CN103134871B - 高效液相色谱法检测乌头类生物碱用的供试品溶液的制备方法 - Google Patents

Abstract

高效液相色谱法检测乌头类生物碱用的供试品溶液的制备方法，由含有待检乌头类生物碱成分的被检品提取物，经药典允许的溶媒溶解后得到。其中，将被检品的含有乌头类生物碱成分且pH≤5的酸性水提取液，用大孔吸附树脂吸附后，经水洗和/或依次用pH值8~10的碱水及水洗除杂质后，再用醇体积含量50~100%且pH≤4的酸性醇-水溶液洗脱并收集洗脱液，除去溶剂后得到所说的被检品提取物。该制备方法得到的供试品溶液，可广泛适用于目前高效液相色谱法检测乌头类生物碱的色谱条件，生物碱成分的色谱分离效果（分离度）、重现性、稳定性、精密度等均符合中药质量标准分析方法的要求，并可大大减少其它成分的干扰，提高检测限（灵敏度）。

Description

高效液相色谱法检测乌头类生物碱用的供试品溶液的制备方法

技术领域

本发明涉及一种高效液相色谱法检测乌头类生物碱用的供试品溶液的制备方法。

背景技术

    附子、川乌等乌头属药用植物为常用中药材，广泛用于临床治疗中，《全国医药产品大全》收载有含川乌、附子、草乌、短柄乌头、高乌头、黄花乌头的中成药超过350种。乌头属药用植物中主要毒/效成分为双酯型生物碱（乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等）、单酯型生物碱（苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱等）和醇胺型生物碱（乌头原碱、新乌头原碱、次乌头原碱等），因此，乌头属药材、饮片及其制剂一般要求检测乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱，如国家法定标准《中国药典》2010年版（一部）在附子、川乌、草乌质量标准项下规定了高效液相色谱法检测上述6个酯型生物碱的方法和含量限度标准。

高效液色谱法（HPLC）是一种常用的分析方法，在药物质量控制中使用最多、高效、简便。高效液色谱法检测乌头属药材及其炮制加工品（饮片）中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱的方法已有大量的文献报道，但检测相应的中成药或复方药物/制剂报道很少，主要是因为中成药或复方药物/制剂中的生物碱成分含量通常较低，但混合的成分众多、干扰大，因此，限制了高效液色谱法在检测中成药中乌头类生物碱的应用。

中国药典（2010版）（一部）采用HPLC法检测川乌、附子中乌头类生物碱，其供试品溶液的制备方法为：被检品原料，加氨试液、异丙醇-乙酸乙酯（1:1）提取，减压回收除去溶剂，加异丙醇-乙酸乙酯（1:1）等溶媒溶解作为供试品溶液。研究发现，该方法对含有乌头类生物碱成分的被检品的实际测定结果，往往比其真实含量明显偏低，检测结果的准确性不能令人满意，并会导致对相关药物的质量控制、使用和治疗效果的不利影响。

发明内容

    针对上述问题，本发明提供了一种高效液相色谱法检测乌头类生物碱用的供试品溶液的制备方法，不仅操作简单方便，而且可以使乌头类生物碱的实际检测结果更接近其真实含量。

    本发明高效液相色谱法检测乌头类生物碱用的供试品溶液的制备方法，同样是由含有待检乌头类生物碱成分的被检品提取物，经药典允许的溶媒溶解后得到。所说该被检品的提取物，是将被检品的含有乌头类生物碱成分且pH≤5的酸性水提取液，用大孔吸附树脂吸附（例如可采用常规的大孔树脂柱方式）后，先用水洗和/或依次用pH值8~10的碱水及水洗除杂质，即：可以先仅用中性水洗涤，或是依次用所说的碱水和中性水洗涤，还可以采用中性水-碱水-中性水依次洗涤后，再用醇体积含量50~100%且pH≤4的酸性醇-水溶液洗脱并收集洗脱液，除去溶剂后，即得到所说的被检品提取物。其中，所说醇-水溶液中的醇为乙醇或甲醇。

