CN110196299B

CN110196299B - 复视明胶囊的指纹图谱及其在质量控制与成分分析中的应用

Info

Publication number: CN110196299B
Application number: CN201910613937.9A
Authority: CN
Inventors: 王四旺; 何萌杉; 许璐; 张明科
Original assignee: Xi'an Lejian Biotechnology Co ltd
Current assignee: Xi'an Lejian Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-07-09
Filing date: 2019-07-09
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2039-07-09
Also published as: CN110196299A

Abstract

本发明涉及复视明胶囊的指纹图谱及其在质量控制与成分分析中的应用，本发明对HPLC流动相的优化，对10批复视明胶囊样品的色谱图进行分析共确定33个色谱峰为复视明胶囊的指纹图谱共有峰，且共有峰的峰面积占总峰面积的90％以上，确定了复视明胶囊的HPLC指纹图谱共有模式，标定了33个共有峰，相似度为0.994～1.000；并测定了10批制剂中5‑HMF、葛根素、3’‑甲氧基葛根素、大豆苷、芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素、藁本内酯的含量。本发明建立的复视明胶囊的HPLC指纹图谱方法与含量测定方法，具有良好的分析评价能力，具有准确简便、稳定可靠等优势。因此，该方法可作为本制剂质量的有效评价方法。

Description

复视明胶囊的指纹图谱及其在质量控制与成分分析中的应用

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及复视明胶囊的指纹图谱及其在质量控制与成分分析中的应用。

背景技术

复视明胶囊由西洋参、黄芪、熟地黄、当归、决明子、红花、珍珠、葛根、枸杞子、水蛭、丝瓜络、桂枝共12味中药材配制而成，其处方是第四军医大学西京医院院内制剂临床经验方。具有益气活血、滋阴补肾、通络明目的功效，主要用于气虚血瘀、肝肾不足、脉络阻滞所致糖尿病之眼底视网膜病变。由于复视明胶囊成分复杂，一般条件下各化学成分分离度低，目前对复视明胶囊活性成分的研究报道较少，仅有发明人对其进行定性或少量成分定量分析的报道，尚无复视明胶囊的质量控制标准及成分分析方法。为了建立一种复视明胶囊质量控制及成分检测的方法，本发明采用HPLC法同时测定复视明胶囊中5-羟甲基糠醛(5-HMF)、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素、藁本内酯等8种活性成分，并建立特征指纹图谱，以期全面地评价复视明胶囊的质量。

发明内容

本发明提供一种复视明胶囊的HPLC指纹图谱，其特征在于当HPLC色谱条件如下时，所述复视明胶囊的HPLC指纹图谱基本与图1C(或图2D、图3A、图4中任一图)一致；

HPLC色谱条件如下：

色谱柱为Phenomenex Luna C18，规格：250mm×4.5mm，5μm；

流动相：甲醇为A相，水为B相；

梯度洗脱程序

流速：1.0mL·min^-1；柱温：35℃；检测波长：270nm；进样量10μL。

本发明的另一实施方案提供上述复视明胶囊的HPLC指纹图谱，其特征在于所述复视明胶囊的HPLC指纹图谱基本与图1C(或图2D、图3A、图4中任一图)一致，具有33个特征指纹色谱峰，其中峰5为5-羟甲基糠醛(5-HMF)，峰11为葛根素，峰12为3’-甲氧基葛根素，峰15为大豆苷，峰21为芒柄花苷，峰23为大豆苷元，峰29为橙黄决明素，峰30为藁本内酯。

