CN110559359A - 一种吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法及检测方法，该方法直接将吴茱萸鲜药材阴干或晒干或烘干，本发明将吴茱萸的产地初加工与饮片炮制结合在一起，直接由鲜吴茱萸加工成吴茱萸饮片。并在现有对吴茱萸研究的基础上，通过吴茱萸一测多评法的建立，以吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量为指标，结合指纹图谱以及药效学实验从整体上系统的研究吴茱萸产地加工与炮制一体化技术，并与传统方法炮制的饮片进行对比研究，为吴茱萸产地加工与炮制一体化技术的规范化以及吴茱萸的质量检测方法提供科学依据，提高吴茱萸药材饮片的质量以及临床应用的安全性和有效性。

Description

一种吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法及检测方法
技术领域
本发明涉及中药产地加工与炮制一体化技术领域，具体涉及一种用于吴茱萸产地加工和炮制一体化加工方法及检测方法。
背景技术
吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode.)Huang或疏毛吴茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果实。具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效[1]。
吴茱萸的化学成分较多，主要包括有生物碱类、挥发油类、苦味素类、萜类、黄酮类等[2-5]。目前对其研究较多的主要是生物碱类成分，包括吴茱萸次碱、吴茱萸碱、去氢吴茱萸碱等。现行15版药典以吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素作为吴茱萸含量测定的指标性成分。相关药理研究表明，去氢吴茱萸碱主要有抗心律失常、舒张血管、增加脑血流量、改善记忆力的作用等[6-7]；苦味素类化合物主要有镇痛抗炎、抑制肿瘤等作用[8]；吴茱萸碱具有强心、扩张血管、使胃肠平滑肌松弛、抗肿瘤等作用[9-10]；吴茱萸次碱主要有强心、扩张血管、改善大鼠缺血性脑损伤、治疗胃黏膜损伤、抑制免疫等作用[11-13]；吴茱萸新碱主要有调节血压、扩张血管、抗幽门螺旋杆菌、调节免疫等作用[14]。因此本次实验选择去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱作为含量测定的指标。
吴茱萸为贵州的道地药材，在贵州种植面积较广，在我国其他地方也广泛分布，中医临床以及中成药生产中都经常使用到。目前尚未见到对吴茱萸产地加工与炮制一体化方面的文献报道。吴茱萸传统的产地加工方法主要有晒干、烘干。而吴茱萸的炮制工艺缺乏具体的工艺参数，现代有甘草制、盐制、姜汁制、醋制等[21-23]，各个地区的方法不尽相同，从而导致市面上吴茱萸药材的质量参差不齐。
中药指纹图谱技术的应用为中药的质量评价问题提供了新的思路和方法，通过系统科学和复杂科学理论与方法的结合，对中药质量的宏观和系统进行综合，在国际上得到了广泛的认可[24-26]。目前，在吴茱萸质量控制上面的研究多数是以吴茱萸次碱、吴茱萸内酯和吴茱萸碱的含量测定和指纹图谱研究[27-29]，由于在指纹图谱中色谱峰分离度较低以及共有峰较少，该方法不能较好的控制该药材质量。
赵娟娟等[30]建立了吴茱萸药材的HPLC指纹图谱，测定了吴茱萸中去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸内酯的含量。温慧玲等[31]通过指纹图谱，对吴茱萸不同炮制品的成分进行了比较。陈华国等[32]通过指纹图谱研究，对甘草制吴茱萸的炮制工艺进行了优选。但目前尚未见到对吴茱萸产地加工与炮制一体化技术所得饮片的指纹图谱研究。
本发明将吴茱萸的产地初加工与饮片炮制结合在一起，直接由鲜吴茱萸加工成吴茱萸饮片，探讨其合理性。并在现有对吴茱萸研究的基础上，通过吴茱萸一测多评法的建立，以吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量为指标，结合指纹图谱以及药效学实验从整体上系统的研究吴茱萸产地加工与炮制一体化技术，并与传统方法炮制的饮片进行对比研究，为吴茱萸产地加工与炮制一体化技术的规范化以及吴茱萸的质量检测方法提供科学依据，提高吴茱萸药材饮片的质量以及临床应用的安全性和有效性。
发明内容
本发明的目的是为了克服背景技术里的技术问题，提供一种吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法及质量检测方法。
本发明所述的一种吴茱萸产地加工和炮制一体化方法具体为：将吴茱萸鲜药材阴干或晒干或烘干。
所述阴干具体方法为：将吴茱萸鲜药材置于阴凉通风处阴干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
所述晒干具体方法为：将吴茱萸鲜药材置于太阳下晒干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
所述烘干具体方法为：将吴茱萸鲜药材置于不同干燥箱内40℃～100℃烘干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
优选的，本发明所述烘干具体方法为：将吴茱萸鲜药材置于不同干燥箱内50℃烘干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
本发明所述一种用于吴茱萸质量的检测方法，所述检测方法用于检测权利要求1-4任一项所述一体化加工方法制备而出的吴苵萸，其具体方法为：用一测多评法及HPLC指纹图法检测吴苵萸质量。
本发明所述吴茱萸质量检测方法中一测多评法具体方法为：
色谱条件：色谱柱为AgilentC18，5μm柱，流动相为乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长215nm～360nm，进样量10μL，梯度洗脱45min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：取吴茱萸药材粉末0.3g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入40～100％乙醇15～60mL，称定重量，超声30min～90min放冷，补足重量，过滤，取续滤液，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016mg、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
优选的，本发明所述吴茱萸质量检测方法中一测多评法具体方法为：
色谱条件：色谱柱为AgilentC18，5μm柱，流动相为乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长215nm，进样量10μL，梯度洗脱45min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：取吴茱萸药材粉末0.3g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇30mL，称定重量，超声30min放冷，补足重量，过滤，取续滤液，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016mg、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
本发明所述吴茱萸质量检测方法中HPLC指纹图法检测吴苵萸质量具体方法为：
色谱条件为：Agilent C18 5μm色谱柱，流动相乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长215nm～401nm，进样量10μL，梯度洗脱60min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：精密称取吴茱萸药材粉末0.3g，置50mL具塞锥形瓶中，加入40～100％乙醇15mL～60mL，称定重量，超声提取30min～90min，放冷，用40～100％乙醇补足减失的重量，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
本发明所述HPLC指纹图法检测吴苵萸质量具体方法为：
色谱条件为：Agilent C18 5μm色谱柱，流动相乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长215nm，进样量10μL，梯度洗脱60min，梯度洗脱程序为：
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016mg、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
供试品溶液的制备：精密称取吴茱萸药材粉末0.3g，置50mL具塞锥形瓶中，加入70％乙醇30mL，称定重量，超声提取30min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
现有技术的问题及本发明的有益效果
一、现有技术的问题：
1、吴茱萸为贵州的道地药材，在贵州种植面积较广，在我国其他地方也广泛分布，中医临床以及中成药生产中都经常使用到。目前尚未见到对吴茱萸产地加工与炮制一体化方面的文献报道。吴茱萸传统的产地加工方法主要有晒干、烘干。而吴茱萸的炮制工艺缺乏具体的工艺参数，现代有甘草制、盐制、姜汁制、醋制等[21-23]，各个地区的方法不尽相同，从而导致市面上吴茱萸药材的质量参差不齐。
2、中药指纹图谱技术的应用为中药的质量评价问题提供了新的思路和方法，通过系统科学和复杂科学理论与方法的结合，对中药质量的宏观和系统进行综合，在国际上得到了广泛的认可[24-26]。目前，在吴茱萸质量控制上面的研究多数是以吴茱萸次碱、吴茱萸内酯和吴茱萸碱的含量测定和指纹图谱研究[27-29]，由于在指纹图谱中色谱峰分离度较低以及共有峰较少，该方法不能较好的控制该药材质量。
3、赵娟娟等[30]建立了吴茱萸药材的HPLC指纹图谱，测定了吴茱萸中去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸内酯的含量。温慧玲等[31]通过指纹图谱，对吴茱萸不同炮制品的成分进行了比较。陈华国等[37]通过指纹图谱研究，对甘草制吴茱萸的炮制工艺进行了优选。但目前尚未见到对吴茱萸产地加工与炮制一体化技术所得饮片的指纹图谱研究。
本发明有益效果：
1、本发明将吴茱萸的产地初加工与饮片炮制结合在一起，直接由鲜吴茱萸加工成吴茱萸饮片，缩短工序，节约成本，操作性强，吴茱萸有效成分含量高，加工出来的饮片商品质量好、档次高。
2、采用一测多评的方法，该方法稳定、测定结果准确，简化了吴茱萸的含量测定方法，提高了对吴茱萸质量控制的技术。
3、与12批吴茱萸药材的对照指纹图谱共有模式比较，不同加工方法的吴茱萸生品以及炮制品指纹图谱相似度，吴茱萸鲜品炮制与传统炮制相似度均在0.900以上，表明相似度良好。
