CN104807944A - 鸦葱总黄酮的制备方法及其指纹图谱 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鸦葱总黄酮的制备方法及其指纹图谱，具体步骤为采用溶剂浸泡法进行提取，利用大孔树脂柱色谱制备鸦葱总黄酮；将鸦葱总黄酮制备成供试品溶液，在一定的条件下经过高效液相色谱仪的分离检测，获得鸦葱总黄酮的指纹图谱。本发明提供的鸦葱总黄酮的制备方法，操作简便，稳定可行，由该方法制备的鸦葱总黄酮中黄酮类成分含量提高至90％以上；本发明提供的鸦葱总黄酮的指纹图谱，操作简便，稳定性高、重现性好、特征峰多，能全面、准确地评价鸦葱总黄酮的质量。

Description

鸦葱总黄酮的制备方法及其指纹图谱

技术领域

本发明涉及一种鸦葱总黄酮的制备方法；一种鸦葱总黄酮指纹图谱的建立方法，以及由该方法所得的鸦葱总黄酮标准指纹图谱，属于中药分析领域。

背景技术

鸦葱为菊科植物Scorzonera austriaca Wild的干燥全草。五月～六月采挖、晒干。本品全长10～40厘米；根粗壮，倒圆锥状，直径约0.3～3厘米；茎多数，簇生于根颈顶端，不分枝，光滑无毛，茎基被稠密褐色的纤维状撕裂的鞘状残遗；基生叶广披针形至长圆状卵形，长20～30(-40)厘米，宽1.2～3.5(-5)厘米，边缘平展，基部鞘状扩大，鞘内被稠密的棉毛，基部边缘有棉毛；茎生叶少数，1～3枚，鳞片状；头状花序单生茎顶，瘦果无毛。鸦葱作为传统中药，全草入药，具有清热解毒、消炎、通乳的功效，主治痈疮、淋病、妇女带下、乳腺炎等症。鸦葱也是一味传统藏药(藏名:巴多拉)。关于鸦葱化学成分的研究除本研究室外，只有武全香、祝英、李娟等报道了鸦葱中倍半萜类和三萜类化学成分的研究(Wu Q X,Su Y B,Zhu Y.Triterpenes and steroids from the roots of Scorzonera austriaca[J].Fitoterapia.2011,82(3):493–496)、(Zhu Y,Hu P Z,He Z W,et al.Sesquiterpene Lactones from Scorzonera austriaca[J].Journal of NaturalProducts.2010,73(2):237–241)、(Zhu Y,Wu Q X,Hu P Z,et al.Biguaiascorzolides A and B:Two noveldimeric guaianolides with a rare skeleton from Scorzonera austriaca[J].Food Chemistry.2009,114(4):1316–1320)、(Li J,Wu Q X,Shi Y P,et al.A new sesquiterpene lactone from Scorzonera austriaca[J].ChineseChemical Letters.2004,15(11):1309–1310)，Ting-Fu Jiang等报道了香豆素类化学成分的研究(T.F.Jiang et.al.Determination of kavalactones and flavonoid glycoside in Scorzonera austriaca by capillary zoneelectrophoresis[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2007,43(3)：854-858)。本研究室对鸦葱中黄酮类化学成分进行了研究(李泉妙,王广树.鸦葱中黄酮苷类成分的提取分离与结构鉴定[J].吉林大学学报(医学版),2010,36(1):10-12)、(刘欣，张子龙，王广树等.鸦葱中黄酮成分的提取分离及结构鉴定[J].吉林大学学报(医学版)，2012，38(3)：595-597)、(何琭.鸦葱中黄酮类化合物的研究[D].吉林大学研究生学位论文,2012)、(李泉妙.鸦葱中化学成分的研究及保肝活性的初探[D].吉林大学研究生学位论文,2008)。迄今为止，本研究室从鸦葱中分得了10余种黄酮类化合物，对总黄酮提取物进行了生物活性研究，发现鸦葱总黄酮具有治疗肝炎和保肝作用，于2013年获得了中国发明专利(一种鸦葱总提取物及其在制备治疗肝炎或保肝药物中的用途，专利号ZL 201110255235.1，授权公告日2013-06-04)。本研究室正在进行以鸦葱为原料，以鸦葱总黄酮为有效部位，以治疗病毒性肝炎为目标的新药创制的研究，并获得了国家科技重大专项的资助(国家科技重大专项“重大新药创制”，治疗病毒性肝炎创新药物-YCZT的研究，2013ZX09103002-007)。中药指纹图谱技术是目前国内外公认的用来控制中药、天然药物或中药材整体质量最有效、最准确、最直接的手段，是一种综合的、宏观的和可量化的鉴别方法，其基本属性是“整体性”和“模糊性”。“整体性”是指完整地比较色谱的特征“面貌”；“模糊性”强调的是对照物与待测样品指纹图谱的相似性。运用指纹图谱技术可以鉴别中药材和中成药的真伪，评价原料药材、半成品和成品质量的均一性和稳定性。

