CN106932509B

CN106932509B - 芪葛颗粒指纹图谱及其构建方法

Info

Publication number: CN106932509B
Application number: CN201710017396.4A
Authority: CN
Inventors: 柯雪红; 李东晓; 黄可儿; 方志刚; 代汝伟; 秦书敏; 冯小权; 罗艳
Original assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
Current assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
Priority date: 2017-01-10
Filing date: 2017-01-10
Publication date: 2020-01-31
Anticipated expiration: 2037-01-10
Also published as: CN106932509A

Abstract

本发明公开了一种芪葛颗粒HPLC指纹图谱的建立方法。通过采用高效液相色谱进行梯度洗脱获得了芪葛颗粒共有模式的指纹图谱，分析芪葛颗粒指纹图谱信息共获得22个共有峰，以大豆苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，通过对照品比对的方法，鉴定了12个共有峰。本发明方法较为全面地反映芪葛颗粒中所含化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价，有效表征其质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，提高该药物临床使用的安全和有效。同时，本发明方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点。

Description

芪葛颗粒指纹图谱及其构建方法

技术领域

本发明涉及药物检测领域，具体涉及一种芪葛颗粒HPLC指纹图谱的构建方法及其指纹图谱。

背景技术

指纹图谱是一种国际公认用来控制中药或中药复方质量的有效手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。在一定条件下指纹图谱能全面反映中药或中药复方所含成分的相对量，从而使中药及中药复方的质控指标由单一成分的含量测定上升为对整体成分的质量控制，实现对中药及其复方制剂内在质量的综合评价和整体物质的全面控制，更具科学性和全面性。在中药的生产和流通中，中药产品质量控制主要通过单成分定量，并不能对产品的质量进行全面控制。因此建立一种综合评价中药质量的方法是必然趋势。

芪葛颗粒处方为临床经验方，由黄芪、葛根、陈皮药材组成，具有养胃健脾，益气生肌，解酒毒的功效，可用于预防治疗胃黏膜损伤、脾胃虚弱等疾病以及酒前酒后的保健作用。黄芪、葛根、陈皮所含化学成分组成复杂，个别成分的定性定量分析难以全面反映芪葛颗粒中所含化学成分的种类与数量，不能对芪葛颗粒质量进行整体描述和评价。为更有效地控制质量，确保制剂临床使用的安全、有效，本发明采用HPLC指纹图谱的研究方法对芪葛颗粒进行研究，用色谱指纹图谱相似度计算软件对得到的HPLC指纹图谱进行相似度计算，应用对照品对主要特征峰进行化学指认，并对复方化学成分指纹图谱色谱峰的归属进行了研究。该方法稳定性、精密度、重复性均符合要求，较全面反映了芪葛颗粒整体特征信息，为制剂质量评价提供了依据。

发明内容

本发明的目的在于公开一种芪葛颗粒HPLC指纹图谱的构建方法及其指纹图谱

一种芪葛颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

(1)制备混合对照品溶液；

(2)制备供试品溶液；

(3)利用HPLC法制作指纹图谱；所述HPLC法制作指纹图谱的条件是：色谱柱：依利特Hypersil ODS₂C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.1％柠檬酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱；洗脱程序为：0-20min，10％-25％(B)；20-45min，25％-35％(B)；45-50min，35％-37％(B)；50-55min，37％(B)；55-60min，37％-45％(B)；60-65min，45％-50％(B)；65-70min，50％-60％(B)；70-75min，60％-70％(B)；75-80min，70％-80％(B)；80-85min，80％-90％(B)；流速1.0mL/min；柱温30℃，进样量20μL；检测波长250nm。

优选的，芪葛颗粒由黄芪30份，葛根10份，陈皮5份煎煮制成。

优选的，制备混合对照品溶液的方法是：称取3’-羟基葛根素、葛根素、大豆苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、染料木苷、橙皮苷、大豆苷元、毛蕊异黄酮、染料木素、芒柄花素、川陈皮素、桔皮素12种对照品分别用甲醇溶解配制成储备液，精密吸取各对照品储备液适量，置于量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液。

优选的，制备的混合对照品溶液是：配制成浓度分别为3’-羟基葛根素0.129mg/mL、葛根素0.693mg/mL、大豆苷11.35μg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷22.80μg/mL、染料木苷56.25μg/mL、橙皮苷57.00μg/mL、大豆苷元10.45μg/mL、毛蕊异黄酮8.35μg/mL、染料木素5.25μg/mL、芒柄花素5.72μg/mL、川陈皮素7.90μg/mL、桔皮素4.10μg/mL的混合对照品溶液。

