率见表4。

实施例7

采用本发明方法，分析色谱柱采用Ult imate XB-C18(250mm ×4.6mm，10μm)，制备色谱柱采用Ultimate XB-C18(250mm×4.6mm，10μm)，流动相均为甲醇-醋酸铵缓冲液，缓冲液为40mmol/L醋酸铵-醋酸缓冲液，以醋酸调节pH值为5.8，甲醇与缓冲液的体积比为52∶48(有机相占流动相比例为52％)，检测波长232nm，分析色谱进样样品浓度为0.6g·mL^-1，进样体积20μL，流速为1mL·min^-1制备色谱进样样品浓度为0.8g·mL^-1，进样体积95mL，流速为20mL·min^-1所得产物的纯度、产率见表4。

表4各实施例的产品纯度(％)、产率(mg/h)

请参阅图1为本发明高效液相分析色谱分离附子生物碱色谱图谱和图2为本发明高效液相制备色谱分离制备附子生物碱色谱图谱所示，按图2阴影部分收集各流份，各收集液浓缩后在相同制备条件下重复进样纯化，得到6个单酯型二萜类生物碱和3个双酯型二萜类生物碱。

Claims

1.一种液相色谱分离制备中药附子中主要酯型生物碱的方法，从中药附子中分离制备主要酯型生物碱，在分析色谱基础上采用线性放大并优化，建立制备色谱，对中药附子中主要酯型生物碱进行分离制备，其特征在于：

在所述的分析色谱及制备色谱中，色谱柱中的固定相均为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相均为有机相-醋酸盐缓冲体系，所述的有机相占流动相比例为20～70％，有机相为甲醇或乙腈，所述的醋酸盐缓冲体系为醋酸铵-醋酸缓冲体系，检测波长为230～240nm，用流动相溶解并稀释中药附子总生物碱粗提物作为分析色谱和制备色谱的供试品，其中，

Sf＝π(Dp)²/π(Da)²＝(Dp/Da)²

供试品经制备色谱分别收集得到的各主要酯型生物碱流分，先以15～30℃温度旋转蒸发浓缩，后以冷冻干燥机冷冻干燥制得。

2.根据权利要求1所述的从中药附子中分离制备主要酯型生物碱的方法，其特征在于：所述的有机相占流动相体积百分比为30～60％。

3.根据权利要求2所述的从中药附子中分离制备主要酯型生物碱的方法，其特征在于：所述的有机相占流动相体积百分比为36～52％。

4.根据权利要求1所述的从中药附子中分离制备主要酯型生物碱的方法，其特征在于：分析色谱中，进样体积20μL，进样浓度为1.2g·mL^-1，流动相流速为0.6mL·min^-1。

5.根据权利要求1所述的从中药附子中分离制备主要酯型生物碱的方法，其特征在于：制备色谱中，进样体积为20～100mL。

6.根据权利要求1所述的从中药附子中分离制备主要酯型生物碱的方法，其特征在于：所述的醋酸铵-醋酸缓冲体系中，醋酸铵的摩尔浓度为10～40mmol/L，以醋酸调节有机相-醋酸盐缓冲体系的pH值为5.0～7.0。

7.根据权利要求1所述的从中药附子中分离制备主要酯型生物碱的方法，其特征在于：所述中药附子总生物碱粗提物的制备方法为：将附子粉碎成粗粉，取粗粉置于锥形瓶中，粗粉以浓氨水润湿，静置20～40min，加200mL无水乙醚，超声处理8～15min，于2～5℃低温冷藏至少24h，过滤，用无水乙醚少量多次洗涤残渣，合并滤液及洗涤液，旋转蒸发至干，以稀盐酸溶液溶解转移出，以氨试液调pH值为4.8～5.2，用D101树脂柱吸附，按顺序以1倍树脂柱体积的水、2倍树脂柱体积的40％乙醇、8倍树脂柱体积的70％乙醇、3倍树脂柱体积的95％乙醇，进行梯度洗脱，收集70％乙醇洗脱液于旋转蒸发仪蒸至近干，转移至培养皿，30～40℃真空干燥至恒重。

8.根据权利要求1所述的从中药附子中分离制备主要酯型生物碱的方法，其特征在于：所述的浓缩过程为：将各生物碱流分以15～30℃温度旋转蒸发浓缩；所述的冷冻过程为：用冷冻干燥机在-40～-30℃预冻4～6小时，抽真空，压力不大于25Pa，再在-20～-15℃保持4～6小时，最后升温干燥至20～25℃保持4～6小时。