综上所述，为了开发以鸦葱总黄酮为有效部位，以治疗病毒性肝炎为目标的新药，有必要研究鸦葱总黄酮的制备方法及其质量控制方法。为此本研究室发明了一种鸦葱总黄酮的制备方法，以此方法制备的鸦葱总黄酮中黄酮类成分含量提高至90％以上，同时发明一种鸦葱总黄酮的指纹图谱建立方法及标准指纹图谱，该方法操作简便、稳定和重现性好，能全面、准确地控制鸦葱总黄酮的质量。

发明内容

发明的目的是为了开发以鸦葱总黄酮为有效部位，以治疗病毒性肝炎为目标的新药，提供一种稳定可行的鸦葱总黄酮的制备方法和一种由该方法制得的鸦葱总黄酮质量控制方法，其特点是(1)由该方法制备的鸦葱总黄酮中黄酮类成分含量提高至90％以上；(2)将鸦葱总黄酮制备成供试品溶液后，经过高效液相色谱仪分离检测，获得鸦葱总黄酮的指纹图谱，该方法操作简便，稳定性高、重现性好、特征峰多，能全面、准确地控制鸦葱总黄酮的质量。

1.本发明鸦葱总黄酮的制备方法具体包括如下步骤：

1)鸦葱全草用70％乙醇冷浸提取3次，每次7d，提取液过滤后浓缩除醇，过滤，经D101型大孔树脂柱吸附，水、60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱组分，减压回收乙醇，干燥，得鸦葱提取物；

2)将鸦葱提取物用水溶解，上样于D4020型大孔树脂柱色谱，先以5％乙醇除杂，再收集10％～30％乙醇洗脱的黄酮类成分组分，合并后减压回收溶剂，干燥至恒重，即得鸦葱总黄酮。

2.本发明一种鸦葱总黄酮指纹图谱的建立方法具体包括如下步骤：

1)供试品溶液的制备：取鸦葱总黄酮，60％乙醇超声溶解并定容，作为供试品溶液；

2)参照物溶液的制备：取鸦葱黄酮苷A对照品，60％乙醇超声溶解并定容，作为参照物溶液；

3)制作鸦葱总黄酮指纹图谱：分别精密吸取供试液溶液和参照物溶液，经高效液相色谱仪分离检测，其中，流动相的组成为乙腈-0.1％甲酸水溶液；采用梯度洗脱；得到鸦葱总黄酮指纹图谱。

其中，供试品溶液按如下步骤制备：精密称定各批次经干燥至恒重的鸦葱总黄酮0.0020g，60％乙醇超声溶解并定容于10ml容量瓶中，摇匀后，作为供试品溶液。

对照物溶液按如下步骤制备：精密称定鸦葱黄酮苷A 0.0020g，60％乙醇超声溶解并定容于10ml容量瓶中，摇匀后备用。

色谱条件为：Phenomenex Gemini 5μm C18110A，250mm×4.6mm，5μm色谱柱；流动相A为色谱乙腈，B为0.1％甲酸-水；流速0.8mL·min^-1；柱温30℃；检测波长337nm；进样量10μL。梯度洗脱程序：0.01～7.00min，97％～86％B；7.01～30.00min，86％～83％B；30.01～60.00min，83％～65％B；60.01～65.00min，65％～0％B。

本发明还提供由上述鸦葱总黄酮指纹图谱的建立方法得到的鸦葱总黄酮标准指纹图谱。

将12份鸦葱总黄酮样品按上述方法制备成供试品溶液，在高效液相色谱仪上分离检测，使用国家药典委员会的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件分析，得到鸦葱总黄酮标准指纹图谱。