本发明的另一实施方案提供上述复视明胶囊的HPLC指纹图谱在复视明胶囊质量控制、成分分析中的应用。

本发明的另一实施方案提供上述复视明胶囊的HPLC指纹图谱在复视明胶囊质量控制中的应用，其特征在于所述应用包括如下步骤：

(1)将复视明胶囊的内容物溶于甲醇，配置成供试品溶液；

(2)取步骤(1)得到的供试品溶液，经HPLC检测，得供试品的HPLC图，其中色谱条件如下：

色谱柱为Phenomenex Luna C18，规格：250mm×4.5mm，5μm；

流动相：甲醇为A相，水为B相；

梯度洗脱程序

流速：1.0mL·min^-1；柱温：35℃；检测波长：270nm；进样量10μL；

(3)将步骤(2)得到的供试品的HPLC色谱图与本发明所述的复视明胶囊的HPLC指纹图谱比较，相似度在0.98以上的复视明胶囊为合格产品。

其中步骤(1)中优选2g复视明胶囊的内容物使用20mL甲醇；供试品溶液配置时，优选先向2g复视明胶囊的内容物中加入20mL甲醇，超声处理(功率250KW，频率40kHz)30-40min后，放置冷却至室温，再次称定质量并用甲醇补足失重，过滤，取续滤液，过0.22μm滤膜，即得供液相色谱测定用的供试品溶液。

本发明的另一实施方案提供一种复视明胶囊的成分分析方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

(1)8种对照品混合溶液的制备：

按表中质量取对照品5-HMF、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素、藁本内酯，并置于同一20mL量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度线，摇匀，即得；

8种成分混合对照品的配制

(2)步骤(1)中各对照品标准曲线的制作：分别精密量取步骤(1)得到的对照品混合溶液0.5、1、1.5、2、2.5、5mL分别置于10mL容量瓶中并加甲醇稀释至刻度，用0.22μm微孔滤膜滤过后进行HPLC检测，以各对照品的质量浓度(x，μg/mL)为横坐标，峰面积值(y)为纵坐标，通过计算，得线性方程，如下表：

8种成分的线性关系

(3)供试品溶液的制备：将复视明胶囊的内容物溶于甲醇，配置成供试品溶液；

(4)取步骤(3)得到的供试品溶液，经HPLC检测，根据5-HMF、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素、藁本内酯在指纹图谱中的位置及步骤(2)中的线性方程计算得出5-HMF、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素、藁本内酯的含量；

步骤(2)、(4)中所述HPLC检测的色谱条件如下：

色谱柱为Phenomenex Luna C18，规格：250mm×4.5mm，5μm；

流动相：甲醇为A相，水为B相；

梯度洗脱程序

其中步骤(3)中优选2g复视明胶囊的内容物使用20mL甲醇；供试品溶液配置时，优选先向2g复视明胶囊的内容物中加入20mL甲醇，超声处理(功率250KW，频率40kHz)30-40min后，放置冷却至室温，再次称定质量并用甲醇补足失重，过滤，取续滤液，过0.22μm滤膜，即得供液相色谱测定用的供试品溶液。

步骤(4)中所述5-HMF、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素、藁本内酯的含量依次优选为2.24±0.20、9.68±0.23、6.68±0.12、5.47±0.08、0.37±0.05、1.20±0.11、0.83±0.04、1.60±0.05mg/g。

本发明的另一实施方案提供一种药物组合物，其特征在于按重量份计，所述药物组合物由如下有效成分组成：

2.24±0.20份5-HMF，9.68±0.23份葛根素，6.68±0.12份3’-甲氧基葛根素，5.47±0.08份大豆苷，0.37±0.05份芒柄花苷，1.20±0.11份大豆苷元，0.83±0.04份橙黄决明素，1.60±0.05份藁本内酯。所述药物组合物的剂型可以为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。

本发明的另一实施方案提供上述药物组合物在治疗和或/预防糖尿病眼病(尤其是糖尿病视网膜病变)中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明弥补了现有技术的不足，建立复视明胶囊的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，为复视明胶囊的质量控制提供了有效的方法；(2)本发明对10批复视明胶囊样品的色谱图进行匹配，得到对照图谱，在10批样品中，共确定33个色谱峰为复视明胶囊的指纹图谱共有峰，且共有峰的峰面积占总峰面积的90％以上，确定了复视明胶囊的HPLC指纹图谱共有模式，标定了33个共有峰，相似度为0.994～1.000；并测定了10批制剂中5-HMF、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素、藁本内酯的含量依次优选为2.24±0.20、9.68±0.23、6.68±0.12、5.47±0.08、0.37±0.05、1.20±0.11、0.83±0.04、1.60±0.05mg/g；(3)本发明建立的复视明胶囊的HPLC指纹图谱方法与含量测定方法，具有良好的分析评价能力，具有准确简便、稳定可靠等优势。因此，该方法可作为本制剂质量的有效评价方法；(4)本发明通过对复视明胶囊8种有效成分含量的确定，获得一种8组分药物组合物，能有效治疗糖尿病视网膜病变；该药物组合物成分明确、疗效显著，便于质量控制与应用。

