CN110568120B - 基于双物质成分的桑寄生质量控制方法 - Google Patents

基于双物质成分的桑寄生质量控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于双物质成分的桑寄生质量控制方法。本发明是在同一色谱条件下，采用高效液相色谱双波长切换法同时测定桑寄生中的双物质成分含量，所述的双物质成分为槲皮苷和桑辛素；根据槲皮苷和桑辛素的含量检测结果：若检测结果为同时含有槲皮苷和桑辛素，则认定为桑树寄主的桑寄生，可直接作中药材使用；若检测结果为只含有槲皮苷而不含有桑辛素，则认定为非桑树寄主的桑寄生，需隔离做进一步检测确认是否为有毒寄主的桑寄生。本发明通过对桑寄生的固有成分及寄主植物特征性成分的含量测定，判定桑寄生的寄主是否为桑树，快速鉴定桑寄生的寄主来源，以此对桑寄生药材质量实施有效控制。

Description

基于双物质成分的桑寄生质量控制方法
技术领域
本发明涉及中药材的质量控制领域，具体涉及基于双物质成分的桑寄生质量控制方法。
背景技术
桑寄生是我国传统常用中药材，具有补肝肾，强筋骨，祛风湿，安胎元等功效，用于治疗风湿痹痛，腰膝酸软，筋骨无力，崩漏经多，妊娠漏血，胎动不安，头晕目眩等症。从《神农本草经》到《本草纲目》，历代本草医药书籍对桑寄生都有详实记载。现行《中国药典》(国家药典委员会，2015年版一部)桑寄生为桑寄生科植物桑寄生Taxillus chinensis(DC.)Danser干燥的带叶茎枝。
桑寄生属半寄生性植物药材，自然条件下其寄主植物具有复杂多样的生物学特征，《中药大辞典》记载桑寄生寄主植物有29科50多种，《中国植物志》记载桑寄生的寄主有桑树、桃树、李树、龙眼、荔枝、杨桃、油茶、油桐、橡胶树、榕树、木棉或马尾松、水松等多种植物。但现行《中国药典》桑寄生药材质量标准中除了要求不能检出强心苷和对药材槲皮素作定性检测外，对药材的寄主植物没有作明确的规范要求，也即是对多寄主植物来源的桑寄生，仅仅排除了含有强心苷成分的寄主植物。
对桑寄生寄主植物的本草学考证不难发现，历代本草桑寄生寄主植物除桑树外，还有槲、榉、柳、水杨、枫、桃等，寄主植物不同桑寄生的药性也不同，其中以桑树为寄主植物的桑寄生在历代本草中得到最广泛的使用和认同，甚至有认为除桑树外其它非桑树寄主植物来源的桑寄生会对人体有害，如《本草经集注》记载“桑上者，名桑上寄生尔；方家亦有用杨上、枫上者，则各其树名之，形类犹是一般，但根津所因处为异”。《证类本草》记载“今医家鲜用，此极误矣。今医者非不用也，盖以难得真桑上者。尝得真桑上寄生，下咽必验如神。向承乏吴山，有求药于诸邑者，乃通令搜摘，卒不可得，遂以实告，甚不药。盖不敢以伪药罔人。邻邑有人，伪以他木寄生送之，服之逾月而死，哀哉！”《本草纲目》记载“寄生高者二、三尺。其叶圆而微尖，厚而柔，面青而光泽，背紫淡而有茸。人言蜀桑多，时有生者，他处鲜得。须自采或连桑采者乃可用。世俗多以杂树上者充之，气性不同，恐反有害也。”同时《本草纲目》也记载了不同寄主来源的桑寄生其药性功效的不同，如桃寄生“气味苦，无毒，主治小儿中蛊毒，腹内坚痛，面目青黄，淋露骨立”。柳寄生“气味苦平，无毒，主治膈气刺痛”等。
可见，桑寄生本身无毒，但寄生在有毒寄主植物上的桑寄生则可能有毒。而《中国药典》仅仅排除含强心苷的寄主植物，对非强心苷有毒寄主植物没有排除，对桑寄生药材的寄主植物来源规定过于宽泛，造成桑寄生药材的寄主植物来源真可谓林林种种，五花八门，而复杂寄主植物来源对桑寄生药材的安全性、稳定性和有效性造成不同程度的影响，规范桑寄生药材的寄主来源是对桑寄生药材进行质量控制的重要措施，也是桑寄生中药现代化的必然要求。
发明内容