所说的乌头类生物碱成分，至少包括乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱中的一种。

经大孔吸附树脂吸附后的洗涤除杂质，特别优选的是先用pH值8~10的碱性水洗涤，然后用中性水洗涤。实验表明，大孔吸附树脂吸附后先用pH 8~10的碱水洗涤，能更好的除去杂质，再用水洗至近中性后，再进行所说的用酸性醇-水溶液洗脱，从而能更好地分离纯化乌头类生物碱成分。其中，所说的pH值8～10的碱水，可优选最为常用和易得的氢氧化钠、碳酸钠或碳酸氢钠等水溶液，也可以使用包括pH值8～10的氨水溶液等其它碱性成分的水溶液。

上述的制备方法中，所说的被检品的含有乌头类生物碱成分的酸性水提取液，可以为被检品原料的酸水超声波提取液，例如由对含有乌头类生物碱成分的药材原料，或是中成药或其复方制剂原料的酸水超声波提取液；也可以是被检品原料提取物的酸性水溶液，例如将已由目前其它报道和/或使用的其它方法对含有乌头类生物碱成分的被检品原料提取得到的提取物经酸性水溶解后所得到的酸性水溶液。特别是由不同的有机溶剂对被检品原料提取并除去溶剂后的提取物配制的pH≤5的酸水溶液。例如采用pH≤5的含30-80%的甲醇或乙醇或丙酮-水溶液提取、回收溶剂得到的提取物；或采用2010版中国药典川乌、附子项下所述的加氨试液、异丙醇-乙酸乙酯（1:1），超声处理，回收溶剂得到的提取物等。

上述所说的含有乌头类生物碱的被检品原料的pH≤5的酸水提取液，除可直接用大孔吸附树脂柱进行吸附处理外，更优选的方式是，在进行大孔吸附树脂吸附前，先将被吸附处理溶液先用氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠溶液或氨水调节至pH值7~10后，再进行吸附处理。实验显示，将被吸附处理溶液调节至pH值7~10后再用大孔吸附树脂进行吸附处理，将更有利于乌头类生物碱成分的吸附分离，明显提高大孔树脂的吸附率，提高分离效率。

所说的大孔吸附树脂，可以按照目前常规的方式操作，例如可以选择包括D101、HPD100、HPD300、AB-8等目前各种常用型号的大孔树脂，其中优选D101或HPD100等型号的大孔吸附树脂。

上述制备方法中，对经大孔吸附树脂吸附后用酸性醇-水溶液洗脱并收集的洗脱液，优选在≤60℃条件下减压除去溶剂，以避免或减少某些热稳定性不高的乌头类生物碱成分的分解。

上述制备方法中，所说的酸性水提取液和/或酸性醇-水溶液，可以使用高效液相色谱分析中允许使用的酸性成分进行酸化，例如可优选为独立地选自盐酸、硫酸或磷酸，还可以采用甲酸或醋酸等。

    上述制备方法中，由所收集的酸性醇-水溶液洗脱液除去溶剂后得到的被检品提取物，可以直接用中国药典允许的溶媒溶解后配制成所说的供试品溶液。在此基础上的进一步优选方式，是将所收集的含醇洗脱液除去溶剂后，再用水溶解并调节至pH值8～10，用包括三氯甲烷、二氯甲烷或乙酸乙酯等有机溶媒萃取后，萃取液除去有机溶媒，得到所说的被检品提取物。其中，萃取液除去有机溶媒的温度一般可≤50℃，更优选的温度是低于40℃，以尽量避免某些热稳定性不高的乌头类生物碱成分分解，提高检测的准确性。所说的有机溶媒中优选为三氯甲烷。

由本发明上述方法制备得到的被检品提取物配制高效液相色谱法检测用的供试品溶液时，除可以使用中国药典（2010版）中附子含量测定项下允许使用的溶媒外，进一步可优选的溶媒为醇体积含量0~100%的甲醇-水或乙醇-水溶液。

    实验结果表明，本发明制备方法中首先采用了被检品的含有乌头类生物碱成分且pH≤5的酸性水提取液，除去了提取物中的脂溶性杂质；经大孔吸附树脂吸附后，用水和/或碱水洗涤，可以除去色素和水溶性杂质成分；再用酸性醇-水溶液洗脱，即可全部回收生物碱成分。如进一步再用水溶解并碱化至pH 8~10，将水溶性的生物碱酸盐转化为游离生物碱成分后，再用有机溶媒萃取，则可以对生物碱成分进一步分离纯化，除去其它杂质的干扰，对于检测生物碱成分含量较低甚至很低的中成药及复方药物/制剂类被检品显然具有更重要的意义。