优选的，供试品溶液的制备方法是：精密称取芪葛颗粒样品1.0g，置于10mL量瓶中，加50％甲醇适量，超声处理30min，放冷，50％甲醇定容至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

一种芪葛颗粒HPLC指纹图谱特征在于，其特征峰为与3’-羟基葛根素对应的3号峰、与葛根素对应的5号峰、与大豆苷对应的9号峰、与毛蕊异黄酮葡萄糖苷对应的12号峰、与染料木苷13号峰、与橙皮苷对应的15号峰、与大豆苷元对应的17号峰、毛蕊异黄酮对应的18号峰、染料木素对应的19号峰、与芒柄花素对应的20号峰、与川陈皮素对应的21号峰、与桔皮素对应的22号峰，其相对保留时间分别为17.89、23.59、28.14、34.94、36.32、49.16、60.53、64.93、67.40、74.29、77.88、80.65，以9号峰大豆苷为参照峰。

优选的，特征峰还包括：相对保留时间为14.03的1号峰、相对保留时间为16.92的2号峰、相对保留时间为21.71的4号峰、相对保留时间为25.15的6号峰、相对保留时间为25.91的7号峰、相对保留时间为27.25的8号峰、相对保留时间为30.21的10号峰、相对保留时间为33.08的11号峰、相对保留时间为42.02的14号峰、相对保留时间为54.62的16号峰。

优选的，特征在于：图谱中12、18、20号峰来源于黄芪，1、2、3、5、7、8、9、13、14、16、17、19、20号峰来源葛根，15、21、22号峰来源于陈皮。

本发明的有益效果是：指纹图谱可以全面地反映药物所含化学成分的种类和数量，有效表征其质量，突破了中药复方质量控制模式的单一性和片面性，有利于其全面质量检测和整体质量的控制，有助于提高该药物临床使用安全性和有效性。同时，本发明所述芪葛颗粒指纹图谱的方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点。

附图说明

图1是本发明芪葛颗粒HPLC标准指纹图谱。

图2是精密度试验指纹图谱的叠加图。

图3是重复性试验指纹图谱的叠加图。

图4是稳定性试验指纹图谱的叠加图。

图5是本发明的10批芪葛颗粒样品的HPLC指纹图谱。

图6是本发明的芪葛颗粒指纹图谱与混合对照品色谱图，其中A为芪葛颗粒，B为混合标准品；3为3'-羟基葛根素峰，5为葛根素峰，9为大豆苷峰，12为毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰，13为染料木苷峰，15为橙皮苷峰，17为大豆苷元峰，18为毛蕊异黄酮峰，19为染料木素峰，20为芒柄花素峰，21为桔皮素峰，22为川陈皮素峰。

图7单味药材与芪葛颗粒样品色谱图，其中A为陈皮的峰，B为葛根的峰，C为黄芪的峰，D为芪葛颗粒的峰。

具体实施方式

通过下面具体实施例及其附图对本发明作进一步的详细描述，便于理解本发明的技术方案，但本发明的实施方式不限于此。

1.芪葛颗粒的制备：

(1)将黄芪、葛根、陈皮除杂洗净，然后加药材总重量12倍的水浸泡30min，武火煮开后，文火煎煮30min，倒出煎液，按照同样的方法煎煮3次，合并三次的水煎液，混合搅匀即可；

(2)将步骤(1)的水煎液浓缩至相对密度为1.3的浸膏，备用；

(3)测定步骤(2)中的浸膏重量，加入糖粉、糊精的混合物，其中浸膏、糖粉及糊精的的重量比为1:3:1，混匀并制成软材，过16目筛制粒，60℃真空干燥，即得。

2.色谱条件:

色谱柱：依利特Hypersil ODS2C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.1％柠檬酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱，洗脱程序为：0-20min，10％-25％(B)；20-45min，25％-35％(B)；45-50min，35％-37％(B)；50-55min，37％(B)；55-60min，37％-45％(B)；60-65min，45％-50％(B)；65-70min，50％-60％(B)；70-75min，60％-70％(B)；75-80min，70％-80％(B)；80-85min，80％-90％(B)；流速1.0mL/min；检测波长250nm；柱温30℃，进样量20μL。