所述标准指纹图谱有14个特征峰，第5号色谱峰对应鸦葱黄酮苷A，图谱总长度为65min，5号峰平均保留时间为32.17min，以5号峰为参照峰，计算特征峰的相对保留时间和相对峰面积，平均相对保留时间和相对峰面积如下：

1号峰，平均相对保留时间为0.7942，平均相对峰面积为0.3068；

2号峰，平均相对保留时间为0.8936，平均相对峰面积为0.3782；

3号峰，平均相对保留时间为0.9338，平均相对峰面积为1.4074；

4号峰，平均相对保留时间为0.9565，平均相对峰面积为0.4556；

5号峰，平均相对保留时间为1.0000，平均相对峰面积为1.0000；

6号峰，平均相对保留时间为1.0516，平均相对峰面积为0.5007；

7号峰，平均相对保留时间为1.1694，平均相对峰面积为0.0639；

8号峰，平均相对保留时间为1.2372，平均相对峰面积为0.3296；

9号峰，平均相对保留时间为1.2631，平均相对峰面积为0.0802；

10号峰，平均相对保留时间为1.5411，平均相对峰面积为0.0527；

11号峰，平均相对保留时间为1.5724，平均相对峰面积为0.5788；

12号峰，平均相对保留时间为1.5893，平均相对峰面积为0.0602；

13号峰，平均相对保留时间为1.6623，平均相对峰面积为0.2276；

14号峰，平均相对保留时间为1.7810，平均相对峰面积为0.0527。

本发明鸦葱总黄酮的制备方法和鸦葱总黄酮的指纹图谱建立方法及标准指纹图谱有如下显著的优点：

(1)本发明鸦葱总黄酮的制备方法中所采用的大孔吸附树脂具有机械强度高、吸附性能好、选择性高、价格低廉、预处理及再回收方法简单等，纯化方法稳定可行，纯化后黄酮类成分含量提高至90％以上。

(2)色谱条件容易实现，乙腈系统柱压较低，有利于系统的稳定。

(3)本发明色谱条件下的各特征色谱峰均实现了基线分离，不仅能从整体上对鸦葱总黄酮进行模糊识别，也可对比参照物色谱对鸦葱总黄酮进行清晰鉴别及鸦葱总黄酮的多组分定量分析；

(4)本发明方法稳定性高、重现性好、特征峰多，能全面、准确地控制鸦葱总黄酮的质量。

附图说明

附图1 5种大孔吸附树脂静态吸附动力学曲线；

附图2 不同浓度乙醇对黄酮的解吸情况；

附图3 是鸦葱总黄酮特征指纹图谱，图中从左到右分别是第1至14号特征峰；

附图4 是鸦葱总黄酮的参照物鸦葱黄酮苷A图谱。

具体实施方式

实施例1：鸦葱总黄酮的制备方法

1)药品、试剂和仪器

SHIMADZU LC-10AT VP Plus高相液相色谱仪(日本岛津)，AR1530分析天平(美国奥豪斯)，BT125D型准微量电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，SHZ-95B型循环水式多用真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)，SDC-6节能型智能恒温槽(宁波新芝生物科技股份有限公司)，R502B型旋转蒸发器(上海豫康科教仪器设备有限公司)，RE-52AA型旋转蒸发器(上海雅荣生化仪器设备有限公司)，ZF-7型暗箱三用紫外线分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)，HZQ-2型恒温振荡器(金坛市华城开元实验仪器厂)，UV-2100型紫外分光光度计(美国尤尼克)，UVmini-1240型紫外分光光度仪(日本岛津)。

D101、D4020、NKA-9、X-5、AB-8型大孔吸附树脂(天津南开和成科技有限公司)，GF254薄层层析硅胶、聚酰胺薄膜、柱层析硅胶200～300目(青岛海洋化工厂)，ODS高纯填料GHODSA12S50(日本)，色谱纯化学试剂(Fisher Scientific)及分析纯化学试剂(北京化工厂)，水为超纯水。