本发明是为了解决现有技术存在的上述技术问题，提供了桑寄生的质量控制方法，通过对桑寄生的固有成分及寄主植物特征性成分的含量测定，判定桑寄生的寄主植物是否为桑树，从而快速鉴定桑寄生药材的寄主植物来源，以此对桑寄生药材质量进行有效控制。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
基于双物质成分的桑寄生质量控制方法，包括如下步骤：
(1)在同一色谱条件下，采用高效液相色谱双波长切换法同时测定桑寄生中的双物质成分含量，所述的双物质成分为槲皮苷和桑辛素；
(2)根据槲皮苷和桑辛素的含量检测结果：若检测结果为同时含有槲皮苷和桑辛素，则认定为桑树寄主的桑寄生，可直接作中药材使用；若检测结果为只含有槲皮苷而不含有桑辛素，则认定为非桑树寄主的桑寄生，需隔离做进一步检测确认是否为有毒寄主的桑寄生。
进一步的，步骤(1)中，所述测定桑寄生中的双物质成分含量包括如下步骤：
S1、原料处理：采集桑寄生，阴干干燥后，于45-50℃烘2-3h，打粉并过药典4号筛，得到桑寄生粉末备用；
S2、混合对照品溶液的制备：称取槲皮苷标准品和桑辛素标准品，分别使用甲醇定容得到储备液，再将储备液混合定容，配置成混合对照品溶液，备用；
S3、桑寄生待测溶液制备：将步骤S1得到的桑寄生粉末用超声提取方法制备溶液，以甲醇作为提取溶剂，超声提取完成后放置室温，补足重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，得到桑寄生待测溶液，备用；
S4、标准曲线绘制：精密吸取步骤S2混合对照品溶液，进样，测定峰面积，以对照品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；
S5、双物质成分含量测定：取步骤S3得到的待测溶液，按照如下色谱条件测定槲皮苷和桑辛素的含量：流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸(C)，梯度洗脱(0-40min，18％A-72％A，28％C-82％C；40-55min，72％A-72％A，28％C-28％C)；检测波长采用双波长切换法：0-30min，256nm(槲皮苷)；30-55min，269nm(桑辛素)。
进一步的，步骤S3中，所述超声提取条件如下：甲醇质量浓度为80％，超声提取温度为30℃，超声提取时间为45min，超声料液比为1∶50。
进一步的，步骤S5中，所述色谱条件还包括：色谱柱为岛津-C18柱，色谱柱规格为5μm，4.6×250mm；流速为1.0mL/min；柱温为30±5℃；进样量为10μL。
进一步的，步骤S2的具体操作步骤如下：精密称取槲皮苷标准品8.39mg，桑辛素3.25mg分别置于5mL与100ml的容量瓶中，分别加入80％甲醇定容到刻度，即得1.678mg/mL槲皮苷、0.0325mg/mL桑辛素的单一对照品储备液，精密吸取上述储备液各1mL，均加入到同一10mL容量瓶中并用80％甲醇定容至刻度，即得每mL含槲皮苷0.1678mg、桑辛素0.00325mg的混合对照品溶液。
本发明具有以下技术效果：
本发明通过在同一色谱条件下，采用双波长切换法同时测定桑树寄主桑寄生中固有的有效成分槲皮苷及来源于寄主植物桑树特征性成分桑辛素的含量，就能快速、准确区分非桑树寄主来源的桑寄生，非桑树寄主的桑寄生可能来源于其他有毒寄主，寄生药材会含有有毒寄主成分，影响用药安全。本发明通过对桑寄生的槲皮苷和桑辛素含量的测定，能快速准确地将潜在有毒的非桑树寄主桑寄生区分出来，能更全面、准确的评价桑寄生的品质，从而确保了其临床疗效。
附图说明
图1为甲醇-0.1％磷酸梯度洗脱色谱图；
图2为甲醇-水梯度洗脱色谱图；
图3为乙腈-0.1％磷酸梯度洗脱色谱图；