3.方法与结果

3.1混合对照品溶液的制备

12种对照品分别用甲醇溶解配制成储备液，精密吸取各对照品适量，配制成浓度分别为3＇-羟基葛根素0.129mg/mL、葛根素0.693mg/mL、大豆苷11.35μg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷22.80μg/mL、染料木苷56.25μg/mL、橙皮苷57.00μg/mL、大豆苷元10.45μg/mL、毛蕊异黄酮8.35μg/mL、染料木素5.25μg/mL、芒柄花素5.72μg/mL、川陈皮素7.90μg/mL、桔皮素4.10μg/mL的混合对照品溶液。

3.2供试品溶液的制备

精密称取芪葛颗粒样品1.0g，置于10mL量瓶中，加50％甲醇适量，超声处理30min，放冷，50％甲醇定容至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

3.3标准指纹图谱的测定

精密吸取供试品溶液，按照步骤2项下色谱条件进行洗脱，记录谱图得到芪葛颗粒HPLC标准指纹图谱，见图1。

3.4方法学考察

3.4.1精密度试验取同一供试品，连续进样6次，记录色谱图，以大豆苷为参照峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果各峰相对保留时间的RSD均＜0.1％；相对峰面积的RSD均＜2.0％；采用中药色谱指纹图谱相似性评价软件进行处理，相似度均大于0.99，结果见图2，表明仪器精密度良好。

3.4.2重现性试验取同一批号芪葛颗粒样品，平行制备6份供试品溶液，进行测定，记录色谱图，以大豆苷为参照峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果各峰相对保留时间的RSD均＜0.5％；相对峰面积的RSD均＜3.5％；采用中药色谱指纹图谱相似性评价软件进行处理，相似度均大于0.99，结果见图3，说明方法重复性较好。

3.4.3稳定性试验取同一供试品，分别在0，2，4，8，12，24，48h进样，记录色谱图，以大豆苷为参照峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果各峰相对保留时间的RSD均＜0.5％；相对峰面积的RSD均＜3.0％；采用中药色谱指纹图谱相似性评价软件进行处理，相似度均大于0.99，结果见图4，表明供试品溶液在48h内保持稳定。

3.5指纹图谱的建立及特征峰的标定

3.5.1共有峰的确定

通过比较10批芪葛颗粒的色谱图，确定22个共有峰，通过对照品的比对，其中3号峰为3’-羟基葛根素、5号峰为葛根素、9号峰为大豆苷、12号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷、13号峰为染料木苷、15号峰为橙皮苷、17号峰为大豆苷元、18号峰为毛蕊异黄酮、19号峰为染料木素、20号峰为芒柄花素、21号峰为川陈皮素、22号峰为桔皮素。以9号峰大豆苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见图5、图6、表1-1、表1-2、表2-1、表2-2。

表1-1 10批芪葛颗粒指纹图谱共有峰相对保留时间

表1-2 10批芪葛颗粒指纹图谱共有峰相对保留时间(续表)

表2-1 10批芪葛颗粒指纹图谱共有峰相对峰面积

表2-2 10批芪葛颗粒指纹图谱共有峰相对峰面积(续表)

3.5.2.指纹图谱的相似度评价

应用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究(2004A)”对10批芪葛颗粒进行评价。本发明专利中的各共有峰与对照指纹图谱相对比相似度均大于0.90，说明10批指纹图谱的色谱峰整体上基本一致。结果见图5，表3。

表3 10批芪葛颗粒的相似度

4.芪葛颗粒HPLC指纹图谱成分来源分析

通过与处方中单味药材制备的样品图谱比较，结果显示芪葛颗粒HPLC指纹图谱中12、18、20号峰来源于黄芪，1、2、3、5、7、8、9、13、14、16、17、19、20号峰来源于葛根，15、21、22号峰来源于陈皮，结果见图7。

5.指纹图谱技术参数的确定

上述试验结果表明，以对照指纹图谱为参照计算相似度，10批芪葛颗粒HPLC指纹图谱相似度均在0.90以上,说明该测定方法稳定可靠，指纹图谱相对稳定，因此暂定芪葛颗粒HPLC指纹图谱标准为：供试品图谱应与对照指纹图谱一致，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。

综上所述，本发明建立的芪葛颗粒HPLC指纹图谱的检测方法，以大豆苷为参照峰，建立了一种芪葛颗粒HPLC指纹图谱，标定了22个共有峰。采用标准品比对的方法，对芪葛颗粒HPLC指纹图谱共有峰进行了分析研究，鉴定了3号峰(3’-羟基葛根素)、5号峰(葛根素)、9号峰(大豆苷)、12号峰(毛蕊异黄酮葡萄糖苷)、13号峰(染料木苷)、15号峰(橙皮苷)、17号峰(大豆苷元)、18号峰(毛蕊异黄酮)、19号峰(染料木素)、20号峰(芒柄花素)、21号峰(川陈皮素)、22号峰(桔皮素)12个共有峰，进一步阐明了芪葛颗粒的化学物质基础。