鸦葱药材共12批采自于吉林省四平地区，经吉林大学药学院生药教研室张静敏教授鉴定为鸦葱Scorzonera austriaca Wild。

2)对照品鸦葱黄酮苷A的制备

鸦葱全草用70％乙醇冷浸提取3次，每次7d，提取液过滤后浓缩除醇，过滤，经D101型大孔树脂柱吸附，水、60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱组分，减压回收乙醇，干燥，得鸦葱提取物。通过硅胶柱色谱、ODS柱色谱等分离纯化手段，得到鸦葱黄酮苷A：5,7,3′,4′-四羟基黄酮-6-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷(1.刘欣，张子龙，王广树等.鸦葱中黄酮成分的提取分离及结构鉴定[J].吉林大学学报(医学版)，2012，38(3)：595-597)；2.何琭.鸦葱中黄酮类化合物的研究[D].吉林大学研究生学位论文,2012)。经纯度分析(色谱条件：色谱柱：Phenomenex Gemini 5u C18110A(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)；流速：0.8mL·min^-1；柱温：30℃；检测波长：337nm；梯度洗脱程序：0.01～7.00min,97％～86％B；7.01～30.00min,86％～83％B；30.01～60.00min,83％～65％B；60.01～65.00min,65％～0％B)可作为对照品。HPLC色谱图见附图4，保留时间32.17min，理论塔板数39168.496，峰面积99.085％，拖尾因子1.080。

3)鸦葱中黄酮类化合物的定量分析方法

a.对照品溶液的制备和供试品溶液的制备

精密称定干燥至恒重的鸦葱黄酮苷A，用60％乙醇制成0.104mg·mL-1质量浓度的对照品溶液。精密称定干燥至恒重的2)项下的鸦葱提取物，用60％乙醇制成0.400mg·mL-1质量浓度的供试品溶液。

b.标准曲线的绘制

分别精确移取鸦葱黄酮苷A对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mL至10mL容量瓶，各加入3mL的1％三氯化铝-甲醇显色剂和3mL pH＝5的醋酸-醋酸钠缓冲液，60％乙醇定容，显色1h后于390nm波长测定各浓度对照品溶液吸光度A值，以空白试剂为参照。线性回归得鸦葱黄酮苷A质量浓度X(mg·mL^-1)与吸光度A的回归方程A＝19.676X+0.004(R2＝0.9999)，X在0.001～0.0416mg·mL^-1范围内线性关系良好。

c.方法学验证

分别精确移取对照品溶液1.5mL、供试品溶液0.8mL各六份于10mL容量瓶中，显色后测定吸光度A，空白溶液为参照。结果表明，吸光度的RSD分别为0.68％和1.44％，说明精密度良好。

分别精确移取对照品溶液2.0mL、供试品溶液1.0mL于10mL容量瓶，显色后0、10、20、30、40、50、60、80、100、120min测定吸光度A，空白溶液为参照。结果表明显色60min之后测得的吸光度值较稳定，则选取显色1h之后进行吸光度测定。

取同一干燥至恒重的鸦葱提取物5份，制成供试品溶液，各精密移取1.0mL，显色1h后测定吸光度，由标准曲线计算黄酮含量。结果表明吸光度和黄酮含量的RSD分别为0.83％和0.28％，说明该方法重复性良好。

精密移取1.0mL已测定质量浓度为0.404mg·mL-1的供试品溶液6份于6只10mL容量瓶中，分别加入0.104mg·mL^-1的对照品溶液0、0.5、0.8、1.2、1.5、1.8mL，按上述方法测定吸光度，计算黄酮含量和回收率。结果显示，5次试验的加标回收率结果均在100％～105％之间，平均加标回收率103.6％，RSD为1.08％，说明该方法有可行性。

4)大孔树脂纯化鸦葱总黄酮的研究

a大孔树脂预处理

将AB-8、D101、D4020、NKA-9和X-5型等5种型号的大孔吸附树脂均完全浸泡于95％乙醇中待充分溶胀，24h后装于层析柱内，用95％乙醇淋洗树脂直至洗脱液加入适量水后不再混浊，再用水洗至无醇味。将树脂完全浸泡于5％HCl中4h并淋洗2倍体积，用蒸馏水洗至中性。将树脂完全浸泡于5％NaOH中4h并淋洗2倍体积，用蒸馏水洗至中性。

b静态吸附试验和静态解吸试验

将适量预处理好的5种型号大孔吸附树脂干燥，分别称取干燥的AB-8、D101、D4020、NKA-9和X-5型大孔树脂2.241、1.640、2.165、2.513、2.067g，均相当于体积10mL，置于250mL具塞三角瓶中，各加入按3)a项下方法配制的鸦葱提取物样品溶液(0.520mg·mL-1)20mL，与大孔树脂混匀后置于恒温振荡器中，水浴振荡24h使充分吸附，再从上清液精密移取0.5mL于10mL容量瓶中，显色后测定吸光度，计算黄酮质量浓度变化、吸附量和吸附率(见表1)。