4.吴茱萸产地加工时烘干法较好，温度优选50℃为佳，吴茱萸炮制后5种指标性成分的含量均有所降低，吴茱萸一体化炮制所得饮片与传统炮制饮片中5种成分含量无显著性差异，表明吴茱萸产地加工与炮制一体化技术具有可行性。
5.本发明收集的12批不同产地吴茱萸药材的HPLC指纹图谱峰共有模式所得色谱图10个共有峰可作为其指纹特征，用于评价不同产地、不同加工方法吴茱萸药材化学成分间的变化。本实验也表明吴茱萸不同加工方法的生品、炮制品及一体化炮制品药材整体化学成分相对稳定。
6.吴茱萸一体化饮片与传统炮制饮片高低剂量组均对小鼠有良好的镇痛作用与止泻作用。吴茱萸一体化饮片与传统炮制饮片药效无明显差异，表明吴茱萸产地加工与炮制一体化技术具有良好的可行性。
7、本发明建立了吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱5种成分的“一测多评”测定法，同时证明了其可行性。吴茱萸次碱色谱峰峰形对称，无拖尾现象，周围杂质峰的干扰较小。
8、本发明以吴茱萸次碱为内参物，通过考察不同仪器、色谱柱去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸新碱对吴茱萸次碱的相对校正因子、相对保留时间，以及外标法与一测多评法的对比，建立吴茱萸含量测定的一测多评法，结果表明，通过外标法测定吴茱萸次碱，并利用相对校正因子测定去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸新碱科学可行，一测多评法能够用于吴茱萸中多种成分的质量评价研究。
9、在产地加工与炮制一体化技术方面，对吴茱萸产地加工方法进行了优化，结果表明，鲜药材50℃直接烘干时，各成分综合含量最高；对吴茱萸传统炮制工艺进行优化，结果表明，以每100kg吴茱萸，用甘草8kg、闷润2h、炮制温度140℃～160℃之间、炮制8min时各成分综合含量最高。对吴茱萸一体化炮制饮片与传统炮制饮片进行对比研究，表明两者之间各成分含量无明显差异，表明吴茱萸产地加工与炮制一体化技术是可行的。
10、本发明对吴茱萸HPLC指纹图谱研究，通过流动相的选择试验，明分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.02％磷酸水、乙腈-0.1％醋酸水4种流动相。采用乙腈-0.1％醋酸水作为流动相时，基线波动较大，色谱峰峰形不稳，采用乙腈-0.02％磷酸水时基线平稳，峰形对称，分离效果较好。
11、本发明对吴茱萸HPLC指纹图谱研究，通过波长的选择试验确定吴茱萸HPLC指纹图谱的检测波长，优选在215nm检测波长下基线较稳定，呈现的吸收峰较多，峰面积相对较大，分离度好，峰形对称。
12、本发明对吴茱萸HPLC指纹图谱研究，通过色谱柱的选择试验，确定了优选Agilent C18柱测得的各色谱峰峰面积相对较高，基线较平稳，峰形对称，所得色谱峰较多。
13、本发明对吴茱萸HPLC指纹图谱研究，通过对提取溶剂的考察及提取溶剂比例的考察，70％乙醇所得的吴茱萸色谱图分离度相对较好，峰面积较大，其结果优于其它溶剂条件，确定了70％乙醇为优选溶剂。
14、本发明建议的吴茱萸HPLC指纹图谱及吴茱萸一测多评法，经过方法学考察，线性关系、仪器精密度、供试品溶液稳定性、重复性良好，方法准确可行。
15、在吴茱萸一体化饮片与传统炮制饮片药效学对比的研究中，实验通过小鼠热板法、小鼠醋酸扭体法，以扭体次数和痛阈值为指标，表明吴茱萸具有较好的止痛作用，且在相同给药浓度下，吴茱萸一体化炮制饮片与传统炮制饮片对小鼠的止痛作用无明显差异；通过小鼠肠推进实验，表明吴茱萸具有较好的止泻作用，且在相同给药浓度下，吴茱萸一体化炮制饮片与传统炮制饮片对小鼠的止泻作用无明显差异。表明吴茱萸产地加工与炮制一体化技术具有良好的科学性与可行性。
附图说明：
图1吴茱萸样品波长扫描结果
图2吴茱萸样品不同波长色谱图
图3不同色谱柱选择色谱图
图4不同流动相系统色谱图
图5吴茱萸对照品及样品HPLC图谱(1、去氢吴茱萸碱；2、柠檬苦素；3、吴茱萸碱；4、吴茱萸次碱；5、吴茱萸新碱)
图6精密度试验
图7稳定性试验
图8重复性试验
图9吴茱萸样品波长扫描结果
图10不同波长所得色谱图
图11不同色谱柱所得色谱图
图12不同流动相系统对吴茱萸分离情况色谱图
图13吴茱萸混合对照品及样品HPLC指纹图谱(1、去氢吴茱萸碱；2、柠檬苦素；3、吴茱萸碱；4、吴茱萸次碱；5、吴茱萸新碱)
图14不同提取溶剂所得色谱图
图15提取溶剂不同比例色谱图
图16不同提取方法色谱图
图17不同提取时间色谱图
图18吴茱萸指纹图谱精密度试验
图19吴茱萸指纹图谱稳定性试验
图20吴茱萸指纹图谱重复性试验
图21 12批吴茱萸药材HPLC指纹图谱共有模式
图22 12批吴茱萸药材HPLC指纹图谱(s1～s12依次为：贵阳花果园、贵阳万东桥、贵州安顺、贵州黎平、贵州铜仁、贵州遵义、河南、湖北、江西樟树、四川、云南、浙江)
图23不同加工方法的吴茱萸药材HPLC指纹图谱(s1～s9依次为：40℃烘干生品、50℃烘干生品、60℃烘干生品、70℃烘干生品、80℃烘干生品、90℃烘干生品、100℃烘干生品、晒干生品、阴干生品)
图24不同加工方法吴茱萸药材炮制品HPLC指纹图谱(s1～s9依次为：40℃烘干炮制品、50℃烘干炮制品、60℃烘干炮制品、70℃烘干炮制品、80℃烘干炮制品、90℃烘干炮制品、100℃烘干炮制品、晒干炮制品、阴干炮制品)
图25不同加工方法的吴茱萸药材生品、炮制品HPLC指纹图谱(s1～s18依次为：40℃烘干生品、50℃烘干生品、60℃烘干生品、70℃烘干生品、80℃烘干生品、90℃烘干生品、100℃烘干生品、晒干生品、阴干生品、40℃烘干炮制品、50℃烘干炮制品、60℃烘干炮制品、70℃烘干炮制品、80℃烘干炮制品、90℃烘干炮制品、100℃烘干炮制品、晒干炮制品、阴干炮制品)
图26吴茱萸一体化炮制与传统炮制饮片HPLC指纹图谱(s1一体化炮制，s2传统炮制)
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法
将吴茱萸鲜药材置于阴凉通风处阴干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
实施例2：吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法
将吴茱萸鲜药材置于太阳下晒干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
实施例3：吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法
将吴茱萸鲜药材置于不同干燥箱内40℃烘干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
实施例4：吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法
将吴茱萸鲜药材置于不同干燥箱内50℃烘干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
实施例5：吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法
将吴茱萸鲜药材置于不同干燥箱内60℃烘干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
实施例6：吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法
将吴茱萸鲜药材置于不同干燥箱内70℃烘干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
实施例7：吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法
将吴茱萸鲜药材置于不同干燥箱内80℃烘干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
实施例8：吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法
将吴茱萸鲜药材置于不同干燥箱内90℃烘干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
实施例9：吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法
将吴茱萸鲜药材置于不同干燥箱内100℃烘干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
实施例1-9吴茱萸饮片用实施例10-实施例15任一检测方法检测
实施例10吴茱萸质量检测方法
1、一测多评法
色谱条件：色谱柱为AgilentC18，5μm柱，流动相为乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长215nm，进样量10μL，梯度洗脱45min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：取吴茱萸药材粉末0.3g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇30mL，称定重量，超声30min放冷，补足重量，过滤，取续滤液，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016mg、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
2、HPLC指纹图法
色谱条件为：Agilent C18，5μm色谱柱，流动相乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长215nm，进样量10μL，梯度洗脱60min，梯度洗脱程序为：
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016mg、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
供试品溶液的制备：精密称取吴茱萸药材粉末0.3g，置50mL具塞锥形瓶中，加入70％乙醇30mL，称定重量，超声提取30min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
实施例11吴茱萸质量检测方法
1、一测多评法
色谱条件：色谱柱为AgilentC18，5μm柱，流动相为乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长215nm，进样量10μL，梯度洗脱45min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：取吴茱萸药材粉末0.3g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入40％乙醇15mL，称定重量，超声30min放冷，补足重量，过滤，取续滤液，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016mg、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