图4为乙腈-水梯度洗脱色谱图；
图5为槲皮苷对照品HPLC色谱图；
图6为桑辛素对照品HPLC色谱图；
图7为混标对照品HPLC色谱图；
图8为桑枝(SZ-1)HPLC色谱图；
图9为桑树寄生(SJS-1)HPLC色谱图；
图10为夹竹桃枝(JZTZ-1)HPLC色谱图；
图11为夹竹桃寄主桑寄生(SJS-11)HPLC色谱图；
图12为油茶枝(YCZ-1)HPLC色谱图；
图13为油茶寄主桑寄生(SJS-12)HPLC色谱图；
附图中，峰1为槲皮苷、峰2为桑辛素。
具体实施方式
下面结合附图及具体的实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
基于双物质成分的桑寄生质量控制方法，包括如下步骤：
(1)在同一色谱条件下，采用高效液相色谱双波长切换法同时测定桑寄生中的双物质成分含量，所述的双物质成分为槲皮苷和桑辛素；
(2)根据槲皮苷和桑辛素的含量检测结果：若检测结果为同时含有槲皮苷和桑辛素，则认定为桑树寄主的桑寄生，可直接作中药材使用；若检测结果为只含有槲皮苷而不含有桑辛素，则认定为非桑树寄主的桑寄生，需隔离做进一步检测确认是否为有毒寄主的桑寄生。
所述测定桑寄生中的双物质成分含量包括如下步骤：
1实验药材、仪器和试剂
1.1实验药材
桑寄生药材均采自广西，经广西中医药大学药用植物教研室李永华研究员鉴定为桑寄生科植物桑寄生寄生Taxillus chinensis(DC.)Danser的带叶茎枝，其寄主植物分别来源于桑树、夹竹桃树和油茶树。桑寄生及其相关药材信息见表1-1。样品采用经过阴干干燥后，45℃烘3h后打粉过药典4号筛，备用。
表1-1实验样品信息表
Figure BDA0002237379310000051
1.2实验仪器
1260系列高效液相色谱仪器(美国安捷伦科技公司)；
waters e2695-2998/2489型高效液相色谱仪。
1.3实验试剂
甲醇(Fisher Scientific，色谱纯)、乙腈(Fisher Scientific，色谱纯)、磷酸(成都金山化学试剂有限公司，分析纯)；槲皮苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：11538-201606，纯度≥90.6％)；桑辛素对照品(成都麦德生科技有限公司，批号：RP190214，纯度：HPLC≥99％)。
2方法与结果
2.1样品提取条件的确定
2.1.1提取溶剂的确定
考察甲醇与乙醇提取槲皮苷得率，结果显示甲醇提取率相对较高，故选择甲醇为提取溶剂。
2.1.1.1甲醇浓度的确定
考察30％甲醇、50％甲醇、80％甲醇、100％甲醇4个不同浓度甲醇的槲皮苷含量，结果表明80％甲醇提取率相对较高，故选用80％甲醇为提取溶剂。
2.1.2提取时间的确定
考察不同提取时间30min、45min、60min对槲皮苷含量的影响，结果表明超声45min提取率相对较高，故选用超声时间为45min。
2.1.3料液比的确定
实验对比10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、不同80％甲醇用量对槲皮苷含量的影响，结果表明超声加入25ml提取率相对较高，故选用料液比为1∶50时即25ml最佳。
2.2正交试验
2.2.1正交表的选择
根据单因素考察结果，选择甲醇浓度、提取时间、料液比进行正交试验，每个因素设定3个水平。选用L9(34)表进行正交实验，因素水平表见表2-1，以槲皮苷提取率为考察指标。试验安排及方差分析见表2-2，表2-3。
表2-1因素水平表
Figure BDA0002237379310000061
表2-2正交试验设计与结果