分别将吸附了鸦葱提取物的5种大孔树脂过滤处理后，置于250mL具塞三角瓶中，各加入95％乙醇20mL，密封后均置于恒温振荡器中解吸。解吸24h后从上清液精密移取0.5mL于10mL容量瓶中，显色后测定吸光度，计算黄酮质量浓度变化、解吸量和解吸率(见表1)。

表1 5种大孔吸附树脂的静态吸附及解吸性能

      

c静态吸附动力学特性测定

照b项下方法，置于恒温振荡器中振荡后，每2h从上清液精密移取0.5ml于10ml容量瓶中，络合显色1h后测定吸光度，计算不同时间下吸附率，绘制5种树脂的静态吸附的动力学曲线，结果如图1所示。由静态吸附动力学曲线可以看出，开始时吸附率增大较快，6h后吸附速率变化较缓，8h后接近平衡，达到吸附饱和状态。

d乙醇浓度对树脂静态解吸的影响

按b静态吸附方法吸附完全后，测定平衡浓度，过滤处理，再将吸附样液的大孔树脂分别用5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％和95％乙醇溶液各20ml静态解吸3h后过滤，每次精密移取1.0ml于10ml容量瓶中，显色1h后测定吸光度，计算洗脱液的黄酮质量浓度，绘制不同浓度乙醇解吸的黄酮含量曲线，结果如图2所示。不同体积分数的乙醇水溶液对鸦葱中黄酮类成分的洗脱能力不同，当乙醇体积分数达到40％以上时，解吸液中的黄酮含量很少，结合成本方面考虑，可认为40％体积分数的乙醇可以将鸦葱中的黄酮类成分洗脱完全。

e动态吸附试验

将预处理好的5种不同型号的大孔吸附树脂500mL湿法装至玻璃层析柱(4cm×60cm)中，树脂高度约为40cm。制备样液并吸附：称取鸦葱提取物4.000g 5份，各加入50mL蒸馏水超声溶解过滤，滤渣再用25mL蒸馏水再次超声溶解过滤，合并滤液上样于5根大孔树脂层析柱。吸附6h后用蒸馏水洗去少量的水溶性杂质，再用不同体积分数(5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、60％、95％)的乙醇溶液洗脱至流出液无色，每100mL接受一份，TLC检查成分。使用氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水＝2:2.2:4:1有机层为展开剂，10％硫酸-乙醇氧化显色，将以黄酮成分为主的组分合并作为纯化后的鸦葱黄酮。

f 5种型号大孔树脂纯化结果比较

标准曲线法：精密称定纯化前的鸦葱提取物和5种型号大孔树脂纯化后的鸦葱总黄酮适量，用60％乙醇超声溶解并定容于10mL容量瓶。然后各精密移取2.0mL于10mL容量瓶中，显色后测定吸光度，计算黄酮百分含量和回收率(见表2)。实验表明：经大孔树脂纯化后，鸦葱总黄酮组分中黄酮类成分的百分含量均有不同程度的增加，增加幅度由高到低的顺序为D4020＞X-5＞AB-8＞D101＞NKA-9，D4020纯化结果最为理想高达93.75％。

表2 5种大孔树脂的纯化结果

      

注：表中m0为精密称定量，m'为按2.2.3标准曲线计算得黄酮类成分质量，P鸦葱总黄酮组分中黄酮类成分的百分含量，M为大孔树脂精制后的鸦葱总黄酮组分质量。

HPLC检测结果：精密称定纯化前的鸦葱提取物以及5种型号大孔树脂纯化后的鸦葱总黄酮0.0050g，60％乙醇超声溶解并定容于10mL容量瓶。各精密吸取10μL注入高效液相色谱仪分析检测，色谱条件同2)，记录总峰面积并进行比较(见表3)。实验表明：经各种大孔树脂纯化后，鸦葱总黄酮组分中黄酮类成分百分含量均有不同程度提高，纯化效果与标准曲线法结果一致，但NKA-9纯化效果不明显，D4020的纯化效果最理想，黄酮含量提高显著。