2、HPLC指纹图法
色谱条件为：Agilent C18，5μm色谱柱，流动相乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长242nm，进样量10μL，梯度洗脱60min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：精密称取吴茱萸药材粉末0.3g，置50mL具塞锥形瓶中，加入40％乙醇15mL，称定重量，超声提取30min，放冷，用40％乙醇补足减失的重量，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
实施例12检测方法
1、一测多评法
色谱条件：色谱柱为AgilentC18，5μm柱，流动相为乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长254，进样量10μL，梯度洗脱45min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：取吴茱萸药材粉末0.3g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇30mL，称定重量，超声60min放冷，补足重量，过滤，取续滤液，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016mg、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
2、HPLC指纹图法
色谱条件为：Agilent C18 5μm色谱柱，流动相乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长254nm，进样量10μL，梯度洗脱60min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：精密称取吴茱萸药材粉末0.3g，置50mL具塞锥形瓶中，加入70％乙醇30mL，称定重量，超声提取60min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
实施例13检测方法
1、一测多评法
色谱条件：色谱柱为AgilentC18，5μm柱，流动相为乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长344nm，进样量10μL，梯度洗脱45min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：取吴茱萸药材粉末0.3g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入100％乙醇60mL，称定重量，超声90min放冷，补足重量，过滤，取续滤液，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016mg、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
2、HPLC指纹图法
色谱条件为：Agilent C18 5μm色谱柱，流动相乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长296nm，进样量10μL，梯度洗脱60min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：精密称取吴茱萸药材粉末0.3g，置50mL具塞锥形瓶中，加入100％乙醇60mL，称定重量，超声提取90min，放冷，用100％乙醇补足减失的重量，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
实施例14检测方法
1、一测多评法
色谱条件：色谱柱为AgilentC18，5μm柱，流动相为乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长360nm，进样量10μL，梯度洗脱45min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：取吴茱萸药材粉末0.3g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇60mL，称定重量，超声30min放冷，补足重量，过滤，取续滤液，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016mg、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
2、HPLC指纹图法
色谱条件为：Agilent C18 5μm色谱柱，流动相乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长296nm，进样量10μL，梯度洗脱60min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：精密称取吴茱萸药材粉末0.3g，置50mL具塞锥形瓶中，加入70％乙醇30mL，称定重量，超声提取60min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
实施例15检测方法
1、一测多评法
色谱条件：色谱柱为AgilentC18，5μm柱，流动相为乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长360nm，进样量10μL，梯度洗脱45min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：取吴茱萸药材粉末0.3g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇60mL，称定重量，超声90min放冷，补足重量，过滤，取续滤液，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016mg、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
2、HPLC指纹图法
色谱条件为：Agilent C18 5μm色谱柱，流动相乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长401nm，进样量10μL，梯度洗脱60min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：精密称取吴茱萸药材粉末0.3g，置50mL具塞锥形瓶中，加入70％乙醇30mL，称定重量，超声提取30min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
为了进一步验证本发明的科学性及有效性，发明人进行了一系列的试验，具体如下：
实验例1吴茱萸一测多评方法学的建立
1仪器与材料
1.1仪器：
赛默飞高效液相色谱仪(型号：UltiMate3000，赛默飞)；日本岛津高效液相色谱仪(型号：LC-20AT，日本岛津)；三用紫外仪(型号：ZF-2型，上海市安亭电子仪器厂)；千分之一电子天平(型号：JT5003，余姚市金诺天平仪器公司)；数显恒温水浴锅(型号：HH-2，常州澳华仪器有限公司)；万分之一电子分析天平(型号：ME204E，上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，十万分之一电子分析天平(型号：AUW220D，苏州岛津仪器有限公司)；高速万能粉碎机(型号：LDP-150，浙江永康市红太阳机电有限公司)；真空干燥箱(型号：DZ-2BC，天津市泰斯特仪器有限公司)
1.2材料
吴茱萸鲜药材购于贵州省遵义市余庆县黔龙药业吴茱萸药材种植基地，经贵阳中医学院生药教研室魏升华教授鉴定为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth的近成熟果实。
去氢吴茱萸碱对照品(批号：67909-49-3)、柠檬苦素对照品(批号：1180-71-8)、吴茱萸碱对照品(批号：518-17-2)、吴茱萸次碱对照品(批号：84-26-4)、吴茱萸新碱对照品(批号：15266-38-3)，均购于贵州迪大生物科技有限责任公司，以上对照品均供含量检测用。
甲醇(色谱纯，天津科密欧公司)；乙腈(色谱纯，天津科密欧公司)；水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。
1.3统计软件
本实验采用SPSS16.0软件进行统计分析。
2方法与结果
2.1吴茱萸质量评价指标的确立
本实验涉及去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱5种成分，在考察时会造成数据处理的繁琐，因此，本实验选择以这5种成分的综合含量进行评价。通过查阅相关资料，从5种成分的含量、功效等方面考虑，对5种成分进行加权，权重比例为去氢吴茱萸碱:柠檬苦素:吴茱萸碱:吴茱萸次碱:吴茱萸新碱＝1:2:3:3:1。
2.2一测多评方法学考察
2.2.1色谱条件的优选
2.2.1.1检测波长的选择
实验利用紫外可见分光光度计对样品试液进行190～800nm全波长扫描，结果见图1，根据紫外波长扫描结果以及查阅相关文献，本实验选择对紫外吸收较大的215nm、254nm、344nm、360nm四个检测波长进行供试品溶液的色谱峰检测，优选出最佳波长，结果见图2。
由实验结果表明，去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的混合标准液在215nm处五个成分都相继检测出，所得色谱峰峰面积都相对较大，分离度好，峰形尖锐对称，所以选择215nm作为去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量测定的检测波长。
2.2.1.2色谱柱的选择
取同一批吴茱萸样品提取液，依次采用不同色谱柱，见表1，考察其对去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的分离效果，如图3。
表1实验中采用的色谱柱
由图可知，WondaSiL C18柱测得的色谱峰峰面积较小；Alltima C18柱测得的色谱峰漂移较大，基线不稳定；Agilent C18柱测得的各成分峰面积相对较高，基线较平稳，峰形对称，分离度好，故优先选用Agilent C18柱作为本实验的色谱柱。
2.2.1.3流动相的选择
分别比较甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.02％磷酸水、乙腈-0.1％醋酸水对去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的分离效果。如图4。