本发明采用PDA检测器全波长对复视明胶囊样品进行测定，依据三维色谱图及对应波长下峰的信息量，结果270nm时信息量较多，同时5-HMF、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素、藁本内酯等8个化合物与相邻各峰有良好的分离度，故将其作为HPLC指纹图谱的定性波长与8个化合物的定量波长。

由于中药复方中成分复杂，等度洗脱难以充分洗脱，所以采用梯度洗脱的方法。对不同流动相系统乙腈-水、甲醇-0.3％磷酸水、甲醇-水进行比较，结果乙腈-水作为流动相时，色谱峰峰分离效果不佳，在检测波长270nm下基线不平稳；甲醇-水作为流动相时，色谱峰分离度较好；而若向水相加入0.3％的磷酸，甲醇为有机相，色谱峰分离效果稍欠佳。故，最终选择甲醇-水作为流动相体系建立复视明胶囊指纹图谱。

供试品溶液，使用甲醇作为溶剂，采用不同时间(10、15、20、30、40、50、60min)泡、超声处理方法或加热回流，结果，加甲醇超声30-40min较理想。对不同柱温与流速进行比较，柱温超过或低于35℃，但大部分色谱峰分离度小或不能分开；流速高于或低于1.0mL·min^-1，大部分色谱峰分离度差；色谱记录时间，在100min之后，无谱峰出现。因此，选择便于控制的柱温35℃，流速1.0mL·min^-1和记录时间为100min。

附图说明

图1是不同流动相得到的复视明胶囊的HPLC图；乙腈-水流动相体系(A)、甲醇-0.3％磷酸水流动相体系(B)和甲醇-水流动相体系(C)色谱图比较(检测波长270nm)。

图2是不同浓度甲醇溶液提取复视明胶囊内容物的HPLC图；70％甲醇(A)、80％甲醇(B)、90％甲醇(C)、100％甲醇(D)。

图3是10批复视明胶囊样品的HPLC指纹图谱(A)和混合对照品的HPLC图(B)；注：峰5：5-HMF；峰11：葛根素；峰12：3’-甲氧基葛根素；峰15：大豆苷；峰21：芒柄花苷；峰23：大豆苷元；峰29：橙黄决明素；峰30：藁本内酯。

图4是复视明胶囊HPLC指纹图谱的共有模式图；注：峰5：5-HMF；峰11：葛根素；峰12：3’-甲氧基葛根素；峰15：大豆苷；峰21：芒柄花苷；峰23：大豆苷元；峰29：橙黄决明素；峰30：藁本内酯。

图5是给药6周后ERG变化图；A：暗适应3.0反应b波幅值；B：暗适应3.0反应b波幅值；C：暗适应OPs2波幅值；D：明适应3.0闪烁反应幅值；

n＝8；与Control组比较，^**P＜0.01；与DM组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与DM+Compositions组比较，^&&P＜0.01。

图6是给药6周后视网膜中SOD、TNF-α和IL-6表达水平图；A：视网膜中SOD水平；B：视网膜中TNF-α水平；C：视网膜中IL-6水平；

n＝8；与Control组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与DM组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

