CN113466385A - 垫状卷柏总黄酮提取制备及hplc指纹图谱检测方法 - Google Patents
垫状卷柏总黄酮提取制备及hplc指纹图谱检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本技术方案首次公开了一种垫状卷柏药材采用70％甲酸溶剂热回流提取制备总黄酮的方法以及HPLC指纹图谱检测方法，本发明方法制备的总黄酮含量高，建立的指纹图谱具有丰富的指纹特征信息，方法简便、重现性好、准确可靠，可有效鉴别垫状卷柏药材及其混淆品，为垫状卷柏的鉴别和全面质量控制提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药材总黄酮提取制备及HPLC指纹图谱检测方法，更具体的说是垫状卷柏总黄酮提取制备以及垫状卷柏药材指纹图谱的质量控制方法，属于中药技术领域。
背景技术
垫状卷柏为卷柏科植物垫状卷柏Selaginella pulvinata（Hook，etGrev.）Maxim.的干燥全草。全年均可采收，除去须根和泥沙，晒干。卷柏为卷柏科植物卷柏的干燥全草。全年均可采收，除去须根和泥沙，晒干。现行国家标准如下：
【性状】垫状卷柏 须根多散生。中叶（腹叶）两行，卵状披针形，直向上排列。叶片左右两侧不等，内缘较平直，外缘常因内折而加厚，呈全缘状。
【鉴别】（1）本品粉末绿色至黄褐色。叶缘细胞狭长，向外突出呈齿状或长毛状。叶表皮细胞类方形或类长方形，垂周壁近平直，气孔不定式，多同向排列。孢子棕黄色或红棕色，类圆形或类三角形，直径17～77μm，表面具不规则瘤状突起。管胞为梯纹。
（2）取本品粉末2g，加甲醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇3ml使溶解，作为供试品溶液。另取卷柏对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异丙醇-浓氨试液-水（13:1:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝甲醇溶液，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
【检查】 水分不得过10.0%。
【含量测定】 照高效液相色谱法（《中国药典》2020年版通则0512）测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为330nm。理论板数按穗花杉双黄酮峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备 取穗花杉双黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流5小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，含穗花杉双黄酮（C30H18O10）不得少于0.30%。
【炮制】 垫状卷柏除去残留须根及杂质，洗净，切段，干燥。
【性状】 本品呈卷缩的段状，枝扁而有分枝，绿色或棕黄色，向内卷曲，枝上密生鳞片状小叶。叶先端具长芒。中叶（腹叶）两行，卵状矩圆形或卵状披针形，斜向或直向上排列，叶缘膜质，有不整齐的细锯齿或全缘；背叶（侧叶）背面的膜质边缘常呈棕黑色。气微，味淡。
【鉴别】【检查】【含量测定】同药材
【性味与归经】辛，平。归肝、心经。
【功能与主治】活血通经。用于经闭痛经，癥瘕痞块，跌扑损伤。垫状卷柏炭化瘀止血。用于吐血，崩漏，便血，脱肛。
【用法与用量】5～10g。
【注意】孕妇慎用。
【贮藏】置干燥处。
中药中总黄酮的现有方法是用溶剂法提取黄酮类化合物，传统的方法包括冷浸法、渗漉法、回流法和煎煮法等；近年来超声提取法、微波提取法、酶辅助提取法等研究较多。新方法可提高黄酮的提取率,缩短提取时间，减少能耗和药材用量。另外，根据所测定样品的入药部位、培养基质以及药用辅料等因素，粉碎、提取、净化等方法相结合,用正交试验优选出最佳提取艺条件。碱性水溶液提取法，黄酮含量较低，原因可能是黄酮类化合物与钙结合成不溶性物质，不被溶出。此外，此法虽然经济，但污染严重，对生态环境会造成负面影响。水提法总黄酮含量虽有所提高，但提取液存放易腐败变质，后续的过漉、干燥等很费时间，原因是由于用水作提取溶剂，易把蛋白质、糖等易溶于水的成分浸提出来，因此易霉变。根据被提取物的极件及杂质特点来选择适合的提取溶剂。一般常用不同浓度的甲醇、乙醇作为提取溶剂。
现有技术关于垫状卷柏药材的HPLC指纹图谱的建立都未见报道，相关同类技术特征色谱峰较少，检测限过低。本次实验采用了与以往常规提取溶剂不同的70%甲酸进行加热回流的方式对垫状卷柏药材中的成分进行提取，提取液过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，过微孔滤膜，进一步建立HPLC指纹图谱，该指纹图谱可有效识别垫状卷柏中的特征成分，方法稳定，辨识度高，该技术为垫状卷柏药材等含有垫状卷柏的相关药品或食品提供了一种良好的检测手段，对于其相关质量标准的建立有很好的贡献。
大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以有选择地通过物理吸附水溶液中的有机物，是20世纪60年代发展起来的新型有机高聚物吸附剂，已在环保、食品、医药等领域得到了广泛的应用。大孔树脂型号不同，分离纯化性能也不同。
JHE8水合镁铝硅酸盐是利用天然非金属矿-水合镁铝硅酸盐经过科学配方和按照特殊工艺加工制成的一种高效脱色产品，具有独特的三维空间链式结构，以及特殊的针、棒纤维状晶体形态，其独特的结构赋予了产品特殊的物理化学性质，具有较高的脱色性能、吸附性能、悬浮性能、粘接性能等，且属全天然矿物，可自然降解，无毒无害，无刺激性，对环境无污染，产品广泛用于医药行业、酿造工业、食品工业、油脂工业、化学工业等。