由图4可知，吴茱萸样品在以甲醇-水、乙腈-0.1％醋酸水作为流动相时，色谱峰出峰较少，基线不稳定，产生漂移；以乙腈-水为流动相，未检测到去氢吴茱萸碱的色谱峰；在采用乙腈-0.02％磷酸水溶液作为流动相时可看到去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱5种成分都相继检测出，峰面积都相对较大，且分离度好，峰形尖锐对称，基线平稳。故流动相优先选择为乙腈-0.02％磷酸水溶液。
2.2.1.4流动相梯度洗脱程序的选择
本实验通过考察调整乙腈-0.02％磷酸水溶液的不同比例，最终确定的洗脱程序见表2，吴茱萸供试品主要色谱峰达到较为良好的分离。
表2流动相洗脱程序
2.2.1.5色谱条件的确定
通过上述实验结果，确定最终色谱条件为：色谱柱为AgilentC18，5μm柱，流动相为乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长215nm，进样量10μL，梯度洗脱45min。此条件下，测得的吴茱萸混合对照品溶液，吴茱萸药材样品HPLC图谱，见图5。
2.2.2提取工艺的优选
2.2.2.1提取溶剂的选择
取吴茱萸粉末约0.3g，精密称定，参照2015版《中国药典》，分别以70％甲醇和70％乙醇进行提取。以考察甲醇、乙醇作为提取的溶剂对吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱提取的影响。结果见表3。
表3不同提取溶剂含量表
经t检验，以70％甲醇和70％乙醇进行提取时，吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱综合含量之间的P值为0.000，70％乙醇提取时，综合含量较高，且从安全性的角度考虑，本实验优先选择用70％乙醇进行提取。
2.2.2.2提取溶剂比例的选择
经查阅相关文献资料，本实验分别以40％、70％、100％乙醇作为溶剂考察对吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的影响。见表4。
表4不同溶剂比例提取吴茱萸各成分含量表
经方差分析，以40％、70％、100％乙醇作为溶剂时所得的去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱综合含量之间的P值为0.000，70％乙醇作为提取溶剂，综合含量最高，实验优先选用70％乙醇作为提取溶剂。
2.2.2.3提取方法的选择
以文献中查阅的方法为依据，进行提取方法的考察。以超声提取和回流提取做对比。取吴茱萸粉末，每份约0.3g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，各加入70％乙醇30mL，称重，分别进行回流提取、超声提取，各提取30min，放冷，称定，补重，取续滤液以0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
分别比较两种提取方法下吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的含量，见表5。
表5不同提取方法吴茱萸各成分含量表
经t检验，进行回流提取、超声提取时去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱综合含量之间的P值为0.000，且以超声提取为高，故优先选择超声提取。
2.2.2.4料液比的选择
本实验对比不同料液比的提取溶剂对吴茱萸进行提取，分别考察料液比为1:50、1:100、1:200对去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量提取的影响。结果见表6。
表6不同料液比吴茱萸含量表
经方差分析，料液比为1:50、1:100、1:200时提取的去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱综合含量之间的P值为0.005，且料液比为1:100时综合含量较高，故优先选择1:100为最佳料液比。
2.2.2.5提取时间的选择
为了得到较好的提取效果，经查阅相关文献资料，本实验分别考察超声提取30min、60min、90min对去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的影响，其测定结果见表7。
表7不同提取时间吴茱萸含量表
经方差分析，在上述不同提取时间所得的结果中，吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱综合含量P值为0.168，没有显著性差异，为了节约成本和时间，减小干扰因素。本实验优先以超声30min来进行提取。
2.2.2.6提取工艺正交试验考察
根据单因素考察的结果，选择以溶剂比例、料液比和提取时间为考察因素，分别取三个水平进行考察。采用L9(34)正交试验表设计试验方案，试验设计见表8。取吴茱萸粉末9份，每份各约0.3g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，按提取工艺正交试验计划表加入不同浓度不同用量的乙醇，称定重量。超声提取不同时间，放冷，称定重量，用相应溶剂比例的乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液以0.45μm微孔滤膜滤过，即得。结果见表9、10。
表8提取工艺正交试验因素水平表
表9提取工艺正交试验设计表及直观分析表
表10正交试验方差分析表
结论：经表可知，因素R1>R2>R3，即料液比>溶剂比例>提取时间，优选的提取方法为A2B2C2，即得到提取的最佳工艺是溶剂倍数1:100，用70％乙醇提取，超声60min为最佳，但是提取时间对吴茱萸各成分提取的影响不大，为了节省时间，故本次试验最终的提取工艺优先为加入30mL70％乙醇，超声提取30min。
2.2.3对照品溶液的制备
分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016mg、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
2.2.4供试品溶液的制备
取吴茱萸药材粉末约0.3g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇30mL，称定重量，超声30min放冷，补足重量，过滤，取续滤液，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
2.2.5线性关系考察
精密吸取吴茱萸混合对照品溶液1μL、4μL、7μL、10μL、13μL、16μL、19μL注入高效液相色谱仪中，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，进样量(μg)为横坐标(X)进行线性回归。结果见表11～15。得去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱回归方程分别为:y＝65.598x-1.4687(r＝0.9999)、y＝9.3915x-0.0159(r＝0.9999)、y＝134.85x-6.4854(r＝0.9997)、y＝116.29x-2.4592(r＝0.9999)、y＝62.485x-2.2224(r＝0.9999)，结果表明去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱分别在0.2～3.8μg、1.016～19.304μg、0.26～4.94μg、0.154～2.926μg、0.224～4.256μg范围内线性关系良好。
表11去氢吴茱萸碱的标准曲线绘制数据(n＝7)
表12柠檬苦素的标准曲线绘制数据(n＝7)
表13吴茱萸碱的标准曲线绘制数据(n＝7)
表14吴茱萸次碱的标准曲线绘制数据(n＝7)
表15吴茱萸新碱的标准曲线绘制数据(n＝7)
2.2.6精密度试验
精密吸取吴茱萸同一供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次。去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的RSD值分别为2.39％、0.76％、0.83％、0.64％、1.01％，结果见表16及图6表明实验所用仪器精密度良好。
表16吴茱萸精密度实验结果
2.2.7稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进行测定，测得去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的RSD值分别为1.40％、1.67％、0.36％、0.59％、1.09％。结果见表17及图7，表明吴茱萸供试品溶液在24h内稳定。
表17吴茱萸稳定性实验结果
2.2.8重复性试验
精密称取同一批次的吴茱萸药材粉末6份，每份约0.3g，按“2.2.4”项下制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。测得去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的RSD值分别为1.27％、1.21％、0.37％、0.72％、1.22％，结果见表18及图8，表明本实验方法重复性良好。
表18吴茱萸重复性实验结果
2.2.9加样回收试验
精密称取6份已知含量的吴茱萸药材粉末，每份约0.15g，加入适量对照品，按“2.2.4”项下制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。测得去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的平均加样回收率分别为100.79％、99.82％、102.54％、99.66％、99.69％，RSD值分别为1.79％、2.02％、1.56％、1.13％、1.44％。结果见表19～23，表明该方法准确可行。
表19去氢吴茱萸碱加样回收率结果
表20柠檬苦素加样回收率结果
表21吴茱萸碱加样回收率结果
表22吴茱萸次碱加样回收率结果
表23吴茱萸新碱加样回收率结果
2.2.10相对校正因子的计算
取吴茱萸混合对照品溶液，分别进样1μL、4μL、7μL、10μL、13μL、16μL、19μL进行测定。以吴茱萸次碱为内标，计算去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸新碱的相对校正因子。结果见表24。
表24去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸新碱的相对校正因子
结果表明：以吴茱萸次碱为内标，测得的去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸新碱的相对校正因子分别为0.5665、0.0830、1.1550、0.5349。其RSD值均小于5％。