具体实施方式

为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。

实施例1指纹图谱的建立

1.仪器、材料与试剂

1.1仪器与材料

1.2药品与试剂

复视明胶囊(西安乐健生物科技有限公司，批号：20180506、20180507、20180508、20180605、20180508、20180509、20180607、20180608、20180609、20180610，规格：400mg/粒)(S1～S10)；5-羟甲基糠醛对照品(批号：111626-201610，纯度：99.2％)、葛根素对照品(批号：110752-201615，纯度：95.4％)、大豆苷对照品(批号：111738-201603，纯度：93.3％)、橙黄决明素对照品(批号：111900-201605，纯度：98.3％)、藁本内酯对照品(批号：111737-201608，纯度：99.2％)均购自中国食品药品检定研究院。芒柄花苷对照品(批号：486-62-4，纯度：98.0％)、3’-甲氧基葛根素对照品(批号：117047-07-1，纯度：98.0％)和大豆苷元对照品(批号：486-66-8，纯度：98.0％)均购自宝鸡辰光生物科技有限公司。实验用甲醇为色谱纯，水为纯化水。

2.实验方法与结果

2.1混合对照品溶液的配制

取对照品5-HMF、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素、藁本内酯，用精密天秤取适量(表1)，并置于同一20mL量瓶中。用甲醇溶液定容至刻度线，摇匀，即得。

表1 8种成分混合对照品的配制

2.2色谱条件

2.2.1流动相的选择

为了选择最佳流动相体系，我们对乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.3％磷酸水三种流动相体系的色谱图进行了对比分析。如图1所示，乙腈-水作为流动相时(图1A)，色谱峰峰分离效果不佳，在检测波长270nm下基线不平稳；甲醇-水作为流动相时(图1C)，色谱峰分离度较好；而若向水相加入0.3％的磷酸，甲醇为有机相(图1B)，色谱峰分离效果稍欠佳。故，最终选择甲醇-水作为流动相体系建立复视明胶囊指纹图谱。

2.2.2色谱条件的建立

色谱柱为Phenomenex Luna C18(250mm×4.5mm,5μm)，柱温为35℃，进样量10μL，检测波长270nm；流动相A为甲醇溶液,流动相B为水；体积流量1.0mL/min；如表2所示，进行梯度程序洗脱。

表2梯度洗脱程序

2.3供试品溶液制备

2.3.1供试品溶液制备预实验

前期预实验证明甲醇溶液能够较好地对样品成分进行提取，为了选择最合适的甲醇浓度，并根据复视明的制备工艺，选择了4个甲醇浓度对复视明胶囊内容物进行处理，探讨最佳提取浓度。取同一批复视明胶囊内容物2g，精密称定，分别置于编号为1、2、3、4的四个具塞锥形瓶中(见表3)。1、2、3、4号锥形瓶中，分别精密加入20mL 70％甲醇、80％甲醇、90％甲醇溶液和100％甲醇。密塞，称定质量。超声处理40min后，放置冷却，再次称定质量并用甲醇补足失重，过滤，取续滤液，过0.22μm滤膜，供液相色谱测定。

我们采用70％、80％、90％和100％浓度甲醇对复视明胶囊内容物进行超声提取，并比较4者图谱(图2)。由图2可知，4种浓度提取指纹图谱分离度无明显差异，且100％甲醇提取基线最平稳，因此选择100％甲醇进行供试品的制备较为合理。

表3不同浓度甲醇制备供试品

2.3.2供试品溶液制备方法

分别取10批复视明胶囊内容物各约2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中。分别精密加入20mL甲醇溶液，密塞，称定质量。超声处理40min后，放置冷却，再次称定质量并用甲醇补足失重，过滤，取续滤液，过0.22μm滤膜，供液相色谱测定。

2.4线性关系考察

精密吸取按“2.1”项下方法制备的混合对照品储备液0.5、1、1.5、2、2.5、5mL，分别置10mL量瓶中，以甲醇溶液定容至刻度线，摇匀，即得系列质量浓度的混合对照品溶液。进样体积为10μL，采用高效液相色谱仪记录色谱图。以峰面积积分值(Y)和对应对质量浓度(X)进行线性回归，求得回归方程，见表4。

表4 8种成分的线性关系

2.5方法学考察

2.5.1精密度试验

取同一供试品溶液,按以上色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示，5-HMF、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素、藁本内酯的峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为0.7％、0.6％、0.9％、1.1％、1.3％、0.8％、1.6％、1.2％；选取11号葛根素色谱峰为参照峰，计算得到各主要色谱峰相对保留时间的RSD均小于0.4％，表明实验设备的精密度良好。