Figure BDA0002237379310000062
Figure BDA0002237379310000071
表2-3方差分析表
Figure BDA0002237379310000072
.R方＝.954(调整R方＝.815)
由上表分析得，A因素对槲皮苷提取率有显著影响(P＜0.05)，各因素对槲皮苷提取率影响顺序为甲醇浓度＞料液比＞超声时间(A＞C＞B)，最优组合为A2B2C2即50倍量80％甲醇超声时间为45min。
验证试验：取SJS-1样品0.5g，按照最优提取工艺进行3次验证试验(n＝3)，结果槲皮苷提取率为2.29mg/g，RSD为1.03％，桑辛素提取率为0.00358mg/g，RSD为0.90％，证明该工艺稳定可行，见表2-4，表2-5。
表2-4验证性实验(SJS-1中槲皮苷)
Figure BDA0002237379310000081
表2-5验证性实验(SJS-1桑辛素)
Figure BDA0002237379310000082
2.3流动相的确定
选用甲醇-水、甲醇-0.1％磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸四个流动相系统进行梯度洗脱，如图1-4所示，通过比较目标峰的峰形与分离度，确定流动相为乙腈-0.1％磷酸目标峰分离度、对称性和峰形较好。
2.4色谱条件
色谱柱：岛津-C18柱(5μm，4.6×250mm)，流速：1.0mL/min，柱温：30±5℃，进样量10μL，流动相为：乙腈(A)-0.1％磷酸(C)，梯度洗脱(0-40min，18％A-72％A，28％C-82％C；40-55min，72％A-72％A，28％C-28％C)；检测波长采用双波长切换法：0-30min，256nm(槲皮苷)；30-55min，269nm(桑辛素)。
2.5对照品溶液的制备
精密称取槲皮苷标准品8.39mg，桑辛素3.25mg分别置于5mL与100ml的容量瓶中，加入80％甲醇定容到刻度，即得1.678mg/mL槲皮苷、0.0325mg/mL桑辛素的单一对照品储备液，精密吸取上述储备液各1mL，使用80％甲醇均定容到同一10mL容量瓶中，即得每mL含槲皮苷0.1678mg、桑辛素0.00325mg的混合对照品溶液。
2.6供试品溶液的制备
精密称定桑树寄主桑寄生(SJS-1)0.5g，精确到0.001g，置25ml的容量瓶中，加入80％甲醇25ml，称重后超声提取45min，取出放凉后补重，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过。
2.6.1标准曲线的绘制
精密吸取“2.5”项下混合对照品溶液，用80％甲醇稀释成槲皮苷质量浓度为5.034、12.585、20.975、41.95、83.90、135.20、167.80μg/ml，桑辛素质量浓度为0.0975、0.2438、0.4063、0.8125、1.625、2.60、3.25μg/ml的混合对照品溶液，取10μL进样，测定峰面积，以对照品溶液的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，结果见表2-6。表明槲皮苷、桑辛素在范围呈良好线性关系。
表2-6线性关系结果
Figure BDA0002237379310000091
2.6.2精密度试验
精密吸取“2.5”项下混合对照品溶液，在色谱条件下连续进6次，计算样品中槲皮苷的平均峰面积与桑辛素的平均峰面积，其中槲皮苷的RSD为0.18％，桑辛素RSD＝0.85％，即符合《中国药典》定量分析的要求。
2.6.3稳定性试验