2.2.11校正因子的重复性考察
2.2.11.1色谱柱及高效液相色谱仪考察
取吴茱萸混合对照品溶液，进样10μL，考察赛默飞UltiMate 3000、岛津LC-20AT两种高效液相色谱系统和Agilent C18柱(4.6mm×250mm，5μm)、ACE C18柱(4.6mm×250mm，5μm)2种色谱柱，分别计算去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸新碱的相对校正因子。结果见表25。
表25不同仪器和不同色谱柱测得的相对校正因子
结果表明：去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸新碱在不同仪器和不同色谱柱所测得相对校正因子的RSD值均小于5％，不同仪器和色谱柱对相对校正因子的影响较小。
2.2.1 1.2待测组分色谱峰的定位
利用待测组分与内参物的相对保留值定位，已知内参物的保留时间，根据相对保留值，同时结合紫外吸收特征，判断所需目标峰的位置。结果见表26。
表26不同仪器和不同色谱柱下目标成分的相对保留值
结果表明：通过不同仪器和色谱柱测得的各成分间相对保留值的RSD值均小于5％。因此，在对照品不易得到时，可以通过内参物的保留时间，根据相对保留值和各成分色谱峰的紫外吸收特征来判断所需目标峰的峰位置。
2.2.12一测多评法与外标法测得结果的比较
取吴茱萸产地加工制得的9批样品，按“2.2.3”项下制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。通过外标法和一测多评法分别计算吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的含量，结果见表27。
表27外标法和QAMS测定吴茱萸中5种成分的质量分数(n＝3)
结果表明：外标法和一测多评法测得的去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的含量间的RSD值在5％之内，表明两种含量测定方法测得的各成分含量值之间差异不大，说明在吴茱萸中应用一测多评法进行质量评价是可行的。
3结论与讨论
3.1内参物的选择
本实验建立了吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱5种成分的“一测多评”测定法，同时证明了其可行性。吴茱萸次碱色谱峰峰形对称，无拖尾现象，周围杂质峰的干扰较小，通过相对校正因子计算吴茱萸样品中其他4种成分的含量与外标法测得的结果误差小，当采用其他4种成分作为内标物时计算得的成分含量与外标法相比误差较大，因此本实验选择吴茱萸次碱做为内标物。
3.2流动相的选择
本实验分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.02％磷酸水、乙腈-0.1％醋酸水4种流动相。实验发现当采用甲醇-水作为流动相时色谱峰出峰时间较长，延长了分析时间，可能造成色谱峰在色谱柱内的自身峰展宽；而采用乙腈-水作为流动相时，去氢吴茱萸碱未出峰，可能是由于去氢吴茱萸碱在流动相中未游离出来，而流动相中加入磷酸后即检测到；采用乙腈-0.1％醋酸水作为流动相时，基线波动较大，色谱峰峰形不稳，采用乙腈-0.02％磷酸水时基线平稳，峰形对称，分离效果较好。
3.3质量评价
本实验分别采用外标法和QAMS法同时测定9批吴茱萸不同加工方法样品的含量。实验结果表明，吴茱萸各成分含量间的相对标准偏差均小于5％，两种测定方法的差异不大，应用一测多评法进行质量评价是可行的。实验同时发现，当药材中成分含量较小时，其相对标准偏差逐渐增大，因此当药材中成分含量较小时，不建议采用QAMS法进行测定。
实验例2吴茱萸产地加工与炮制一体化工艺的优选
1仪器与材料
1.1仪器
参照实验例1“1.1”项下实验仪器。
1.2材料
参照实验例1“1.2”项下实验材料。
2方法与结果
2.1吴茱萸产地加工工艺的优化
2.1.1样品制备
2.1.1.1阴干法
将吴茱萸鲜药材置于阴凉通风处阴干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
2.1.1.2晒干法
将吴茱萸鲜药材置于太阳下晒干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
2.1.1.3烘干法
将吴茱萸药材置于不同干燥箱内40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃烘干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
2.1.2样品含量测定
按实验例1“2.2.4”项制备供试品溶液，“2.2.1”项下色谱条件进行测定。分别测定不同产地加工方法吴茱萸样品中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的含量，以此来判断不同产地加工方法对吴茱萸药材中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的影响。测定结果见表28。
表28吴茱萸不同加工方法样品含量测定表(n＝3)
将结果进行方差分析，不同加工方法的吴茱萸样品去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的P值均为0.000，综合含量的P值为0.000。表明不同的加工方法对吴茱萸5种指标性成分的含量有显著性影响。其中，40℃烘干时，吴茱萸中吴茱萸次碱含量最高，50℃烘干时，吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸新碱的含量最高。综合含量以50℃烘干最高。
2.1.3讨论
本实验结果表明，不同的加工方法对吴茱萸药材中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的影响较大。当温度逐渐升高时，各成分的含量均有明显下降的趋势。吴茱萸中含有挥发油类成分，因此不建议采用高温进行加工。实验表明，在50℃烘干时，吴茱萸各成分综合含量最高，为吴茱萸的产地加工方法提供了依据。
2.2吴茱萸传统炮制工艺的优化
2.2.1甘草用量的考察
分别考察吴茱萸药材与辅料甘草用量比为100:2、100:4、100:6、100:8、100:10时，对去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的影响。按实验例2.2.4”项制备供试品溶液，“2.2.1”项色谱条件下进样检测，其结果见表29。
表29甘草用量考察表(n＝3)
经方差分析，甘草不同用量吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱综合含量的P值为0.000。表明不同辅料用量对吴茱萸各成分的含量有显著性影响。每100kg吴茱萸，用甘草6kg时，各成分综合含量最高。
2.2.2甘草煮制时间的考察
分别考察甘草煮制20min、40min、60min对吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的影响。按实验例1“2.2.4”项制备供试品溶液，“2.2.1”项色谱条件下进样检测，其结果见表30。
表30甘草煮制时间考察表(n＝3)
经方差分析，甘草不同煮制时间吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱综合含量的P值为0.000。表明甘草不同煮制时间对吴茱萸各成分的含量有显著性影响。甘草煮制20min时，各成分综合含量最高。
2.2.3闷润时间的考察
分别考察吴茱萸加甘草汁闷润1h、2h、3h、4h、5h对吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的影响。按实验例1“2.2.4”项制备供试品溶液，“2.2.1”项色谱条件下进样检测，其结果见表31。
表31闷润时间考察表(n＝3)
经方差分析，甘草汁不同闷润时间吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱综合含量的P值为0.000。表明甘草汁不同闷润时间对吴茱萸各成分的含量有显著性影响。甘草汁闷润3h时，各成分综合含量最高。
2.2.4炮制温度的考察
分别考察吴茱萸炮制温度在120℃～140℃、140℃～160℃、160℃～180℃、180℃～200℃之间时对吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的影响。按实验例1“2.2.4”项制备供试品溶液，“2.2.1”项色谱条件下进样检测，其结果见表32。
表32炮制温度考察表(n＝3)
经方差分析，不同炮制温度下吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱综合含量的P值为0.000。表明不同炮制温度对吴茱萸各成分的含量有显著性影响。炮制温度在140℃～160℃之间时，各成分综合含量最高。
2.2.5炮制时间的考察
分别考察吴茱萸炮制时间2min、4min、6min、8min、10min时对吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的影响。按实验例1“2.2.4”项制备供试品溶液，“2.2.1”项色谱条件下进样检测，其结果见表33。
表33炮制时间考察表(n＝3)
经方差分析，不同炮制时间下吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱综合含量的P值为0.000。表明不同炮制时间对吴茱萸各成分的含量有显著性影响。炮制时间为6min时，各成分综合含量最高。
2.2.6正交设计优选吴茱萸的炮制工艺
根据单因素考察的结果，选择以甘草用量、闷润时间、炮制温度、炮制时间为考察因素，分别取三个水平进行考察。采用L9(34)正交试验表设计试验方案，见表34，以去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的含量作为测评指标，优选出吴茱萸最佳的炮制工艺。结果见表35、36。
表34提取工艺正交试验因素水平表
表35 L9(34)正交试验表及直观分析表
表36正交试验方差分析表
结论：经表可知，因素R2>R1>R3>R4，即闷润时间>甘草用量>炮制温度>炮制时间，优选的炮制工艺为A3B1C2D4，本次实验得到吴茱萸炮制的最佳工艺以每100kg吴茱萸，用甘草8kg、闷润2h、炮制温度140℃～160℃之间、炮制时间为8min为最佳。
2.2.7样品测定
按上述炮制工艺优化的最佳条件制备吴茱萸不同加工方法的炮制品，精密称取吴茱萸药材粉末约0.3g，按实验例1“2.2.4”项制备供试品溶液，“2.2.1”项色谱条件下进样检测。并与生品饮片进行对比研究，见表37。
表37吴茱萸不同加工方法炮制品含量测定表(n＝3)