表3 色谱图总峰面积

      

g纯化方法的确定

通过比较5种大孔吸附树脂的吸附、解吸附性能以及纯化后的黄酮类成分含量、回收率，筛选出D4020型大孔树脂用于鸦葱总黄酮的纯化：先以5％乙醇除杂，再收集10％～30％乙醇洗脱的黄酮类成分组分，合并后减压回收溶剂，干燥至恒重，即得鸦葱总黄酮组分。其黄酮类成分含量可从63.13％提高至93.75％，收率63.4％。综上所述，D4020型大孔吸附树脂对鸦葱中黄酮类成分起到了很好的富集纯化效果。

h D4020型大孔树脂纯化粗制鸦葱总黄酮方法的验证

称取同一批鸦葱提取物4.000g 6份，按已筛选出的D4020型大孔吸附树脂纯化方法制备鸦葱总黄酮，干燥至恒重。各精密称定鸦葱总黄酮0.0020g，用60％乙醇溶解并定容于10mL容量瓶中。再分别精密移取2.0mL至10mL容量瓶中，显色后测定吸光度，计算鸦葱总黄酮中黄酮类成分的百分含量(见表4)。实验表明：D4020型大孔吸附树脂纯化鸦葱中黄酮类成分方法稳定可行，纯化后黄酮类成分含量提高至90％以上。

表4 D4020型大孔树脂纯化实验的验证结果

      

注：表中m0为精密称定量，m'为按2.2.3标准曲线计算得黄酮类成分质量，P鸦葱总黄酮组分中黄酮类成分的百分含量。

实施例2：鸦葱总黄酮指纹图谱的建立

1)供试品溶液的制备

鸦葱药材用70％乙醇冷浸提取3次，每次7d，提取液过滤后浓缩除醇，过滤，经D101型大孔树脂柱吸附，水、60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱组分，减压回收乙醇，干燥，得鸦葱提取物；将鸦葱提取物用水溶解，上样于D4020型大孔树脂柱色谱，先以5％乙醇除杂，再收集10％～30％乙醇洗脱的黄酮类成分组分，合并后减压回收溶剂，干燥至恒重，即得鸦葱总黄酮。精密称定各批次经干燥至恒重的鸦葱总黄酮0.0020g，60％乙醇超声溶解并定容于10mL容量瓶中，摇匀后备用；

2)参照物溶液的制备

精密称定干燥至恒重的鸦葱黄酮苷A对照品0.0020g，用60％乙醇定容于10mL容量瓶中，摇匀后备用；

3)制作鸦葱总黄酮指纹图谱

色谱条件为：Phenomenex Gemini 5μm C18110A，250mm×4.6mm，5μm色谱柱；流动相A为色谱乙腈，B为0.1％甲酸-水；流速0.8mL·min^-1；柱温30℃；检测波长337nm；进样量10μL。梯度洗脱程序：0.01～7.00min，97％～86％B；7.01～30.00min，86％～83％B；30.01～60.00min，83％～65％B；60.01～65.00min，65％～0％B。分别精密吸取供试液溶液和参照物溶液，在以上色谱条件下经高效液相色谱仪分离检测，得到鸦葱总黄酮指纹图谱，见图3；

按相同色谱条件得参照物的图谱，见图4。

实施例3：鸦葱总黄酮标准指纹图谱

鸦葱药材共12批，均采集于吉林省伊通。按本发明实施例1及2所述方法得到各批次鸦葱总黄酮指纹图谱，使用国家药典委员会的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件分析，得到鸦葱总黄酮标准指纹图谱，确定了14个共有特征峰，见图3。

第5号色谱峰对应鸦葱黄酮苷A，图谱总长度为65min，5号峰平均保留时间为32.17min，以5号峰为参照峰，计算特征峰的相对保留时间和相对峰面积，平均相对保留时间和相对峰面积如下：