Claims

1.一种芪葛颗粒 HPLC 指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

（1）制备混合对照品溶液；

（2）制备芪葛颗粒供试品溶液；

（3）利用 HPLC 法制作指纹图谱；所述 HPLC 法制作指纹图谱的条件是：色谱柱：250mm×4.6mm，5μm的依利特Hypersil ODS2 C18 柱；流动相：以0.1%柠檬酸水溶液流动相A-以甲醇为流动相B，梯度洗脱；洗脱程序为：0-20min，10%→25% B；20-45min，25%→35% B；45-50min，35%→37% B；50-55min，37% B；55-60min，37%→45% B；60-65min，45%→50% B；65-70min，50%→60% B；70-75min，60%→70% B；75-80min，70%→80% B；80-85min，80%→90% B；

流速 1.0mL/min；柱温 30℃，进样量 20μL；检测波长250nm；

所述制备混合对照品溶液的方法是：称取 3’-羟基葛根素、葛根素、大豆苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、染料木苷、橙皮苷、大豆苷元、毛蕊异黄酮、染料木素、芒柄花素、川陈皮素、桔皮素12种对照品分别用甲醇溶解配制成储备液，精密吸取各对照品储备液适量，置于量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成混合对照品溶液；

所述供试品溶液的制备方法是：精密称取芪葛颗粒样品1.0g，置于10ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理30min，放冷，50%甲醇定容至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.根据权利要求 1 所述的芪葛颗粒 HPLC 指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述芪葛颗粒由黄芪 30 份，葛根 10 份，陈皮 5 份煎煮制成。

3.根据权利要求 1 所述的芪葛颗粒 HPLC 指纹图谱的建立方法，其特征在于：所述制备的混合对照品溶液是：配制成浓度分别为 3’-羟基葛根素 0.129mg/mL、葛根素0.693mg/mL、大豆苷 11.35µg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷 22.80µg/mL、染料木苷 56.25µg/mL、橙皮苷57.00µg/mL、大豆苷元 10.45µg/mL、毛蕊异黄酮 8.35µg/mL、染料木素 5.25µg/mL、芒柄花素 5.72µg/mL、川陈皮素 7.90µg/mL、桔皮素 4.10µg/mL 的混合对照品溶液。

4.根据权利要求 1所述的芪葛颗粒 HPLC 指纹图谱的建立方法，其特征峰为：与 3’-羟基葛根素对应的 3 号峰、与葛根素对应的 5 号峰、与大豆苷对应的 9号峰、与毛蕊异黄酮葡萄糖苷对应的 12 号峰、与染料木苷 13 号峰、与橙皮苷对应的 15 号峰、与大豆苷元对应的 17 号峰、毛蕊异黄酮对应的 18 号峰、染料木素对应的 19 号峰、与芒柄花素对应的 20 号峰、与川陈皮素对应的 21 号峰、与桔皮素对应的 22 号峰，其相对保留时间分别为 17.89、23.59、28.14、34.94、36.32、49.16、60.53、64.93、67.40、74.29、77.88、80.65，以9 号峰大豆苷为参照峰。

5.根据权利要求 1所述的芪葛颗粒 HPLC 指纹图谱的建立方法，其特征在于，特征峰还包括：相对保留时间为 14.03 的 1 号峰、相对保留时间为 16.92 的 2 号峰、相对保留时间为 21.71 的 4 号峰、相对保留时间为 25.15 的 6 号峰、相对保留时间为 25.91 的7 号峰、相对保留时间为27.25 的 8 号峰、相对保留时间为 30.21 的 10 号峰、相对保留时间为 33.08 的 11 号峰、相对保留时间为 42.02 的 14 号峰、相对保留时间为 54.62的 16 号峰。

6.根据权利要求 1所述的芪葛颗粒 HPLC 指纹图谱的建立方法，其特征在于：图谱中12、18、20 号峰来源于黄芪，1、2、3、5、7、8、9、13、14、16、17、19、20 号峰来源葛根，15、21、22号峰来源于陈皮。

7.权利要求1所述芪葛颗粒指纹图谱的建立方法在芪葛颗粒质量检测和质量控制中的应用。