经方差分析，吴茱萸不同加工方法所得的炮制品中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的P值均为0.000，综合含量的P值为0.000。表明吴茱萸不同加工方法所得炮制品中5种成分的含量存在显著性差异。40℃烘干炮制品中去氢吴茱萸碱、吴茱萸次碱的含量最高，50℃烘干炮制品中柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸新碱的含量最高。综合含量以50℃烘干炮制品最高。
将吴茱萸不同加工方法所得的生品、炮制品含量进行方差分析，吴茱萸不同加工方法所得的生品、炮制品中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的P值均为0.000，综合含量的P值为0.000。表明吴茱萸炮制前后5种成分的含量存在显著性差异，且各成分的含量均呈下降趋势。
2.2.8讨论
吴茱萸炮制过后其去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱吴茱萸新碱的含量与生品相比均有所降低。可能是闷润时，吴茱萸中部分化合物溶出，导致炮制后成分含量降低；也可能是炮制过程中温度较高，部分化合物分解，从而使其含量降低。
2.3吴茱萸产地加工与炮制一体化研究
2.3.1吴茱萸一体化炮制与传统炮制饮片含量对比
取吴茱萸鲜药材，按上述优化的炮制工艺进行炮制，并与传统炮制饮片进行对比研究。以去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的含量作为评测指标，比较吴茱萸一体化炮制与传统炮制饮片之间的差异。结果见表38。
表38吴茱萸鲜品炮制与传统炮制样品含量测定表(n＝3)
经t检验，吴茱萸一体化炮制与传统炮制饮片中，去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的P值分别为0.519、0.205、0.158、0.069、0.057，综合含量的P值为0.374。表明吴茱萸一体化炮制与传统炮制所得饮片中吴茱萸各成分的含量之间无显著性差异。
2.3.2讨论
吴茱萸一体化炮制所得饮片与传统炮制饮片中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的含量无显著性差异。表明吴茱萸一体化炮制技术具有可行性。
3结论与讨论
吴茱萸传统的产地加工方法为晒干或者微火烘干。本实验通过采用晒干、阴干、不同温度烘干等加工方法，对吴茱萸产地加工工艺进行了优化。结果表明，加工方法对吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的含量有较大的影响，烘干法相对优于晒干法和阴干法。当温度逐渐升高时，吴茱萸中5种主要成分的含量都有所下降。因此吴茱萸在加工过程中，应注意控制其烘干温度。
吴茱萸药典炮制方法为甘草制，本实验对甘草制吴茱萸传统炮制工艺进行了优化。结果表明，甘草不同用量、煮制时间、甘草汁闷润时间、不同炮制温度和炮制时间均对吴茱萸中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的含量有显著性的影响。甘草汁作为常用的药用辅料，主要起缓和药性，降低毒性的作用。吴茱萸在炮制过后，5种成分的含量均呈下降趋势。推测可能是闷润过程中，吴茱萸部分成分溶出，或者是炮制温度较高，导致其部分化合物分解。
产地加工与炮制一体化技术将鲜药材直接加工成饮片，可以缩短加工工序，节约成本，操作性强。本实验通过吴茱萸鲜品一体化炮制与传统炮制所得饮片的对比研究，表明两者中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的含量无显著性差异。表明吴茱萸一体化炮制技术具有可行性。
实验例3吴茱萸HPLC指纹图谱研究
1实验材料
1.1仪器
参照实施例1“1.1”项下实验仪器。
1.2材料
分别收集我国不同地区的吴茱萸药材，见表39，再经贵阳中医学院生药教研室魏升华教授鉴定。
表39吴茱萸药材样品来源
其余参照实验1“1.2”项下实验材料。
1.3评价软件
中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统2012版(国家药典委员会)。
2方法与结果
2.1色谱条件的优选
2.1.1波长的选择
本实验通过紫外可见分光光度计全波长扫描吴茱萸样品，结合文献及紫外全波长扫描结果，实验选择了215nm、242nm、254nm、296nm、401nm五个波长进行测定，见图9及10。
根据图谱，在215nm检测波长下基线较稳定，呈现的吸收峰较多，峰面积相对较大，分离度好，峰形对称，所以选择215nm作为吴茱萸HPLC指纹图谱的检测波长。
2.1.2色谱柱的选择
先后对规格均为250×4.6mm，Agilent C18 5μm柱、WondaSil C18 5μm柱、AlltimaC18 5μm柱和ACE C18 5μm柱进行考察，根据不同柱间指纹图谱的差异，选择出对吴茱萸样品分离效果较好的色谱柱。见图11。
由图11可见，WondaSil C18测得的峰面积较小；ACE C18柱测得的峰形相对较好，但测得吴茱萸新碱的峰存在前拖尾现象；Alltima C18柱测得的峰形对称性较差，基线不稳定；Agilent C18柱测得的各色谱峰峰面积相对较高，基线较平稳，峰形对称，所得色谱峰较多，因此优先选用Agilent C18柱作为本实验色谱柱。
2.1.3流动相的选择
根据所查阅的相关文献以及《中国药典》本实验选择对比较甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.02％磷酸水、乙腈-0.1％冰醋酸水进行考察，根据试验结果选择最佳的流动相，见图12。
由图12可见，以甲醇-水、乙腈-0.1％醋酸水溶液进行梯度洗脱所得色谱图，基线漂移较大，以乙腈-水进行梯度洗脱测得的色谱峰峰面积较小，采用乙腈-0.02％磷酸水溶液进行梯度洗脱所得的色谱图，色谱峰较多且峰面积较大，分离效果好，基线平稳，故最终优先选用乙腈-0.02％磷酸水溶液作为实验所用流动相。
2.1.4流动相梯度洗脱程序的选择
根据查阅相关文献及2.1.3项试验结果，再进行流动相梯度洗脱程序的考察，最终确定的洗脱程序见表40。
表40流动相洗脱程序
2.1.5吴茱萸指纹图谱测定的最佳条件
通过上述实验结果，确定最终色谱条件为：Agilent C18 5μm色谱柱，流动相乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长215nm，进样量10μL，梯度洗脱60min。此条件下，测得的吴茱萸混合对照品溶液、吴茱萸药材样品HPLC图谱，见图13。
2.2提取条件的优选
2.2.1提取溶剂的考察
经查阅文献资料，本实验分别以70％甲醇、70％乙醇作为提取溶剂进行了考察。见图14。
由图14可知乙醇与甲醇作为提取溶剂无明显差异，乙醇相对较为安全，故选用乙醇作为提取溶剂。
2.2.2提取溶剂比例的考察
经查阅文献资料，本实验分别以40％、70％、100％乙醇作为溶剂进行考察。
由图15可知，70％乙醇所得的吴茱萸色谱图分离度相对较好，峰面积较大，其结果优于其它溶剂条件，故优先选择70％乙醇进行提取。
2.2.3提取方法的优选
取吴茱萸药材粉末各约0.3g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇30mL，称定重量后，分别进行超声、回流30min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，过滤。根据所检测的高效液相色谱结果，选择出最佳提取方法。见图16。
由图16可知，超声提取与回流提取无明显差异，为了操作方便，本实验选择超声提取。
2.2.4提取时间的选择
为了得到较好的提取效果，经查阅相关文献资料，本实验分别对超声提取30min、60min、90min进行了考察。见图17。
由图17可知，超声提取时间对吴茱萸指纹图谱色谱图无明显差异，为了操作方便，节约时间，所以选择超声提取30min。
2.2.5提取条件的确定
取吴茱萸药材粉末约0.3g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，加入30mL70％乙醇溶液，称重，超声提取30min，放冷，补足减失重量。滤过，弃去初滤液，续滤液以0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。
2.2.6对照品溶液的制备
分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016mg、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
2.2.7供试品溶液的制备
精密称取吴茱萸药材粉末0.3g，置50mL具塞锥形瓶中，加入70％乙醇30mL，称定重量，超声提取30min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
2.3方法学考察
2.3.1精密度试验
取吴茱萸药材粉末依照“2.2.7”项下制备供试品溶液，按“2.1.5”项色谱条件下，连续进样6次，并记录指纹图谱，测定结果见表41、42，通过指纹图谱相似度评价软件，进行峰匹配，所得图谱之间相似度在0.991～0.999之间，均大于0.900，符合指纹图谱的要求。表明该仪器精密度良好。见图18。
表41吴茱萸指纹图谱精密度试验
表42精密度试验共有峰相对峰面积
2.3.2稳定性试验
取吴茱萸药材粉末依照“2.2.7”项下制备供试品溶液，按“2.1.5”项色谱条件下，分别在0、2、4、8、12、24h进样，测定指纹图谱，测定结果见表43、44，通过指纹图谱相似度评价软件，进行峰匹配，所得图谱之间相似度在0.944～1.000之间，均大于0.900，可见其符合指纹图谱的要求。表明24小时内样品溶液的成分稳定。见图19。
表43吴茱萸指纹图谱稳定性试验
表44稳定性试验共有峰相对峰面积
2.3.3重复性试验
取吴茱萸药材粉末6份，并依照“2.2.7”项下制备供试品溶液，按“2.1.5”项色谱条件下，分别进样并记录指纹图谱。测定结果见表45、46，通过指纹图谱相似度评价软件，进行峰匹配，所得图谱之间相似度在0.995～1.000之间，均大于0.900，可见其符合指纹图谱的要求。表明此方法重复性良好。见图20。
表45吴茱萸指纹图谱重复性试验
表46重复性试验共有峰相对峰面积
2.4吴茱萸药材HPLC指纹图谱的建立及技术参数
2.4.1吴茱萸药材HPLC指纹图谱的比较和分析
使用“1.2项”下采集于我国不同地区的12批吴茱萸药材为材料，按照“2.2.7”项下制备供试品溶液，按“2.1.5”项色谱条件下，记录HPLC指纹图谱，然后将12批药材的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统2012版(国家药典委员会)。进行色谱峰匹配，并生成对照指纹图谱，以建立的共有模式为参照图谱计算1～12批样品的相似度。从相似度数据(表47)和图21中可以看出不同地区的吴茱萸药材相似度在0.294～0.995之间，差异较大，说明不同产地的吴茱萸所含化学成分差异较大。
对不同的供试品色谱图的检测结果进行比较，本实验标定了10个指纹图谱中的共有峰，见图22，与混合对照品的指纹图谱进行比对，确认了3号峰为去氢吴茱萸碱、5号峰为柠檬苦素、6号峰为吴茱萸碱、7号峰为吴茱萸次碱、10号峰为吴茱萸新碱。