取桑树寄主桑寄生(SJS-1)粉末6份，每份0.5g，精密称定，依照“2.6”项下的方法平行制备，按照“2.4”项下色谱条件，每隔5h进行一次含量测定，记录24h内供试品溶液中槲皮苷与桑辛素的含量，结果表明供试品溶液中槲皮苷与桑辛素在24h内保持稳定，槲皮苷RSD为0.89％，桑辛素RSD为1.75％。结果见表2-7，表2-8。
表2-7稳定性实验(SJS-1中槲皮苷)
Figure BDA0002237379310000092
表2-8稳定性试验(SJS-1中桑辛素)
Figure BDA0002237379310000101
2.6.4重复性试验
精密称取桑树寄主桑寄生(SJS-1)粉末6份，每份0.5g，精密称定，依照“2.6”项下的方法平行制备，按照“2.4”项下色谱条件，记录供试品溶液中槲皮苷与桑辛素的含量，槲皮苷RSD为0.64％，桑辛素RSD为2.86％，表明方法重复性良好，结果见表2-9，2-10。
表2-9重复性实验(SJS-1中槲皮苷)
Figure BDA0002237379310000102
表2-10重复性实验(SJS-1中桑辛素)
Figure BDA0002237379310000103
2.6.5加样回收试验
精密称取已知槲皮苷含量(2.29mg/g)、桑辛素含量(0.00306mg/g)含量的桑树寄主桑寄生(SJS-1)粉末6份，分别精密加入(0.175mg/ml)的槲皮苷3.24ml、0.00488mg/mL的桑辛素157μl，按照供试品溶液制备下，按照色谱条件进样，通过峰面积计算槲皮苷与桑辛素的含量，结果测得平均回收率槲皮苷为RSD为2.95％，桑辛素RSD为2.49％，表明方法重复性良好，结果见表2-11，2-12。
表2-11 SJS-1中槲皮苷加样回收试验结果(n＝6)
Figure BDA0002237379310000111
表2-12 SJS-1中桑辛素加样回收试验结果(n＝6)
Figure BDA0002237379310000112
2.6.6样品测定
取桑树寄主、夹竹桃寄主、油茶寄主、广西境内不同地区桑树寄主桑寄生及夹竹桃寄主、油茶寄主桑寄生，按照“2.6”项下方法提取供试品溶液并按照“2.4”项下色谱条件测定桑辛素和槲皮苷含量，结果见表2-13，2-14。
表2-13桑寄生及其寄主中槲皮苷的含量测定结果(n＝3)
Figure BDA0002237379310000121
表2-14桑寄生及其寄主中桑辛素的含量测定结果(n＝3)
Figure BDA0002237379310000131
从10批不同产地桑树寄主桑寄生(SJS-1～SJS-10)检测结果中可以看出，所有的桑树寄主的桑寄生均能检测得到槲皮苷和桑辛素。批次SJS-11为夹竹桃寄主桑寄生，其仅检测到槲皮苷而检测不到桑辛素；批次SJS-12为油茶寄主桑寄生，其仅检测到槲皮苷而检测不到桑辛素；从批次SZ-1、JTZZ-1、YCZ-1检测结果中可以看出，寄主桑树、夹竹桃、油茶等均不含槲皮苷，结果表明桑寄生中槲皮苷为桑寄生本身固有成分。
如图5-13所示，从图中可以看出，桑树寄主的桑寄生同时含有槲皮苷和桑辛素，而非桑树寄主如夹竹桃寄主、油茶寄主等的桑寄生只含槲皮苷而不含桑辛素，在团队的前期研究工作中发现，夹竹桃寄主桑寄生主要含有强心苷化学成分，油茶寄主桑寄生特有成分有待进一步研究，且不同寄主来源桑寄生表现出来的药理、药效、药性等均存在显著差异，以上实验结果表明寄主植物是影响桑寄生药材质量的关键。综上所述，本发明能准确分辨桑寄生的寄主是否为桑树，为桑寄生的临床安全用药提供了科学依据，本发明的质量控制方法是有效的。
虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限制本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.基于双物质成分的桑寄生质量控制方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以甲醇水溶液作为提取溶剂；在同一色谱条件下，采用高效液相色谱双波长切换法同时测定桑寄生中的双物质成分含量，所述的双物质成分为槲皮苷和桑辛素；所述双物质成分含量测定的色谱条件如下：流动相A为乙腈，流动相C为0.1%磷酸；梯度洗脱：0-40min，18%A-72%A，82%C-28%C；40-55 min，72%A-72%A，28%C-28%C ；检测波长采用双波长切换法：0-30min，256nm；30-55min，269nm；色谱柱为岛津-C18柱；
（2）根据槲皮苷和桑辛素的含量检测结果：若检测结果为同时含有槲皮苷和桑辛素，则认定为桑树寄主的桑寄生，可直接作中药材使用；若检测结果为只含有槲皮苷而不含有桑辛素，则认定为非桑树寄主的桑寄生，需隔离做进一步检测确认是否为有毒寄主的桑寄生；
所述桑寄生的寄主植物包括桑树、夹竹桃树和油茶树。
2.根据权利要求1所述的基于双物质成分的桑寄生质量控制方法，其特征在于，步骤（1）中，所述测定桑寄生中的双物质成分含量包括如下步骤：
S1、原料处理：采集桑寄生，阴干干燥后，于45-50℃烘2-3h，打粉并过药典4号筛，得到桑寄生粉末备用；
S2、混合对照品溶液的制备：称取槲皮苷标准品和桑辛素标准品，分别使用甲醇水溶液定容得到储备液，再将储备液混合定容，配置成混合对照品溶液，备用；
S3、桑寄生待测溶液制备：将步骤S1得到的桑寄生粉末用超声提取方法制备溶液，以甲醇水溶液作为提取溶剂，超声提取完成后放置至室温，补足重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，得到桑寄生待测溶液，备用；
S4、标准曲线绘制：精密吸取步骤S2混合对照品溶液，进样，测定峰面积，以对照品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；
S5、双物质成分含量测定：取步骤S3得到的待测溶液，按照如下色谱条件测定槲皮苷和桑辛素的含量：流动相A为乙腈，流动相C为0.1%磷酸；梯度洗脱：0-40min，18%A-72%A，82%C-28%C；40-55 min，72%A-72%A，28%C-28%C ；检测波长采用双波长切换法：0-30min，256nm；30-55min，269nm；色谱柱为岛津-C18柱。
3.根据权利要求2所述的基于双物质成分的桑寄生质量控制方法，其特征在于，步骤S3中，超声提取条件如下：所述甲醇水溶液的甲醇质量浓度为80%，超声提取温度为30℃，超声提取时间为45min，超声料液比为1：50， g/mL。
4.根据权利要求2所述的基于双物质成分的桑寄生质量控制方法，其特征在于，步骤S5中，所述色谱条件还包括：色谱柱规格为5µm，4.6×250 mm；流速为1.0 mL/min；柱温为 30±5℃；进样量为10μL。
5.根据权利要求2所述的基于双物质成分的桑寄生质量控制方法，其特征在于，步骤S2的具体操作步骤如下：精密称取槲皮苷标准品8.39mg置于5mL的容量瓶中，桑辛素标准品3.25mg置于100mL的容量瓶中，分别加入质量浓度为80%的甲醇水溶液定容至刻度，即得1.678mg/mL槲皮苷、0.0325mg/mL桑辛素的单一对照品储备液，精密吸取上述储备液各1mL，均置于同一10mL容量瓶中，再用质量浓度为80%的甲醇水溶液定容至刻度，即得每mL含槲皮苷0.1678mg、桑辛素0.00325mg的混合对照品溶液。
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