2.5.2稳定性实验

取同一份供试品溶液,按项下色谱条件,分别在1、2、4、7、10天时间点进样。结果显示，5-HMF、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素、藁本内酯的峰面积的RSD分别为1.4％、1.6％、1.2％、1.9％、1.7％、1.1％、1.2％、1.3％；选取11号葛根素色谱峰为参照峰，计算得到各主要色谱峰相对保留时间的RSD均小于1.1％,表明所制得样品中的成分在10天内的稳定性良好。

2.5.3重复性实验

称取同一样品6份,平行测定,记录峰面积和保留时间。结果显示5-HMF、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素、藁本内酯的峰面积的RSD分别为0.6％、1.2％、0.7％、0.6％、0.5％、0.7％、1.2％、0.9％；选取11号葛根素色谱峰为参照峰，计算得到各主要色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.7％,表明实验的重复性良好。

2.6复视明胶囊指纹图谱的研究

2.6.1指纹图谱的建立与共有峰指认

取10批次复视明胶囊(S1～S10)按“2.3.2”项下方法平行制备供试品溶液。进样量为10μL，柱温为35℃，检测波长为270nm，按“2.2”项下色谱条件对供试品溶液和混合对照品溶液进行测定，记录色谱图(图3A)。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.0版本)”软件，将实验数据导入，对10批复视明胶囊样品的色谱图进行匹配，得到对照图谱(图3B)。在10批样品中，共确定33个色谱峰为复视明胶囊的指纹图谱共有峰，且共有峰的峰面积占总峰面积的90％以上(图4)。通过样品色谱图与对照品色谱图中各峰的保留时间进行对比，可对其中的8个共有峰进行指认，确定5号峰为5-HMF，11号峰为葛根素，12号峰为3’-甲氧基葛根素，15号峰为大豆苷，21号峰为芒柄花苷，23号峰为大豆苷元，29号峰为橙黄决明素，30号峰为藁本内酯(图3)。

2.6.2指纹图谱相似度分析

将所得到的10个批次复视明胶囊的指纹图谱导入药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.0版本)”软件，对10个批次样品的相似度进行分析，各样品之间的相似度均大于0.967，以S1样品图谱作为参照图谱(图3)，进行相似度计算，10批复视明胶囊相似度分别为分别为0.998、0.988、0.994、0.999、0.987、0.996、0.992、0.990、0.998、1.000，均大于0.98，相似度良好。因此，从整体化学谱峰信息表明，10个批次复视明胶囊样品的质量相对稳定。结果表明，不同批次的复视明胶囊特征成分各自相似度较高、化学组成一致性较好、质量比较稳定。

2.7加样回收率试验

取同一已知含量复视明胶囊样品(S3)2g，精密称定6份，分别置于具塞锥形瓶中，精密量取“2.1”项下混合对照品溶液1.5mL置于以上6份样品中，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，再按照“2.2”项下色谱条件进行测定，记录色谱图并计算加样回收率。结果5-HMF、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素、藁本内酯回收率分别为98.2％、101.1％、99.3％、101.3％、100.5％、98.8％、97.7％、102.36％，RSD分别为0.7％、1.3％、0.9％、1.4％、1.4％、1.0％、1.1％、0.9％。

2.8样品含量测定

取10批样品，分别按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，每批3份，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品中5-HMF、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素、藁本内酯的含量，结果见表5。

表5复视明胶囊中8种成分测定结果(n＝3，mg/g)