表47 12批吴茱萸药材指纹图谱相似度分析结果
2.4.2吴茱萸药材参照峰的标定
通过对12批不同产地吴茱萸药材指纹图谱的测定结果进行比较，确定了10个色谱峰为共有峰，并选择了6号峰吴茱萸碱作为参照峰。在吴茱萸药材指纹图谱中吴茱萸碱保留时间适宜，峰形较稳定，吴茱萸碱也是吴茱萸药材的主要成分之一，对照品易于购买，因此选定吴茱萸碱为参照物。
表48 12批吴茱萸药材HPLC指纹图谱共有峰的相对峰面积
2.5吴茱萸药材HPLC指纹图谱的比较
2.5.1不同加工方法的吴茱萸药材与吴茱萸药材共有模式的比较
将不同加工方法的吴茱萸样品测定的HPLC指纹图谱导入指纹图谱相似度评价系统软件，进行色谱峰自动匹配，并与建立的共有模式进行比对，叠加指纹图谱见图23，对不同加工方法的吴茱萸样品的指纹图谱进行相似度评价，结果见表49、50。
表49不同加工方法吴茱萸药材HPLC指纹图谱相似度分析结果
表50不同加工方法吴茱萸药材HPLC指纹图谱共有峰的相对峰面积
结果表明，不同加工方法的吴茱萸样品指纹图谱相似度均在0.900以上，相似度良好，说明不同加工方法的吴茱萸样品整体化学成分具有高度的一致性。
2.5.2不同加工方法的吴茱萸药材炮制品与吴茱萸药材共有模式的比较
将不同加工方法的吴茱萸样品的炮制品测定的HPLC指纹图谱导入指纹图谱相似度评价系统软件，进行色谱峰自动匹配，并与建立的共有模式进行对比，结果见表51、52，图24。
表51不同加工方法吴茱萸药材炮制品HPLC指纹图谱相似度分析结果
表52不同加工方法吴茱萸药材炮制品HPLC指纹图谱共有峰的相对峰面积
结果表明，不同加工方法的吴茱萸药材炮制品指纹图谱相似度均在0.900以上，相似度良好，说明吴茱萸药材炮制品整体化学成分具有高度的一致性。
2.5.3不同加工方法的吴茱萸药材生品、炮制品与吴茱萸药材共有模式的比较
将不同加工方法制得的吴茱萸样品的生品、炮制品测定的HPLC指纹图谱导入指纹图谱相似度评价系统软件，进行色谱峰自动匹配，并与建立的共有模式进行对比，结果见表53、54，图25。
表53不同加工方法吴茱萸药材生品、炮制品HPLC指纹图谱相似度分析结果
表54不同加工方法吴茱萸药材生品、炮制品HPLC指纹图谱指纹图谱共有峰的相对峰面积
从表中得知，不同加工方法得到的吴茱萸药材生品以及炮制品的指纹图谱相似度均在0.900以上，相似度良好，表明吴茱萸炮制前后其化学成分具有高度的一致性。
2.5.4吴茱萸鲜品一体化炮制品、传统炮制品与吴茱萸药材共有模式的比较
将吴茱萸鲜品一体化炮制品、传统炮制品测定的HPLC指纹图谱导入指纹图谱相似度评价系统软件，进行色谱峰自动匹配，并与建立的共有模式进行对比，结果见表55、56，图26。
表55吴茱萸一体化炮制与传统炮制HPLC指纹图谱相似度分析结果
表56吴茱萸一体化炮制与传统炮制HPLC指纹图谱指纹图谱共有峰的相对峰面积
结果表明，吴茱萸一体化炮制饮片与传统炮制饮片相似度在0.900以上，两者之间主要化学成分具有高度的一致性。
3结论与讨论
3.1色谱条件的选择及优化
在检测波长的选择中，通过紫外波长扫描的结果，选择了215nm、242nm、254nm、296nm、401nm5个波长进行HPLC色谱图比较分析，结果各成分在215nm处波长下有较大吸收。因此，将其作为检测波长；在选择流动相系统时，经查阅相关文献，本实验分别以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.02％磷酸水、乙腈-0.1％冰醋酸水进行了梯度洗脱试验，结果表明乙腈-0.02％磷酸水系统进行梯度洗脱效果较好，检测出的色谱峰峰面积较大，峰形好，分离度高。将流动相不同时间洗脱比例调整之后，各色谱峰的保留时间适中，基线平稳，同时色谱峰的分离度也得到了提高，较好的避免了色谱图的拖尾现象。
3.2供试品溶液提取条件的选择
本试验分别比较了不同的提取溶剂、提取溶剂的不同比例、不同提取方法以及不同提取时间的提取效果。除提取溶剂比例对吴茱萸指纹图谱色谱峰影响较大外，其它三个因素均对吴茱萸成分的提取影响不大。本着安全有效、便于操作、节约时间的原则，本次试验选择了以70％乙醇超声30min对吴茱萸样品进行提取。结果表明，该方法稳定可靠，重现性好。
3.3吴茱萸药材HPLC指纹图谱研究
本实验建立了12批吴茱萸药材HPLC指纹图谱的共有模式。从相关系数的分析结果可见，吴茱萸药材不同地区间相似度差异较大，表明产地对吴茱萸的化学成分影响较大。吴茱萸不同加工方法的生品、炮制品及一体化炮制品药材相似度均在0.900以上，表明吴茱萸不同加工方法的生品、炮制品及一体化炮制品药材整体化学成分相对稳定。吴茱萸炮制后毒性降低，而其炮制前后主要成分间未发生明显变化，因此推测吴茱萸炮制减毒的机理可能是炮制使其主要药效成分的含量发生了改变。吴茱萸一体化炮制所得饮片与传统炮制饮片相比，整体化学成分具有高度的一致性，表明吴茱萸产地加工与炮制一体化炮制工艺科学可行。
实验例4吴茱萸产地加工与炮制一体化饮片药效学初步研究
1实验材料
1.1实验动物
KM小鼠，SPF级，体重18±2g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，实验动物合格证号：SCXK(军)2012-0011，分开笼子饲养，自由进食饮水，室温20℃～25℃，相对湿度40％～60％，12小时明暗交替。
1.2药材及试药
吴茱萸饮片：吴茱萸饮片为实验例2中制得的一体化饮片与传统炮制饮片。
大黄、芒硝购于贵阳市万东桥药材市场。
元胡止痛片：批号：20160601，吉林省百年六福堂药业有限公司。
盐酸洛哌丁胺胶囊：批号：170417811，西安杨森制药有限公司。
生理盐水：批号：178040726，辰新药业股份有限公司。
1.3仪器
BHS-6B智能热板仪：北京中慧天诚科技有限公司。
BCD-215KANDZ型冰箱：青岛海尔股份有限公司。
RE-52CS旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。
2方法与结果
2.1药液与试剂的配置
2.1.1受试药样品的制备
吴茱萸饮片药液的制备：分别取实验例2中制得的吴茱萸一体化饮片与传统炮制饮片150g，粉碎，第一次加10倍量水煎煮30min，第二次加8倍量水煎煮30min，过滤，合并滤液，旋转蒸发仪浓缩至750mL作为高剂量组，4℃保存备用；另取吴茱萸一体化饮片与传统炮制饮片150g，按上述方法浓缩至1500mL作为低剂量组，4℃保存备用。
元胡止痛片药液的制备：取元胡止痛片90片(250mg/片)研碎，加水500mL，4℃保存备用。
盐酸洛哌丁胺药液的制备：取盐酸洛哌丁胺胶囊12粒(2mg/粒)，加水600mL，4℃保存备用。
2.2醋酸扭体法
2.2.1实验动物模型的建立
实验采用小鼠醋酸扭体法疼痛模型观察吴茱萸一体化炮制饮片与传统炮制饮片对小鼠的镇痛作用。
2.2.2实验分组与给药
取体重为18～22g的健康KM小鼠96只，适应环境7天后，随机分为6小组，每组各16只，雌雄各半。即空白对照组、阳性对照组、吴茱萸一体化饮片高剂量组、吴茱萸一体化饮片低剂量组、吴茱萸传统炮制饮片高剂量组、吴茱萸传统炮制饮片低剂量组。
2.2.3给药方法
每天灌胃给药1次，连续给药1周，空白对照组灌胃生理盐水，阳性组灌胃元胡止痛片药液，饮片组灌胃吴茱萸药液，实验给药容量均为0.2mL·10g-1。末次小鼠给药1h后，各组腹腔注射1％醋酸溶液0.2mL。观察并记录潜伏时间以及20min内出现的扭体反应动物数和扭体次数。
2.2.4检测的指标与方法
通过观察小鼠在给药后20min内的扭体反应数和扭体次数，并进行统计学处理。研究吴茱萸一体化技术所得饮片与传统炮制方法所得饮片对小鼠的镇痛作用的影响。结果见表57。
镇痛百分率(％)＝(空白组扭体次数-给药组扭体次数)/空白组扭体次数×100％。
表57不同样品对小鼠镇痛作用(扭体法)结果的影响
经方差分析，与空白组相比，阳性对照组、吴茱萸一体化饮片高剂量组、吴茱萸一体化饮片低剂量组、吴茱萸传统炮制饮片高剂量组、吴茱萸传统炮制饮片低剂量组的P值均为0.000，且阳性组与给药组扭体次数均明显低于空白组，表明阳性组与给药组均有良好的止痛作用。实验制备的吴茱萸一体化饮片高低剂量组的P＝0.002，传统炮制饮片高低剂量组的P＝0.005，结果显示给药浓度不同对止痛作用具有极显著的差异，其高浓度剂量效果好于低剂量。吴茱萸一体化饮片高剂量组与传统炮制饮片高浓度剂量组的P＝0.845，吴茱萸一体化饮片低剂量组与传统炮制饮片低剂量组的P＝0.625，表明相同给药浓度下，吴茱萸一体化饮片与传统炮制饮片对小鼠的镇痛作用没有显著差异。
2.3热板法
2.3.1实验动物模型的建立
采用小鼠热板法模型观察吴茱萸一体化加工与传统炮制饮片对小鼠的镇痛作用。
2.3.2实验动物的分组与给药
取体重为18～22g的小鼠(雌)，逐个放在恒温热板仪上，记录小鼠出现舔后足所需时间(s)，凡5s内舔后足或30s后不舔后足者，弃之不用。重复测2次，取平均值作为给药前痛阈值。
取合格的体重为18～22g的健康KM雌性小鼠96只，适应环境7天后，均衡随机分为6组，每组16只。即空白对照组、阳性对照组、吴茱萸一体化饮片高剂量组、吴茱萸一体化饮片低剂量组、吴茱萸传统炮制饮片高剂量组、吴茱萸传统炮制饮片低剂量组。
2.3.3实验给药方法
每天灌胃给药1次，连续给药一周，空白对照组小鼠灌胃生理盐水，阳性药组灌胃元胡止痛片药液，饮片组灌胃吴茱萸药液，给药容量均为0.2mL·10g-1。最后一次给药30min、60min、90min后，观察记录小鼠痛阈值。将60s内无反应的小鼠取出，按60s计。
2.3.4检测的指标与方法
通过观察记录小鼠给药前后的痛阈值，并进行统计学处理。研究吴茱萸一体化技术所得饮片与传统炮制方法所得饮片对小鼠的镇痛作用的影响。结果见表58。
表58不同样品对小鼠痛阈(热板法)结果的影响
经方差分析，与空白组相比，在给药后30min～90min之间，阳性对照组、吴茱萸一体化饮片高剂量组、吴茱萸一体化饮片低剂量组、吴茱萸传统炮制饮片高剂量组、吴茱萸传统炮制饮片低剂量组的P值均为0.000，且阳性组与给药组痛阈值均明显高于空白组，表明阳性组与给药组均有良好的止痛作用。给药后阳性组与给药组随时间的延长，小鼠的痛阈值呈逐渐上升的趋势。时间为90min时，每组痛阈值均最大，方差分析结果显示，一体化饮片高低剂量组的P＝0.000，传统炮制饮片高低剂量组的P＝0.000，表明不同给药浓度的止痛作用差异较为显著性，其高剂量效果好于低剂量。该药材一体化饮片高剂量组与传统炮制饮片高剂量组的P＝0.127，一体化饮片低剂量组与传统炮制饮片低剂量组的P＝0.263，结果显示在相同给药浓度下，吴茱萸一体化饮片与传统炮制饮片对小鼠镇痛作用不具明显差异。
2.4小鼠肠推进实验
2.4.1模型的建立
采用大黄芒硝配伍致小鼠腹泻模型观察吴茱萸一体化加工与传统炮制饮片对实验小鼠小肠运动的作用。
2.4.2实验动物分组与给药
取体重为18～22g的健康KM小鼠96只，适应环境7天后，均衡随机分为6组，每组16只，雌雄各半。即空白对照组、阳性药组、吴茱萸一体化饮片高剂量组、吴茱萸一体化饮片低剂量组、吴茱萸传统炮制饮片高剂量组、吴茱萸传统炮制饮片低剂量组。
2.4.3给药方法