发明内容
本发明在于提供一种中药材总黄酮提取制备及HPLC指纹图谱检测方法，更具体的说是垫状卷柏总黄酮提取制备以及垫状卷柏药材指纹图谱的质量控制方法，以及提取溶剂、提取方式对垫状卷柏药材影响的研究。为实现此目的，本发明通过对垫状卷柏药材高效液相色谱指纹图谱的研究，提出了一种更好的垫状卷柏药材质量控制方法，弥补了现有质量控制技术的不足，使垫状卷柏药材的质量控制更加完善和科学。本发明是通过如下技术方案实现的：
一种中药总黄酮提取制备方法，其特征在于：中药用70%甲酸进行热回流提取，提取液滤过，过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，即得总黄酮提取物。
一种卷柏或垫状卷柏总黄酮提取制备方法，其特征在于：卷柏或垫状卷柏用70%甲酸进行热回流提取，提取液滤过，过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，即得卷柏或垫状卷柏总黄酮提取物。
一种卷柏或垫状卷柏总黄酮提取制备方法，其特征在于：总黄酮提取物中同时含有穗花杉双黄酮等11个特征成分，具体检测条件如下：采用高效液相色谱法进行测定，色谱条件为：在0~23分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由6:94梯度增加至8:92，在23~60分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由8:92梯度增加至50:50，在60~65分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由50:50梯度减少至6:94，在65~75分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比保持6:94，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长为270nm；所述指纹图谱中有11个共有峰，编号依次为1~11：共有峰的峰号（相对保留时间）为：1（0.106），2（0.199），3（0.261），4（0.283），5（0.388），6（0.488），7（0.530），8（0.587），9（0.622），10（0.978），11（1.000）；峰11为穗花杉双黄酮。
一种卷柏或垫状卷柏总黄酮提取制备方法，其特征在于：总黄酮提取物中总黄酮含量大于60%。
垫状卷柏HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于可以同时检测11个特征成分，具体按如下步骤检测：
（1）称取垫状卷柏药材1g，加70%甲酸50ml，加热回流提取60分钟，提取液用0.22μm~0.45μm的微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；称取穗花杉双黄酮对照品适量，加甲醇溶解，作为对照品溶液。
（2）采用高效液相色谱法进行测定，色谱条件为：在0~23分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由6:94梯度增加至8:92，在23~60分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由8:92梯度增加至50:50，在60~65分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由50:50梯度减少至6：94，在65~75分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比保持6:94，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长为270nm。
（3）所述指纹图谱中有11个共有峰，编号依次为1~11：共有峰的峰号（相对保留时间）为：1（0.106），2（0.199），3（0.261），4（0.283），5（0.388），6（0.488），7（0.530），8（0.587），9（0.622），10（0.978），11（1.000）；峰11为穗花杉双黄酮。
垫状卷柏HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于供试品溶液的制备方法为：垫状卷柏用70%甲酸进行热回流提取，提取液滤过，过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
垫状卷柏HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于供试品溶液的制备方法为：垫状卷柏用70%甲酸进行热回流提取，提取液滤过，过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂富集，微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
详细说明如下：
本技术方案的第一个目的是提供一种垫状卷柏药材HPLC指纹图谱的建立方法，所述方法包括以下步骤：
（1）制备对照品溶液：精密配制穗花杉双黄酮对照品溶液；
（2）制备供试品溶液：精密称取垫状卷柏药材，用70%甲酸加热回流进行提取；
（3）提取液过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色；
（4）再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70%乙醇洗脱；
（5）收集70%乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥；