1号峰，平均相对保留时间为0.7942，平均相对峰面积为0.3068；

2号峰，平均相对保留时间为0.8936，平均相对峰面积为0.3782；

3号峰，平均相对保留时间为0.9338，平均相对峰面积为1.4074；

4号峰，平均相对保留时间为0.9565，平均相对峰面积为0.4556；

5号峰，平均相对保留时间为1.0000，平均相对峰面积为1.0000；

6号峰，平均相对保留时间为1.0516，平均相对峰面积为0.5007；

7号峰，平均相对保留时间为1.1694，平均相对峰面积为0.0639；

8号峰，平均相对保留时间为1.2372，平均相对峰面积为0.3296；

9号峰，平均相对保留时间为1.2631，平均相对峰面积为0.0802；

10号峰，平均相对保留时间为1.5411，平均相对峰面积为0.0527；

11号峰，平均相对保留时间为1.5724，平均相对峰面积为0.5788；

12号峰，平均相对保留时间为1.5893，平均相对峰面积为0.0602；

13号峰，平均相对保留时间为1.6623，平均相对峰面积为0.2276；

14号峰，平均相对保留时间为1.7810，平均相对峰面积为0.0527。

Claims (4)

1.鸦葱总黄酮的制备方法，其特征在于采用溶剂浸泡法进行提取，利用特定的大孔树脂柱色谱制备鸦葱总黄酮；

所述方法包括如下步骤：

1)鸦葱全草用70％乙醇冷浸提取3次，每次7d，提取液过滤后浓缩除醇，过滤，经D101型大孔树脂柱吸附，水、60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱组分，减压回收乙醇，干燥，得鸦葱提取物；

2)将鸦葱提取物用水溶解，上样于D4020型大孔树脂柱色谱，先以5％乙醇除杂，再收集10％～30％乙醇洗脱的黄酮类成分组分，合并后减压回收溶剂，干燥至恒重，即得鸦葱总黄酮。

2.鸦葱总黄酮指纹图谱的建立方法，其特征在于将鸦葱总黄酮制成供试品溶液，经高效液相色谱仪分离检测，获得鸦葱的指纹图谱；

所述方法包括如下步骤：

1)供试品溶液的制备：取鸦葱总黄酮，60％乙醇超声溶解并定容，作为供试品溶液；

2)参照物溶液的制备：取鸦葱黄酮苷A对照品，60％乙醇超声溶解并定容，作为参照物溶液；

3)制作鸦葱总黄酮指纹图谱：分别精密吸取供试液溶液和参照物溶液，经高效液相色谱仪分离检测，其中，流动相的组成为乙腈-0.1％甲酸水溶液；采用梯度洗脱；得到鸦葱总黄酮指纹图谱。

3.如权利要求2所述的鸦葱总黄酮指纹图谱的建立方法，其特征在于所述的高效液相色谱仪分离检测条件为：色谱柱为，Phenomenex Gemini 5μm C18 110A，250mm×4.6mm，5μm色谱柱；流动相A为色谱乙腈，B为0.1％甲酸-水；流速0.8mL·min^-1；柱温30℃；检测波长337nm；进样量10μL，梯度洗脱程序：0.01～7.00min，97％～86％B；7.01～30.00min，86％～83％B；30.01～60.00min，83％～65％B；60.01～65.00min，65％～0％B。

4.由权利2至3中所述的鸦葱总黄酮指纹图谱的建立方法得到的鸦葱总黄酮标准指纹图谱，其特征在于：图谱总长度为65min，有14个特征峰，第5号色谱峰对应鸦葱黄酮苷A，5号峰平均保留时间为32.17min，以5号峰为参照峰，计算特征峰的相对保留时间和相对峰面积，平均相对保留时间和相对峰面积如下：

1号峰，平均相对保留时间为0.7942，平均相对峰面积为0.3068；

2号峰，平均相对保留时间为0.8936，平均相对峰面积为0.3782；

3号峰，平均相对保留时间为0.9338，平均相对峰面积为1.4074；

4号峰，平均相对保留时间为0.9565，平均相对峰面积为0.4556；

5号峰，平均相对保留时间为1.0000，平均相对峰面积为1.0000；

6号峰，平均相对保留时间为1.0516，平均相对峰面积为0.5007；

7号峰，平均相对保留时间为1.1694，平均相对峰面积为0.0639；

8号峰，平均相对保留时间为1.2372，平均相对峰面积为0.3296；

9号峰，平均相对保留时间为1.2631，平均相对峰面积为0.0802；

10号峰，平均相对保留时间为1.5411，平均相对峰面积为0.0527；

11号峰，平均相对保留时间为1.5724，平均相对峰面积为0.5788；

12号峰，平均相对保留时间为1.5893，平均相对峰面积为0.0602；

13号峰，平均相对保留时间为1.6623，平均相对峰面积为0.2276；

14号峰，平均相对保留时间为1.7810，平均相对峰面积为0.0527。