CN112730647A - 一种昆仙胶囊中雷公藤甲素的鉴别及含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物检测技术领域，具体是一种昆仙胶囊中雷公藤甲素的鉴别及含量测定方法。本发明建立了一种采用薄层色谱和高效液相色谱法对昆仙胶囊中的雷公藤甲素进行定性定量分析的技术，解决了原标准中雷公藤甲素难测定，重复性差等难点，专属性，准确性及重现性强，能更加客观、灵敏地反映出产品的质量变化，以有效实现对该制剂中的毒效成分的监测，进一步保证了患者用药的安全性、有效性。

Description

一种昆仙胶囊中雷公藤甲素的鉴别及含量测定方法
技术领域
本发明涉及药物检测技术领域，具体地说，是一种采用薄层色谱和高效液相色谱法对昆仙胶囊中雷公藤甲素进行定性定量分析的方法。
背景技术
昆仙胶囊(Kunxian Capsules，KC)是国家“九五攻关”项目成果转化的中药六类新药，是由昆明山海棠、淫羊藿、枸杞子、菟丝子四味中药组成的纯中药复方制剂，主治类风湿关节炎属风湿痹阻兼肾虚证(Harris E D Jr,Budd R C,Firestein G S,et al.凯利风湿病学[M].第7版,北京:人民卫生出版社,2006)。其中昆明山海棠为君药，具有祛风除湿、活血止血的功效；淫羊藿为臣药，具有补命门、益精气、强筋骨、补肾壮阳的功效；菟丝子和枸杞子为佐药，与淫羊藿协同发挥补肾养血及强精健骨的功效。现代药理学及临床研究发现，KC具有免疫抑制、细胞因子拮抗及抗炎镇痛等作用，与昆明山海棠片等相比，具有不良反应小，疗效显著的优势，尤其在风湿性关节炎，系统性红斑狼疮和强直性脊柱炎等免疫性疾病的治疗中发挥了重要作用(张宁,易无庸.昆仙胶囊临床应用进展[J].中医临床研究,2014,6(7):147-148；Qiu L,Li L,Li B,et al.Kunxian capsules in the treatment ofpatients with ankylosing spondylitis:A randomized placebo-controlled clinicaltrial[J].Trials,2016,337(17):1-7；Lin Q,Li L,He D.Efficacy and safety ofKunXian capsule for treatment of spondyl oarth.Ropathy(SPA)and ankylosingspondylitis(AS):Results of a multi-center randomized placebo-controlled trial[J].Clin Exp Rheumatol,2014,32(5):790-790；Tang Y,Zhang Y,Li L,et al.KunxianCapsule for Rheumatoid Arthritis:Inhibition of Inflammatory Network andReducing Adverse Reactions Through Drug Matching[J].Front Pharmacol.2020,11:485.)，这可能与KC各单味药材中富含生物碱，萜类、黄酮类及糖苷类等多种抗炎镇痛的化学成分密切相关(谢晨琼，周萍，李祥，等.昆明山海棠化学成分及药理作用和临床应用研究进展[J].南京中医药大学,2015,13(46):1996-2010；Chen XJ,Tang ZH,Li XW,etal.Chemical Constituents,Quality Control,and Bioactivity of Epimedii Folium(Yinyanghuo)[J].Am J Chin Med.2015,43(5):783-834；Donnapee S,Li J,Yang X,etal.Cuscuta chinensis Lam.:A systematic review on ethnopharmacology,phytochemistry and pharmacology of an important traditional herbal medicine[J].J Ethnopharmacol,2014,157:292-308；Cheng J,Zhou ZW,Sheng HP,et al.Anevidence-based update on the pharmacological activities and possiblemolecular targets of Lycium barbarum polysaccharides[J].Drug Des Devel Ther,2014,9:33-78.)。