（6）采用高效液相色谱法进行测定得到指纹图谱，其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱；紫外检测波长：270nm检测。
根据本技术方案一个优选的实施方式，可选用具有代表性的三种溶剂进行上述步骤所述的提取，如：70%甲酸、70%甲醇、水，优选提取溶剂为70%甲酸；可选用具有代表性的两种提取方式进行上述步骤所述的提取，如：加热回流提取、超声提取方式为加热回流提取。
以下具体描述以上各步骤。
（1）对照品溶液的制备：
穗花杉双黄酮对照品溶液的制备：精密称取穗花杉双黄酮对照品适量，用甲醇配制成每1ml含穗花杉双黄酮80~200µg的溶液；
（2）供试品溶液的制备：精密称取垫状卷柏药材粉末1~10g，70%甲酸提取，加热回流提取，提取时间为60~90min，提取时间优选为60min，提取液过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，用微孔滤膜（孔径0.22~0.45μm，优选为0.45μm）过滤，即得供试品溶液；
（3）高效液相色谱仪自动进样器进样5~20μl，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱，其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料：采用梯度洗脱，梯度洗脱的流动相为乙腈（A）一0.2%甲酸（B）梯度洗脱；梯度洗脱时间为75min，流速0.8~1.2ml /min；柱温28~32 ℃；检测波长：250nm~280nm，优选270nm；
根据本技术方案一个优选的实施方式，在步骤（3）中，所述的梯度洗脱，梯度洗脱程序以如以下浓度配制进行：洗脱程序为：在0~23分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由6:94梯度增加至8:92，在23~60分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由8:92梯度增加至50:50，在60~65分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由50:50梯度减少至6:94，在65~75分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比保持6:94。
根据本技术方案一个特别优选的实施方式，本技术方案检测方法可以通过下述步骤实施：（1）取穗花杉双黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含100μg的溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤即得。（2）供试品溶液的制备：分别以70%甲酸和70%甲醇作为提取溶剂。取本品粉末0 .5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入提取溶剂25ml，密塞，称定重量，加热回流 60分钟，放冷，再称定重量，分别用提取溶剂补足减失的重量，提取液过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
（3）色谱条件：Waters Atlantis T3 C18色谱柱（4.6mm*250mm，5μm），流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸（B）梯度洗脱，洗脱程序为：在0~23分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由6:94梯度增加至8:92，在23~60分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由8:92梯度增加至50:50，在60~65分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由50:50梯度减少至6:94，在65~75分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比保持6:94，流速为每分钟1.0ml，进样量10μl，柱温30℃，检测波长270nm，检测时间75min。
本技术方案的第二个目的是提供按照本发明HPLC指纹图谱的建立方法所得到的垫状卷柏药材70%甲酸作提取溶剂的标准指纹图谱，指纹图谱中有11个共有峰，编号依次为1-11。以峰11为S峰，这些共有特征峰构成了垫状卷柏药材的指纹图谱，可作为垫状卷柏药材的标准指纹图谱。共有峰的峰号（相对保留时间）为：1（0.106），2（0.199），3（0.261），4（0.283），5（0.388），6（0.488），7（0.530），8（0.587），9（0.622），10（0.978），11（S）（1.000）；峰11为穗花杉双黄酮。
本技术方案将药材用70%甲酸进行热回流提取，可以有效的增加指纹图谱的信息量，提高其指纹鉴定能力，以实现指纹图谱的全面和整体评价。本技术方案为以垫状卷柏为例，建立以70%甲酸为提取溶剂加热回流为提取方式的指纹图谱，该方法可有效鉴别垫状卷柏药材的混淆品及假冒伪劣品，为垫状卷柏及其相关制品的鉴别和全面质量控制提供依据。
本技术方案方法具有如下显著的优点和用途：
（a）将药材采用70%甲酸进行热回流提取后，可明显的增加指纹图谱特征峰的数目，增大特征峰的面积，使指纹图谱的信息量增多，辨识度更高，可更加有效的提高指纹鉴定能力，以实现指纹图谱的全面和整体评价；
（b）供试品制作简便，分析时间较短，色谱条件容易实现；
（c）方法稳定性、简便、稳定、精度高、重现性好；
（d）有效表征了垫状卷柏药材的质量，适于对垫状卷柏药材真伪和品质的鉴别与控制。
因此本技术方案的第三个目的是提供一种中药总黄酮的制备方法，所述方法包括以下步骤：