实施例2 8种成分药物组合物的药效学研究

1.仪器、材料与试剂

1.1仪器与材料

1.2药品与试剂

复视明胶囊药粉，由空军军医大学药物研究所提供，批号20170301。羟苯磺酸钙胶囊为市购产品，批号：20161104，贵州天安药业股份有限公司生产，批准文号：国药准字H20010481。5-羟甲基糠醛对照品(批号：111626-201610，纯度：99.2％)、葛根素对照品(批号：110752-201615，纯度：95.4％)、大豆苷对照品(批号：111738-201603，纯度：93.3％)、橙黄决明素对照品(批号：111900-201605，纯度：98.3％)、藁本内酯对照品(批号：111737-201608，纯度：99.2％)均购自中国食品药品检定研究院。芒柄花苷对照品(批号：486-62-4，纯度：98.0％)、3’-甲氧基葛根素对照品(批号：117047-07-1，纯度：98.0％)和大豆苷元对照品(批号：486-66-8，纯度：98.0％)均购自宝鸡辰光生物科技有限公司。实验用甲醇为色谱纯，水为纯化水。链脲佐菌素(STZ)和戊巴比妥钠购自美国Sigma公司。TNF-α试剂盒从美国Sigma公司购入，SOD试剂盒和IL-6试剂盒从上海生物工程股份有限公司购入。

1.3实验动物

健康的SD(Suprague Daeley，SD)大鼠，SPF级，雄性，体质量200.0±20.0g，7～8周龄左右，购自空军军医大学实验动物中心，许可证号：scxk(军)字No.2014270138S号。本实验中，动物的饲养及处理等各项操作均遵循空军军医大学动物伦理委员会的相关条款，并符合视觉与眼科研究协会(The Association for Research in Vision andOphthalmology，ARVO)相关规定。

2方法

2.1实验用试剂的配制

1)麻醉剂：1％戊巴比妥钠粉末用蒸馏水配制成溶液，4℃保存待用，2周更换一次。

2)柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：取4.2g柠檬酸，5.88g柠檬酸钠，分别溶于200mL双蒸水中，二者以1:1或1:1.32混合，调PH，用PH酸性试纸测得PH值在4.2-4.5范围中，即得。

3)10mg/mL STZ溶液：取1g STZ粉末溶解于100mL上述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，现配现用，冰浴，避光。

4)药物组合物试药：精密称取5-HMF、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素和藁本内酯，用生理盐水配制成质量浓度各为0.448mg/mL、1.936mg/mL、1.336mg/mL、1.094mg/mL、0.074mg/mL、0.240mg/mL、0.166mg/mL和0.32mg/mL的混合混悬液，混匀，现配现用；相当于按重量份计处方：2.24份5-HMF，9.68份葛根素，6.68份3’-甲氧基葛根素，5.47份大豆苷，0.37份芒柄花苷，1.20份大豆苷元，0.83份橙黄决明素，1.60份藁本内酯。

5)复视明试药：精密称取复视明胶囊内容物，用生理盐水配制成质量浓度为0.2g/mL的混悬液，混匀，现配现用。

6)羟苯磺酸钙试药：精密称取羟苯磺酸钙胶囊内容物，用生理盐水配制成质量浓度为0.08g/mL的混悬液，混匀，现配现用。

2.2糖尿病视网膜病大鼠模型制备及分组

2.2.1造模方法

SD雄性大鼠适应性饲养5天后，进行糖尿病模型的制备。大鼠禁食12小时(自由饮水)后，按照55mg/kg体重，单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(Sigma，美国)，诱导糖尿病大鼠模型。注射STZ 72小时后，采用ACCU-CHEK Performa血糖仪(Roche,Germany)测定大鼠血糖水平，将血糖水平高于16.7mmol/L的大鼠视为糖尿病造模成功。造模成功率为76％(32/42)。未达到血糖标准大鼠腹腔注射过量戊巴比妥钠处死排除实验。

2.2.2分组及给药

糖尿病模型建立8周后，将32只糖尿病大鼠，随机分为4组，即模型组(n＝8，DM)、阳性组(n＝8，CaD)、复视明组(n＝8，FSM)和药物组合物组(n＝8，Compositions)。其中，阳性药物为羟苯磺酸钙胶囊(CaD)。另外选取年龄匹配的8只正常大鼠，作为空白对照组(Control)。复视明胶囊剂量由临床剂量换算[计算方法：临床剂量×6.25(换算系数)/60kg(成人体重)＝用药剂量]，预实验结果验证，并参考急性毒性实验无法测得半数致死量的实验结果，综合而得。羟苯磺酸钙胶囊剂量是根据临床用药剂量换算而得。给药方式为灌胃给药，每日一次，持续给药6周。在整个实验过程中，对大鼠进行体重和血糖的监测。具体分组及药物干预情况如下：