每天灌胃给药1次，连续给药一周，对照组小鼠灌胃生理盐水，阳性组灌胃洛哌丁胺药液，给药组灌胃吴茱萸药液，给药容量均为0.2mL·10g-1。第8天禁食23h，各组小鼠灌服受试药后1h，给予大黄芒硝配伍的试液(生大黄1g·mL-1+芒硝0.5g·mL-1+50％墨汁)0.2mL·10g-1，给药20min后迅速脱颈处死。解剖腹腔并分离肠系膜，取上端至幽门、下端至回盲部的肠管部分，拉直小肠，测量“小肠总长度”(肠管长度)，“墨汁在肠内推进距离”(从幽门至墨汁推进距离的前沿)。计算墨汁推进百分率。
墨汁推进率＝墨汁在肠内推进距离(cm)/小肠全长(cm)*100％
2.4.4指标检测与方法
观察记录各组小鼠的墨汁推进率，并进行统计学处理。研究吴茱萸一体化技术所得饮片与传统炮制方法所得饮片对小鼠的止泻作用的影响。结果见表59。
表59不同样品对小鼠肠推进结果的影响
经方差分析，与空白组相比，阳性对照组、吴茱萸一体化饮片高剂量组、吴茱萸一体化饮片低剂量组、吴茱萸传统炮制饮片高剂量组、吴茱萸传统炮制饮片低剂量组的P值均为0.000，表明阳性组与给药组均有良好的止泻作用。吴茱萸一体化饮片高低剂量组的P值为0.000，传统炮制饮片高低剂量组的P值为0.000，表明不同给药浓度的止泻作用有显著性差异，且高剂量效果好于低剂量。吴茱萸一体化饮片高剂量组与传统炮制饮片高剂量组的P值为0.114，吴茱萸一体化饮片低与传统炮制饮片低剂量组的P值为0.085，表明相同给药浓度下，吴茱萸一体化饮片与传统炮制饮片对小鼠的止泻作用无明显差异。
3结论与讨论
3.1吴茱萸止痛作用研究
本实验通过小鼠热板法、小鼠醋酸扭体法，以扭体次数和痛阈值为指标，对吴茱萸一体化炮制饮片与传统炮制饮片对小鼠镇痛作用的影响。结果表明吴茱萸具有较好的止痛作用，两组饮片均能明显地降低小鼠扭体次数，提高小鼠的痛阈值。在不同给药浓度下，吴茱萸一体化炮制饮片与传统炮制饮片高剂量组的止痛作用均好于低剂量组；在相同给药浓度下，吴茱萸一体化炮制饮片与传统炮制饮片对小鼠的止痛作用则无明显的差异。
3.2吴茱萸止泻作用研究
本实验通过小鼠肠推进实验，以墨汁推进率为指标，研究吴茱萸一体化炮制饮片与传统炮制饮片对小鼠止泻作用的影响。结果表明吴茱萸具有较好的止泻作用，两组饮片均能显著地降低小鼠的墨汁推进率。且在不同给药浓度下，吴茱萸一体化炮制饮片与传统炮制饮片高剂量组的止泻作用均好于低剂量组；在相同给药浓度下，吴茱萸一体化炮制饮片与传统炮制饮片对小鼠的止泻作用无明显差异。
本发明总结：为了优选吴茱萸产地加工与炮制一体化工艺，探讨吴茱萸产地加工与炮制一体化技术的可行性。本发明进行了吴茱萸一测多评方法学、吴茱萸产地加工与炮制工艺、吴茱萸药材HPLC指纹图谱、吴茱萸一体化饮片与传统炮制饮片药效学对比的研究。
本发明以吴茱萸次碱为内参物，通过考察不同仪器、色谱柱去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸新碱对吴茱萸次碱的相对校正因子、相对保留时间，以及外标法与一测多评法的对比，建立吴茱萸含量测定的一测多评法，结果表明，通过外标法测定吴茱萸次碱，并利用相对校正因子测定去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸新碱科学可行，一测多评法能够用于吴茱萸中多种成分的质量评价研究。
在产地加工与炮制一体化技术方面，对吴茱萸产地加工方法进行了优化，结果表明，鲜药材50℃直接烘干时，各成分综合含量最高；对吴茱萸传统炮制工艺进行优化，结果表明，以每100kg吴茱萸，用甘草8kg、闷润2h、炮制温度140℃～160℃之间、炮制8min时各成分综合含量最高。对吴茱萸一体化炮制饮片与传统炮制饮片进行对比研究，表明两者之间各成分含量无明显差异，表明吴茱萸产地加工与炮制一体化技术是可行的。
在吴茱萸指纹图谱研究中，主要建立了吴茱萸药材指纹图谱质量评价参数，对不同加工方法的生品、炮制品及一体化炮制品指纹图谱与12批吴茱萸药材共有模式进行了比较，结果表明吴茱萸不同加工方法的生品、炮制品及一体化炮制品药材相似度均在0.900以上，表明吴茱萸不同加工方法的生品、炮制品及一体化炮制品药材整体化学成分相对稳定。
在吴茱萸一体化饮片与传统炮制饮片药效学对比的研究中，实验通过小鼠热板法、小鼠醋酸扭体法，以扭体次数和痛阈值为指标，表明吴茱萸具有较好的止痛作用，且在相同给药浓度下，吴茱萸一体化炮制饮片与传统炮制饮片对小鼠的止痛作用无明显差异；通过小鼠肠推进实验，表明吴茱萸具有较好的止泻作用，且在相同给药浓度下，吴茱萸一体化炮制饮片与传统炮制饮片对小鼠的止泻作用无明显差异。表明吴茱萸产地加工与炮制一体化技术具有良好的科学性与可行性。
中药材产地加工与炮制一体化技术正在兴起，但有关吴茱萸一体化的研究还未见相关报道。
本实验在现有对吴茱萸研究的基础上，通过吴茱萸一测多评法的建立，以吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素、去氢吴茱萸碱、吴茱萸新碱含量为指标，并且结合指纹图谱以及药效学实验将吴茱萸一体化所得饮片与传统方法炮制的饮片进行对比研究，从整体上系统的研究吴茱萸产地加工与炮制一体化技术。
结果表明，吴茱萸产地加工与炮制一体化技术可行性高，并且产地加工与炮制一体化技术，可缩短其加工环节，操作性强。在未来，可进行中试生产的工艺验证，以验证吴茱萸产地加工与炮制一体化技术应用于产业化生产的可行性。
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虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法，其特征在于,将吴茱萸鲜药材阴干或晒干或烘干。
2.根据权利要求1所述的吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法，其特征在于,所述阴干具体方法为：将吴茱萸鲜药材置于阴凉通风处阴干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
3.根据权利要求1所述的吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法，其特征在于所述晒干具体方法为：将吴茱萸鲜药材置于太阳下晒干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
4.根据权利要求1所述的吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法，其特征在于所述烘干具体方法为：将吴茱萸鲜药材置于不同干燥箱内40℃～100℃烘干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
5.根据权利要求4所述的吴茱萸产地加工与炮制一体化加工方法，其特征在于所述烘干具体方法为：将吴茱萸鲜药材置于不同干燥箱内50℃烘干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。
6.一种用于吴茱萸质量的检测方法，其特征在于，所述检测方法用于检测权利要求1-4任一项所述一体化加工方法制备而出的吴苵萸，其具体方法为：用一测多评法及HPLC指纹图法检测吴苵萸质量。
7.根据权利要求6所述吴茱萸质量的检测方法，其特征在于，所述一测多评法具体方法为：
色谱条件：色谱柱为Agilent C18，5μm柱，流动相为乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长215nm～360nm，进样量10μL，梯度洗脱45min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：取吴茱萸药材粉末0.3g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入40～100％乙醇15～60mL，称定重量，超声30min～90min放冷，补足重量，过滤，取续滤液，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016mg、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
8.根据权利要求7所述的吴茱萸质量的检测方法，其特征在于，所述一测多评法具体方法为：
色谱条件：色谱柱为Agilent C18，5μm柱，流动相为乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长215nm，进样量10μL，梯度洗脱45min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：取吴茱萸药材粉末0.3g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇30mL，称定重量，超声30min放冷，补足重量，过滤，取续滤液，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016mg、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
9.根据权利要求6所述吴茱萸质量的检测方法，其特征在于，所述HPLC指纹图法检测吴苵萸质量具体方法为：
色谱条件为：Agilent C18 5μm色谱柱，流动相乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长215nm～401nm，进样量10μL，梯度洗脱60min，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备：精密称取吴茱萸药材粉末0.3g，置50mL具塞锥形瓶中，加入40～100％乙醇15mL～60mL，称定重量，超声提取30min～90min，放冷，用40～100％乙醇补足减失的重量，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用。
10.根据权利要求9所述吴茱萸质量的检测方法，其特征在于，所述HPLC指纹图法检测吴苵萸质量具体方法为：
色谱条件为：Agilent C18，5μm色谱柱，流动相乙腈-0.02％磷酸水，柱温25℃，流速1mL·min-1，检测波长215nm，进样量10μL，梯度洗脱60min，梯度洗脱程序为：
对照品溶液的制备：分别精密称取去氢吴茱萸碱对照品、柠檬苦素对照品、吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、吴茱萸新碱对照品适量，加甲醇配置成每1mL含去氢吴茱萸碱0.2mg、柠檬苦素1.016mg、吴茱萸碱0.26mg、吴茱萸次碱0.154mg、吴茱萸新碱0.224mg的混合对照品溶液，封存，备用；
供试品溶液的制备：精密称取吴茱萸药材粉末0.3g，置50mL具塞锥形瓶中，加入70％乙醇30mL，称定重量，超声提取30min，放冷，用70％乙醇补足减失的重量，以0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
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