（1）中药用70%甲酸进行热回流提取，提取液滤过；
（2）提取液过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色；
（3）再用X-5大孔吸附树脂吸附，先用水洗脱，再用70%乙醇洗脱；
（4）收集70%乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，即得总黄酮提取物。
为本方法提供一种优选的方式，其特征在于：卷柏或垫状卷柏用70%甲酸进行热回流提取，提取液滤过，过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，即得卷柏或垫状卷柏总黄酮提取物。
附图说明
图1 垫状卷柏药材70%甲酸热回流HPLC指纹图谱及色谱峰的标定
图2 垫状卷柏药材70%甲醇热回流HPLC指纹图谱及色谱峰的标定
图3 垫状卷柏药材水热回流HPLC指纹图谱
图4 垫状卷柏药材70%甲酸超声HPLC指纹图谱及色谱峰的标定
具体实施方式
下面通过实施例及其附图详细阐述本发明的技术方案，所例举的实施例及附图对本发明没有限制。
实施例1：垫状卷柏药材70%甲酸热回流指纹图谱的建立
实验仪器与材料
药材：垫状卷柏药材；
仪器：Thermo Ultimate3000高效液相色谱仪（四元梯度泵；柱温箱；DAD检测器；自动进样器：Chromeleon色谱数据系统）；METTLER TOLEDO AL204-S电子天平；
试剂：穗花杉双黄酮标准品（中国食品药品检定研究院，批号为：批号111902-201603），乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。
高效液相色谱
色谱条件：色谱柱 Waters Atlantis T3 C18(4.6x250mm,5µm)、流动相为乙腈:0.2%甲酸，按下表进行梯度洗脱、柱温30℃、流速为每分钟1.0ml、检测波长270nm。
表 洗脱梯度
| 时间/min | 乙腈/% | 0.2%磷酸/% |
| 0 | 6 | 94 |
| 23 | 8 | 92 |
| 60 | 50 | 50 |
| 65 | 6 | 94 |
| 75 | 6 | 94 |
对照品溶液的制备：称取穗花杉双黄酮适量，配成每1ml含140.03µg的溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，粉碎，取1.0023g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%甲酸50ml，称定重量，加热回流60min，放冷，称定重量，用70%甲酸补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
结果显示，该方法建立的指纹图谱色谱峰数量较多，峰型良好，色谱图见图1。
实施例2：垫状卷柏药材70%甲醇热回流指纹图谱
实验仪器与材料
药材：垫状卷柏药材；
仪器：Thermo Ultimate3000高效液相色谱仪（四元梯度泵；柱温箱；DAD检测器；自动进样器：Chromeleon色谱数据系统）；METTLER TOLEDO AL204-S电子天平；
试剂：穗花杉双黄酮标准品（中国食品药品检定研究院，批号为：批号111902-201603），乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。
高效液相色谱
色谱条件：色谱柱 Waters Atlantis T3 C18(4.6x250mm,5µm)、流动相为乙腈:0.2%甲酸，按下表进行梯度洗脱、柱温30℃、流速为每分钟1.0ml、检测波长270nm。
表 洗脱梯度
| 时间/min | 乙腈/% | 0.2%磷酸/% |
| 0 | 6 | 94 |
| 23 | 8 | 92 |
| 60 | 50 | 50 |
| 65 | 6 | 94 |
| 75 | 6 | 94 |
对照品溶液的制备：称取穗花杉双黄酮适量，配成每1ml含140.03µg的溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，粉碎，取1.0023g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇50ml，称定重量，加热回流60min，放冷，称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
结果显示，70%甲醇热回流提取得到的指纹图谱，色谱峰数量较少，峰面积较小，不易辨识，且峰型不好，色谱图见图2。
实施例3：垫状卷柏药材水热回流指纹图谱
实验仪器与材料
药材：垫状卷柏药材；
仪器：Thermo Ultimate3000高效液相色谱仪（四元梯度泵；柱温箱；DAD检测器；自动进样器：Chromeleon色谱数据系统）；METTLER TOLEDO AL204-S电子天平；
试剂：穗花杉双黄酮标准品（中国食品药品检定研究院，批号为：批号111902-201603），乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。
高效液相色谱
色谱条件：色谱柱 Waters Atlantis T3 C18(4.6x250mm,5µm)、流动相为乙腈:0.2%甲酸，按下表进行梯度洗脱、柱温30℃、流速为每分钟1.0ml、检测波长270nm。
表 洗脱梯度
| 时间/min | 乙腈/% | 0.2%磷酸/% |
| 0 | 6 | 94 |
| 23 | 8 | 92 |
| 60 | 50 | 50 |
| 65 | 6 | 94 |
| 75 | 6 | 94 |