1)空白对照组(Control)：生理盐水，2.5mL/kg。

2)模型组(DM)：生理盐水，2.5mL/kg。

3)羟苯磺酸钙阳性组(DM+CaD)：羟苯磺酸钙胶囊，0.2g/kg。

4)复视明组(DM+FSM)：复视明胶囊，0.5g/kg。

5)药物组合物组(DM+Compositions)：复视明胶囊8种成分组合药物，2.5mL/kg。

2.3全视野视网膜电图(full field electroretinograms，ffERG)检查

方法：应用全视野视网膜电图(full field electroretinograms，ffERG)标准五项检查，观察药物干预6周后(糖尿病总病程14周)糖尿病大鼠视网膜功能的变化。具体操作方法参照本平台前期建立的标准化方案，结合最新国际临床视觉电生理学会(International Society for Clinical Electrophysiology of Vision，ISCEV)视网膜电图操作标准(2015年版)：先将动物置于完全密封的暗适应箱中暗适应2小时以上，采用1％戊巴比妥钠(0.3mL/100g)联合50％速眠新(0.05mL/大鼠)，腹腔注射进行麻醉，用复方托吡卡胺滴眼液散瞳；在弱红光下，将麻醉状态大鼠置于有机玻璃固定架上，在动物相应部位(角膜、颊部和尾部)装好电极，角膜记录电极(大鼠使用自制的氯化银电极)置于角膜中央；参考电极放置于大鼠颊部，接地电极插于大鼠尾部根处。固定好大鼠后，在Ganzfeld刺激器前，使用RETI-SCAN视觉电生理检查系统(德国Roland Consult公司)，在暗室检测ISCEV ERG标准五项反应，即暗适应0.01反应(刺激光强0.01cd·s/m2，通频带1.0-300Hz，叠加次数1次)，暗适应3.0反应(刺激光强3.0cd·s/m2，通频带1.0-300Hz，叠加次数1次)，暗适应3.0OPs反应(刺激光强3.0cd·s/m2，通频带100-300Hz，叠加次数1次)，明适应3.0反应(明适应10min，刺激光强3.0cd·s/m2，通频带1.0-300Hz，叠加次数3次)和明适应3.0闪烁光反应((刺激光强3.0cd·s/m2，通频带1.0-300Hz，刺激光频率30Hz)；每项检查至少重复两次，保证波形重复性较一致后，统一记录最后一次波形相应指标；记录暗适应3.0反应b波幅值和暗适应3.0反应OPs2波幅值。

结果：经过6周的药物干预(糖尿病总病程14周)，对各组大鼠视网膜进行ERG检测。如图5所示，与Control组相比，糖尿病大鼠的暗适应b(d0.01)、暗适应b(d3.0)、暗适应OPs2波和明适应3.0闪烁反应幅值幅值呈下降趋势(P<0.01)。与DM组比较，DM+CaD组、DM+FSM组和DM+Compositions组显著升高b(d3.0)、b(d0.01)和OPs2波(P<0.05)；DM+CaD组和DM+FSM组显著升高明适应3.0闪烁反应幅值(P<0.05)。此外，DM+Compositions组对暗适应b(d3.0)的改善作用与DM+FSM组间有统计学差异。这表明本发明药物组合物对糖尿病视网膜病变有治疗作用，治疗效果与阳性药羟苯磺酸钙相当。