采用本发明上述制备方法制备的供试品溶液，可适用于目前已有报道和/使用的高效液相色谱法检测乌头类生物碱的色谱条件，生物碱成分的色谱分离效果（分离度）、重现性、稳定性、精密度等都符合中药质量标准分析方法的要求。与目前方法制备的供试品溶液相比，采用本发明上述方法不仅能充分除去杂质干扰，达到分离纯化乌头类生物碱成分、提高灵敏度和检测限，而且不会损失或破坏所检测的乌头类生物碱成分，加样回收率高（95%-105%），乌头类生物碱的实际检测含量更可比采用目前药典方法的明显提高15-40%。对于如复方中成药等成分复杂的被检品，在进一步采用三氯甲烷等有机溶媒萃取处理后，可更进一步地除去杂质干扰，解决了被测成分与杂质不能实现完全分离（分开），无法定量测定的问题，使被检测的乌头类生物碱成分达到基线分离，无干扰，符合含量测定的要求。

以下结合附图所示实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。其中，供试品溶液制备方法中所说的精密称定、超声处理、上大孔吸附树脂柱、洗脱、回收、萃取、溶解、定容等，均按2010版中国药典（一部）的一般规定和要求进行。

附图说明

    图1是6种乌头类生物碱的标准对照品的HPLC色谱图。

    图2是实施例1供试品（白附片）溶液的HPLC色谱图。

    图中的各峰值分别为：1-苯甲酰新乌头原碱，2-苯甲酰乌头原碱，3-苯甲酰次乌头原碱，4-新乌头碱，5-次乌头碱，6-乌头碱。

具体实施方式

实施例1

取白附片粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入pH 1~2的盐酸溶液50 ml，摇匀，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，放冷，离心，取上清液25ml，上D101型大孔吸附树脂柱（内径约1cm，柱高约10cm），用约3倍柱床体积的水洗涤除杂，弃去水液，再用约4倍柱床体积的pH1~2的含醇70(v)%的乙醇-盐酸水溶液洗脱，收集含醇洗脱液，60℃以下减压回收溶媒后，用甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为HPLC检测用供试品溶液。

实施例2

取炮天雄粉末（过三号筛）约4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入pH2~3盐酸溶液100 ml，摇匀，超声处理（功率250 W，频率30 kHz）40 min，放冷，离心，取上清液75 ml，上HPD100型大孔吸附树脂柱（内径约1.5cm，柱高约10cm），依次分别用2倍柱床体积的水、pH 9-10的氢氧化钠水溶液和水洗涤除杂，弃去水液，再用4~5倍柱床体积的pH2~3的含醇60(v)%的乙醇-盐酸水溶液洗脱，收集含醇洗脱液，60℃以下减压回收溶剂后，用水溶解，转移至5ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，离心，取上清液作为HPLC检测用供试品溶液。

实施例3

取铁棒锤粉末（过四号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入pH3~4硫酸溶液50 ml，摇匀，超声处理（功率100 W，频率40 kHz）60 min，放冷，离心，取上清液40 ml，用碳酸氢钠调pH 7-8，上HPD300型大孔吸附树脂柱（内径约1cm，柱高约10cm），依次分别用2~3倍柱床体积的pH 8-9的碳酸氢钠溶液和水洗涤除杂，弃去水液，再用4倍柱床体积的pH3~4的含醇70(v)%的甲醇-盐酸水溶液洗脱，收集洗脱液，60℃以下减压回收溶剂后，用50(v)%乙醇溶解，转移至2 ml量瓶中，加50(v)%乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为HPLC检测用供试品溶液。

实施例4

取制川乌粉末（过80目筛）约4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入pH2~3含50%甲醇的盐酸-水溶液100 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率180 W，频率42 kHz）40min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液75ml，60℃以下减压回收溶剂，得到制川乌提取物。将该提取物用pH4~5的盐酸溶液溶解，定容至50ml，离心，取上清液40ml，用氨试液调pH 8~9，上AB-8型大孔吸附树脂柱（内径约1.5cm，柱高约10cm），依次分别用约3倍柱床体积的水、pH 8-9的碳酸氢钠溶液和水洗涤除杂，弃去水液，再用4~5倍柱床体积的pH3~4的含醇50(v)%的乙醇-盐酸水溶液洗脱，收集洗脱液，60℃以下减压回收溶媒后，用60(v)%甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加60(v)%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为HPLC检测用供试品溶液。