对照品溶液的制备：称取穗花杉双黄酮适量，配成每1ml含140.03µg的溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，粉碎，取1.0023g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入水50ml，称定重量，加热回流60min，放冷，称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
结果显示，用水加热回流提取得到的指纹图谱，色谱峰面积太小，色谱峰无法标识，色谱图见图3。
实施例4：垫状卷柏药材70%甲酸超声指纹图谱
实验仪器与材料
药材：垫状卷柏药材；
仪器：Thermo Ultimate3000高效液相色谱仪（四元梯度泵；柱温箱；DAD检测器；自动进样器：Chromeleon色谱数据系统）；METTLER TOLEDO AL204-S电子天平；
试剂：穗花杉双黄酮标准品（中国食品药品检定研究院，批号为：批号111902-201603），乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。
高效液相色谱
色谱条件：色谱柱 Waters Atlantis T3 C18(4.6x250mm,5µm)、流动相为乙腈:0.2%甲酸，按下表进行梯度洗脱、柱温30℃、流速为每分钟1.0ml、检测波长270nm。
表 洗脱梯度
| 时间/min | 乙腈/% | 0.2%磷酸/% |
| 0 | 6 | 94 |
| 23 | 8 | 92 |
| 60 | 50 | 50 |
| 65 | 6 | 94 |
| 75 | 6 | 94 |
对照品溶液的制备：称取穗花杉双黄酮适量，配成每1ml含140.03µg的溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，粉碎，取1.0023g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%甲酸50ml，称定重量，超声60min，放冷，称定重量，用70%甲酸补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
结果显示，用70%甲酸超声提取得到的指纹图谱，色谱峰数量较少，峰面积较小，不易辨识，且峰型不好，色谱图见图4。
实施例5：垫状卷柏药材总黄酮提取制备及检测方法的建立
实验仪器与材料
药材：垫状卷柏药材；
仪器：Thermo Ultimate3000高效液相色谱仪（四元梯度泵；柱温箱；DAD检测器；自动进样器：Chromeleon色谱数据系统）；METTLER TOLEDO AL204-S电子天平；
试剂：穗花杉双黄酮标准品（中国食品药品检定研究院，批号为：批号111902-201603），乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。
高效液相色谱
色谱条件：色谱柱 Waters Atlantis T3 C18(4.6x250mm,5µm)、流动相为乙腈:0.2%甲酸，按下表进行梯度洗脱、柱温30℃、流速为每分钟1.0ml、检测波长270nm。
表 洗脱梯度
| 时间/min | 乙腈/% | 0.2%磷酸/% |
| 0 | 6 | 94 |
| 23 | 8 | 92 |
| 60 | 50 | 50 |
| 65 | 6 | 94 |
| 75 | 6 | 94 |
对照品溶液的制备：称取穗花杉双黄酮适量，配成每1ml含140.03µg的溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，粉碎，取10.0056g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70%甲酸50ml，称定重量，加热回流60min，放冷，称定重量，用70%甲酸补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，得到总黄酮提取物。称取该总黄酮提取物0.1g，用10ml甲醇溶解，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
测得的结果显示，经过该方法处理所得到的垫状卷柏总黄酮提取物中总黄酮含量大于60%。且该方法下所得的图谱显示包括穗花杉双黄酮在内的11个特征成分，辨识度极高。
实施例6：垫状卷柏总黄酮提取制备
垫状卷柏用70%甲酸进行热回流提取，提取液滤过，过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，即得垫状卷柏总黄酮提取物。
采用高效液相色谱法进行测定可检测到11个特征成分，色谱条件为：在0~23分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由6:94梯度增加至8:92，在23~60分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由8:92梯度增加至50:50，在60~65分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由50:50梯度减少至6:94，在65~75分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比保持6:94，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长为270nm；所述指纹图谱中有11个共有峰，编号依次为1~11：共有峰的峰号（相对保留时间）为：1（0.106），2（0.199），3（0.261），4（0.283），5（0.388），6（0.488），7（0.530），8（0.587），9（0.622），10（0.978），11（1.000）；峰11为穗花杉双黄酮。