2.4视网膜中抗氧化与抗炎指标检测

于药物干预6周后(糖尿病总病程14周)，随机取4只大鼠，过量戊巴比妥钠麻醉，取眼球，分离出视网膜组织。按照超氧化物歧化酶(SOD)(Sigma Aldrich,USA)说明书操作步骤，测定视网膜匀浆中抗氧化酶SOD的活性(U/mL蛋白)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，根据试剂盒说明书实验操作方法(生工，中国)，测定视网膜中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的水平。如图6所示，在药物干预6周后(糖尿病总病程14周)，与Control组相比，糖尿病大鼠视网膜中SOD的活性下降，TNF-α和IL-6的表达水平上升(P<0.05)。与DM组比较，DM+FSM组、DM+CaD组和DM+Compositions组显著增强SOD的活性，并抑制TNF-α和IL-6表达水平的升高(P<0.05)。

本发明涉及的统计分析方法，实验数据均使用SPSS 19.0版软件(IBM,Chicago,IL,USA)进行统计分析。测得数据呈正态分布，表示为平均值±标准差。两组数据统计采用独立样本t检验，多组数据统计采用单因素方差分析(ANOVA)，组间比较采用LSD-t检验(方差齐性时)或Dunnett’s T3检测(方差不齐时)。P<0.05，则认为差异具有统计学意义。统计图表由Graphpad Prism 7(GraphPadSoftware,US)软件制作。

Claims

1.复视明胶囊的HPLC指纹图谱在复视明胶囊质量控制、成分分析中的应用，其特征在于将复视明胶囊的内容物溶于甲醇，超声30-40min配置成供试品溶液；

HPLC色谱条件如下：

色谱柱为Phenomenex Luna C18，规格：250mm×4.5mm，5μm；

流动相：甲醇为A相，水为B相；

梯度洗脱程序

所述复视明胶囊的HPLC指纹图谱具有33个特征指纹色谱峰，其中峰5为5-羟甲基糠醛，峰11为葛根素，峰12为3’-甲氧基葛根素，峰15为大豆苷，峰21为芒柄花苷，峰23为大豆苷元，峰29为橙黄决明素，峰30为藁本内酯。

2.权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用包括如下步骤：

(1)将复视明胶囊的内容物溶于甲醇，配置成供试品溶液；

色谱柱为Phenomenex Luna C18，规格：250mm×4.5mm，5μm；

流动相：甲醇为A相，水为B相；

梯度洗脱程序

(3)将步骤(2)得到的供试品的HPLC色谱图与权利要求1所述的复视明胶囊的HPLC指纹图谱比较，相似度在0.98以上的复视明胶囊为合格产品。

3.权利要求2所述的应用，其特征在于步骤(1)中每2g复视明胶囊的内容物使用20mL甲醇。

4.一种复视明胶囊的成分分析方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

(1)8种对照品混合溶液的制备：

8种成分混合对照品的配制

(2)步骤(1)中各对照品标准曲线的制作：分别精密量取步骤(1)得到的对照品混合溶液0.5、1、1.5、2、2.5、5mL分别置于10mL容量瓶中并加甲醇稀释至刻度，用0.22μm微孔滤膜滤过后进行HPLC检测，以各对照品的质量浓度x，μg/mL为横坐标，峰面积值y为纵坐标，通过计算，得线性方程，如下表：

8种成分的线性关系

步骤(2)、(4)中所述HPLC检测的色谱条件如下：

色谱柱为Phenomenex Luna C18，规格：250mm×4.5mm，5μm；

流动相：甲醇为A相，水为B相；

梯度洗脱程序

5.权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述5-HMF、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、芒柄花苷、大豆苷元、橙黄决明素、藁本内酯的含量依次为2.24±0.20、9.68±0.23、6.68±0.12、5.47±0.08、0.37±0.05、1.20±0.11、0.83±0.04、1.60±0.05mg/g。

6.一种用于治疗和/或预防糖尿病视网膜病变的药物组合物，其特征在于按重量份计，所述药物组合物由如下有效成分组成：

2.24±0.20份5-HMF，9.68±0.23份葛根素，6.68±0.12份3’-甲氧基葛根素，5.47±0.08份大豆苷，0.37±0.05份芒柄花苷，1.20±0.11份大豆苷元，0.83±0.04份橙黄决明素，1.60±0.05份藁本内酯。

7.权利要求6所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防糖尿病视网膜病变的药物中的应用。

8.权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物的剂型为固体制剂、液体制剂或半固体制剂。