实施例5

取小活络丸粉末（过四号筛）约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.05mol·L^-1盐酸溶液100ml（约pH 1），摇匀，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，离心，取上清液75ml，用碳酸氢钠调pH8~9，上HPD100型大孔吸附树脂柱（内径约1.5cm，柱高约12cm），依次分别用3倍柱床体积的pH 9-10的氢氧化钠溶液和水洗涤除杂，弃去水液，再用4~5倍柱床体积的pH1~2的含醇80(v)%的乙醇-盐酸水溶液洗脱，收集洗脱液，60℃以下减压回收溶剂，加水溶解（约15ml），用碳酸氢钠调节pH8~9，再用三氯甲烷萃取4次，每次15ml，合并三氯甲烷液，低温（40℃）蒸干，残渣用pH1~2的盐酸溶液溶解定容至2 ml，摇匀，滤过，取续滤液作为HPLC检测用供试品溶液。

实施例6

取附子理中丸粉末（过三号筛）约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入pH1~2含50%乙醇的盐酸-水溶液100 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30min，放冷，再称定重量，用50(v)%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液75ml，60 ℃以下减压回收溶剂，得到附子理中丸提取物。加水溶解定容至50ml，离心，取上清液40ml，上D101型大孔吸附树脂柱（内径约1.5cm，柱高约12cm），依次分别用3~4倍柱床体积的水、pH9~10的碳酸钠溶液和水洗涤除杂，弃去水液，再用3~4倍柱床体积的pH 0.5的含醇60(v)%的甲醇-盐酸水溶液洗脱，收集洗脱液，60℃以下减压回收溶剂，加水溶解（10~20ml），用氨试液调节pH值至9，再用三氯甲烷萃取3~5次，每次10~20ml，合并三氯甲烷液，低温（40℃）蒸干，残渣用pH3~4的含醇40(v)%的甲醇-盐酸溶液溶解定容至2 ml，摇匀，滤过，取续滤液作为HPLC检测用供试品溶液。

实施例7

取骨刺丸粉末（过80目筛）约8 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1 mol·L^-1盐酸溶液200 ml（约pH 0.5），摇匀，超声处理（功率250 W，频率20 kHz）40 min，放冷，离心，取上清液150 ml，用氢氧化钠溶液调pH9~10，上HPD300型大孔吸附树脂柱（内径约2cm，柱高约15cm），依次分别用约3倍柱床体积的pH9~10的氨水和水洗涤除杂，弃去水液，再用约5倍柱床体积的pH3~4的甲醇洗脱，收集洗脱液，于50℃减压回收溶剂，加水溶解（约20 ml），加碳酸氢钠制成饱和溶液（约pH 8.5），再用三氯甲烷萃取5次，每次15ml，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣用pH2~3的30(v)%乙醇溶液2 ml溶解，滤过，取续滤液作为HPLC检测用供试品溶液。

实施例8

取黑附片提取物约1 g，精密称定，置25ml量瓶中，加入pH2~3的盐酸溶液定容至刻度，超声溶解，取上清液10 ml，上D101型大孔吸附树脂柱（内径约1.2cm，柱高约10cm），依次分别用3倍柱床体积的pH 9-10的氢氧化钠溶液和水洗涤除杂，弃去水液，再用4倍柱床体积的pH1~2的含醇80(v)%的甲醇-盐酸水溶液洗脱，收集洗脱液，60℃以下减压回收溶剂后，用pH1~2的盐酸甲醇溶解，定容至2 ml，摇匀，滤过，取续滤液作为HPLC检测用供试品溶液。