含量测定结果表明，垫状卷柏总黄酮提取物中总黄酮含量65%。
实施例7：卷柏总黄酮提取制备
卷柏用70%甲酸进行热回流提取，提取液滤过，过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，即得卷柏总黄酮提取物。
采用高效液相色谱法进行测定可检测到11个特征成分，色谱条件为：在0~23分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由6:94梯度增加至8:92，在23~60分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由8:92梯度增加至50:50，在60~65分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比由50:50梯度减少至6:94，在65~75分钟内，流动相乙腈-0.2%甲酸溶液的体积比保持6:94，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长为270nm；所述指纹图谱中有11个共有峰，编号依次为1~11：共有峰的峰号（相对保留时间）为：1（0.106），2（0.199），3（0.261），4（0.283），5（0.388），6（0.488），7（0.530），8（0.587），9（0.622），10（0.978），11（1.000）；峰11为穗花杉双黄酮。
含量测定结果表明，垫状卷柏总黄酮提取物中总黄酮含量70%。
Claims (7)
1.一种中药总黄酮提取制备方法，其特征在于：中药用70％甲酸进行热回流提取，提取液滤过，过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，即得总黄酮提取物。
2.一种卷柏或垫状卷柏总黄酮提取制备方法，其特征在于：卷柏或垫状卷柏用70％甲酸进行热回流提取，提取液滤过，过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂吸附，用水洗脱，再用70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收溶剂，浓缩干燥，即得卷柏或垫状卷柏总黄酮提取物。
3.根据权利要求2所述一种卷柏或垫状卷柏总黄酮提取制备方法，其特征在于：总黄酮提取物中同时含有穗花杉双黄酮等11个特征成分，具体检测条件如下：采用高效液相色谱法进行测定，色谱条件为：在0～23分钟内，流动相乙腈-0.2％甲酸溶液的体积比由6:94梯度增加至8:92，在23～60分钟内，流动相乙腈-0.2％甲酸溶液的体积比由8:92梯度增加至50:50，在60～65分钟内，流动相乙腈-0.2％甲酸溶液的体积比由50:50梯度减少至6:94，在65～75分钟内，流动相乙腈-0.2％甲酸溶液的体积比保持6:94，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长为270nm；所述指纹图谱中有11个共有峰，编号依次为1～11：共有峰的峰号(相对保留时间)为：1(0.106)，2(0.199)，3(0.261)，4(0.283)，5(0.388)，6(0.488)，7(0.530)，8(0.587)，9(0.622)，10(0.978)，11(1.000)；峰11为穗花杉双黄酮。
4.根据权利要求2所述一种卷柏或垫状卷柏总黄酮提取制备方法，其特征在于：总黄酮提取物中总黄酮含量大于60％。
5.垫状卷柏HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于可以同时检测11个特征成分，具体按如下步骤检测：
(1)称取垫状卷柏药材1g，加70％甲酸50ml，加热回流提取60分钟，提取液用0.22μm～0.45μm的微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；称取穗花杉双黄酮对照品适量，加甲醇溶解，作为对照品溶液；
(2)采用高效液相色谱法进行测定，色谱条件为：在0～23分钟内，流动相乙腈-0.2％甲酸溶液的体积比由6:94梯度增加至8:92，在23～60分钟内，流动相乙腈-0.2％甲酸溶液的体积比由8:92梯度增加至50:50，在60～65分钟内，流动相乙腈-0.2％甲酸溶液的体积比由50:50梯度减少至6:94，在65～75分钟内，流动相乙腈-0.2％甲酸溶液的体积比保持6:94，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长为270nm；
(3)所述指纹图谱中有11个共有峰，编号依次为1～11：共有峰的峰号(相对保留时间)为：1(0.106)，2(0.199)，3(0.261)，4(0.283)，5(0.388)，6(0.488)，7(0.530)，8(0.587)，9(0.622)，10(0.978)，11(1.000)；峰11为穗花杉双黄酮。
6.垫状卷柏HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于供试品溶液的制备方法为：垫状卷柏用70％甲酸进行热回流提取，提取液滤过，过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
7.垫状卷柏HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于供试品溶液的制备方法为：垫状卷柏用70％甲酸进行热回流提取，提取液滤过，过新型材料JHE8水合镁铝硅酸盐色谱柱脱色，再用X-5大孔吸附树脂富集，微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
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