以下通过以HPLC法对不同制备方法得到的被检测原料供试品溶液进行乌头类生物碱含量的检测结果，进一步说明本发明的有益效果。

、HPLC法测定附子、川乌等乌头类生物碱的含量  照药典方法操作。

（1）色谱条件：

色谱柱为Eclipse XDB C₁₈柱（4.6 mm×250 mm，5μm）。柱温：35 ℃。流动相：以乙腈-四氢呋喃(25：15)为流动相A，以0.lmol/L醋酸铵溶液（每1000m1加冰醋酸0.5ml）为流动相B，按下表1的方式进行梯度洗脱。流速：1 ml·min^-1；检测波长为235nm。理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于3000。乌头类生物碱中6种主要生物碱标准对照品溶液及实施例1白附片供试品溶液的色谱图分别如图1和图2所示。结果表明，本发明方法制备的供试品溶液中的6种乌头类生物碱成分的分离效果理想，且保留时间与标准对照品一一对应相同。

                                                 

（2）供试品溶液制备方法的比较研究：

药典方法（中国药典(2010版)，以下同此）：取表2所列各样品粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3 ml，精密加入异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）50 ml，摇匀，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz；水温在25 ℃以下）30 min，放冷，再称定重量，用异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 ml，40 ℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液3 ml溶解，滤过，取续滤液，即得。进样10μl。

对照方法：取表2所列各样品粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入pH 1-2盐酸溶液50 ml，摇匀，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，放冷，离心。上清液滤过，取续滤液，即得。进样100μl。

本发明方法：取表2所列各样品粉末，按实施例1方法制备供试品溶液。进样10μl。

测定法：均按药典方法操作，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表2。

结果：由表2可见，以pH1~2盐酸溶液超声提取，或按本发明方法制备的供试品溶液，5批样品中6种酯型生物碱的含量均比药典制备方法高约15~40%。试验表明，本发明方法使用pH≤4和醇体积含量为50~100%的酸性乙醇或甲醇的水溶液洗脱大孔吸附树脂，不仅可实现富集纯化乌头类生物碱成分，而且能全部回收生物碱成分，避免了损失。由于酯型生物碱在中性或碱性条件下稳定性差，如药典制备方法规定25 ℃以下超声提取、40 ℃以下减压回收，而本发明方法中收集的吸附洗脱液为酸性醇溶液，不仅在酸性条件下酯型生物碱的稳定性高，而且醇溶液可以下方便地被低温回收浓缩，更确保了供试品溶液的稳定。

（3）标准对照品溶液的制备：

取新乌头碱、次乌头碱、乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱对照品适量，精密称定，加0.05%盐酸甲醇溶液配制成每1ml含新乌头碱0.15372mg、次乌头碱0.15456mg、乌头碱0.15960mg、苯甲酰新乌头原碱0.16092mg、苯甲酰次乌头原碱0.15660mg、苯甲酰乌头原碱0.15008mg的混合对照品溶液Ⅰ。精密吸取上述混合对照品溶液1ml，加0.05%盐酸甲醇溶液稀释至10ml，摇匀，即得混合对照品溶液Ⅱ。

（4）供试品溶液的制备：实施例1制备的供试品溶液。

（5）线性关系考察：

精密吸取（3）项下混合对照品溶液Ⅰ 5，10，15，20μl和混合对照品溶液Ⅱ 2，5，10，15，20μl，注入液相色谱仪中，以进样量（μg）为横坐标，对照品峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表3。

（6）精密度试验：

精密吸取（4）项下的供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，重复进样6次，按（1）项下色谱条件进行检测，记录峰面积，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD分别为1.1%、1.9%、1.3%、0.8%、1.6%、1.0%（n=6），表明仪器精密度好。

（7）稳定性试验：

取同一供试品溶液，于室温0、1、2、4、8、12 h进样测定，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD分别为0.9%、1.4%、0.7%、1.8%、2.1%、1.5%（n=6），表明供试品溶液在12 h内稳定。

（8）重复性试验：

取同一批附子粉末（白附片）约2 g，共6份，精密称定，按照实施例1的方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按（1）项下色谱条件进行检测，记录峰面积，计算含量。苯甲酰新乌头原碱的平均含量为1.45×10^-4 g·g^-1（RSD=1.8%）；苯甲酰乌头原碱的平均含量为2.87×10^-5 g·g^-1（RSD=2.0%）；苯甲酰次乌头原碱的平均含量为1.63×10^-5 g·g^-1（RSD=1.5%）；新乌头碱的平均含量为7.08×10^-5 g·g^-1（RSD=1.2%）；乌头碱的平均含量为2.50×10^-5 g·g^-1（RSD=2.3%）；次乌头碱的平均含量为8.27×10^-5 g·g^-1（RSD=1.7%）（n=6）。

（9）加样回收率试验  取已知含量的样品（白附片）1.0 g，共6份，精密称定，准确加入与样品中含量等量的对照品，按照含量测定项下方法操作，测定含量，计算回收率。苯甲酰新乌头原碱的平均回收率为101.7%（RSD=1.6%）；苯甲酰乌头原碱的平均回收率为96.5%（RSD=2.4%）；苯甲酰次乌头原碱的平均回收率为98.2%（RSD=1.3%）；新乌头碱的平均回收率为97.4%（RSD=1.5%）；乌头碱的平均回收率为95.9%（RSD=2.3%）；次乌头碱的平均回收率为98.4%（RSD=1.7%）（n=6）。

、HPLC法测定小活络丸、附子理中丸中乌头类生物碱的含量

（1）色谱条件  同上。

（2）供试品溶液制备方法   

分别取实施例5和实施例6制备的小活络丸、附子理中丸供试品溶液。进样量10-50μl。

（3）同上述方法操作，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。结果见表4。

（4）按上述方法进行线性、精密度、稳定性、重现性和回收率试验，均符合中国药典的规定和要求。

进一步试验表明，小活络丸、附子理中丸按现行版中国药典方法制备供试品溶液，因中药复方中其它成分的干扰，HPLC色谱分离效果差，多个酯型生物碱成分未达到基线，分离度不符合要求。

进一步研究表明，上述供试品溶液在不同品牌的色谱柱：Eclipse XDB C₁₈柱（4.6 mm×250 mm，5μm）、Phenomenex Luna C₁₈(2)（4.6 mm×150 mm，5μm）等，以及现行版中国药典或文献报道的色谱条件，均能获得良好的分离效果，各酯型生物碱成分的含量无显著性差异。

上述的实验结果充分表明，采用本发明方法制备得到的供试品溶液，不仅酯型生物碱成分的含量明显高于药典方法（15~40%），而且对复方中药能充分除去杂质干扰，色谱分离效果好，重现性、稳定性、精密度等符合中国药典的要求。

Claims (10)

1.高效液相色谱法检测乌头类生物碱用的供试品溶液的制备方法，由含有待检乌头类生物碱成分的被检品提取物，经药典允许的溶媒溶解后得到，将被检品的含有乌头类生物碱成分且pH≤5的酸性水提取液，用大孔吸附树脂吸附后，经水洗和/或依次用pH值8~10的碱水及水洗除杂质，其特征是用醇体积含量50~100%且pH≤4的酸性醇-水溶液洗脱并收集洗脱液，除去溶剂后得到所说的被检品提取物，所说醇-水溶液中的醇为乙醇或甲醇。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是将所收集的含醇洗脱液除去溶剂后，再用水溶解并调节至pH值8～10，用包括三氯甲烷、二氯甲烷或乙酸乙酯在内的有机溶媒萃取后，萃取液除去有机溶媒，得到所说的被检品提取物。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征是所说的有机溶媒优选三氯甲烷。

4.如权利要求1至3之一所述的制备方法，其特征是所说的被检品的含有乌头类生物碱成分的酸性水提取液，为被检品原料的酸水超声波提取液，或是被检品原料提取物的酸性水溶液。

5.如权利要求1至3之一所述的制备方法，其特征是用所说的大孔吸附树脂吸附前，被吸附溶液先用氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠溶液或氨水调节至pH值7~10。

6.如权利要求1至3之一所述的制备方法，其特征是对经大孔吸附树脂吸附后用酸性醇-水溶液洗脱并收集的洗脱液，在≤60℃条件下减压除去溶剂。

7.如权利要求1至3之一所述的制备方法，其特征是所说的酸性水提取液和/或酸性醇-水溶液中的酸为独立地选自盐酸、硫酸或磷酸。

8.如权利要求1至3之一所述的制备方法，其特征是所说的pH值8~10的碱水为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠的水溶液或氨水。

9.如权利要求1至3之一所述的制备方法，其特征是所说的乌头类生物碱成分至少为乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱中的一种。

10.如权利要求1至3之一所述的制备方法，其特征是所说药典允许的溶媒为醇体积含量0~100%的甲醇-水或乙醇-水溶液。