昆明山海棠为卫矛科植物昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum(Levl.)Hutch]的干燥根，是该方剂中的君药成分，可用于关节肿痛，风湿痹痛，系统性红斑狼疮等，但现行2020版《中国药典》中仅收载了“昆明山海棠片”，并未收载昆明山海棠药材。在《广东省中药材标准》中虽对昆明山海棠药材进行了收载，但缺乏重要的定量指标。雷公藤甲素(Triptolide)，又称雷公藤内酯、雷公藤内酯醇，是昆明山海棠中的主要二萜类活性成分，具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤以及治疗相关代谢疾病等药理活性(Zhou ZL,Yang YX,DingJ,et al.Triptolide:structural modifications,structure-activity relationships,bioactivities,clinical development and mechanisms[J].Nat Prod Rep,2012,29(4):457-475)。但同时雷公藤甲素也具有显著的毒副作用，主要表现在肝脏毒性、肾脏毒性、免疫系统毒性、骨髓及血液系统毒性、胃肠道毒性、心脏毒性、生殖毒性等(Xi C,Peng S,WuZ,et al.Toxicity of triptolide and the molecular mechanisms involved[J].Biomed Pharmacother,2017,90:531-541)。因此，对昆仙胶囊中雷公藤甲素的含量进行限定，对于提高患者用药的有效性及安全性具有重要的临床意义。
目前，昆仙胶囊的质量控制仍按照国家食品药品监督管理局颁布的国家药品标准(YBZ07522006-2009Z)，即薄层鉴别项下仅对胶囊中的淫羊藿药材和枸杞子药材进行鉴别，含量测定项下则以昆仙胶囊中的雷公藤甲素和淫羊藿苷的含量测定作为主要的质控指标，但对于雷公藤甲素的含量测定方法仍然存在前处理方法复杂，含量低，重现性及检测成分专属性差等亟待改进的问题。近年来，虽然有利用一测多评法测定昆仙胶囊中的10种黄酮类成分的文献报道，但该方法中所测定的黄酮类成分主要来源于淫羊藿和菟丝子药材，未能涵盖昆明山海棠中的有效或毒性成分，难以对昆仙胶囊实现全方面的整体性质量控制(张雪,彭富全,何风雷.一测多评法测定昆仙胶囊中10种黄酮类成分[J].中草药,2018,49(24):5823-5829.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用薄层色谱和高效液相色谱法对昆仙胶囊中雷公藤甲素进行定性定量分析的方法，已解决现有技术中存在的前处理方法复杂，含量低，重现性及检测成分专属性差等亟待改进的问题。
为了实现上述目的，本发明提供一种昆仙胶囊中雷公藤甲素的鉴别及含量测定方法，包括以下步骤：
A、样品前处理：
昆仙胶囊内容物，甲醇超声提取后，先利用二氯甲烷萃取，再通过硅胶柱层析法对雷公藤甲素进行富集和纯化，得到供试品溶液；
B、对供试品溶液采用薄层色谱法定性分析：
薄层色谱条件：载体为高效硅胶G预制板，展开剂为二氯甲烷-丙酮(12：1，V/V)，显色剂为2％香草醛的10％浓硫酸乙醇溶液，点样方式为手动点样；
C、对供试品溶液采用高效液相色谱定量分析：
高效液相色谱条件：以Agilent Zorbax SB-C18(5μm，250×4.6mm)为色谱柱，以乙腈-0.1％甲酸水溶液为流动相，以220nm为检测波长，以30℃为恒定柱温，以0.8ml/min为最终的体积流量。
进一步的，所述的步骤A样品前处理的方法包括以下步骤：取昆仙胶囊内容物20粒，每次加入300ml甲醇，超声30min，过滤，将滤液减压浓缩至干，残渣加40ml水溶解，二氯甲烷萃取2次，每次40ml，并于萃取过程中加5ml饱和NaCl水溶液，合并二氯甲烷萃取液，减压浓缩至干，残渣加少量甲醇溶解，加1g硅胶(200-300目)拌样，称4g硅胶装入直径为2cm的柱子，上柱；先用120ml石油醚-乙酸乙酯3：1洗脱，再以120ml石油醚-乙酸乙酯2：1洗脱，收集2:1的洗脱液，减压浓缩至干，残渣加入2ml甲醇溶解，得到供试品溶液。
进一步的，所述的步骤B薄层色谱法定性分析方法包括以下步骤：吸取供试品溶液10μl，点于同一高效硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮(12:1，V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％香草醛的10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。
进一步的，所述的步骤C高效液相色谱定量分析方法中：紫外检测时间为40min；进样量：10μl。
进一步的，所述的步骤C高效液相色谱定量分析方法中：梯度洗脱程序为0-10minA 85％～77％，10-35min A 77％～74％，36-40min A 74％～74％，41-52min A 2％～2％。
本发明优点在于：
1、本发明采用的薄层色谱和高效液相色谱法对昆仙胶囊中的雷公藤甲素进行定性定量分析的技术，专属性，准确性及重现性强，能更加客观、灵敏地反映出产品的质量变化，以有效实现对该制剂中的毒效成分的监测，进一步保证了患者用药的安全性、有效性。
2、本发明建立了一种昆仙胶囊中雷公藤甲素薄层鉴别及含量测定的方法，不仅解决了原标准中雷公藤甲素难测定，重复性差等难点，同时，也为其他含昆明山海棠或雷公藤属中药的复方或制剂的微量萜类成分的含量测定提供参考，也为完善昆仙胶囊的综合质量评价提供了实验参考。
附图说明
图1.昆仙胶囊中雷公藤甲素的薄层色谱图；1.雷公藤甲素；2.昆明山海棠对照药材；3.昆明山海棠阴性对照；4～19.16批昆仙胶囊。
图2.雷公藤甲素对照品(A)、昆仙胶囊样品(B)及昆明山海棠阴性(C)HPLC图谱。
图3.雷公藤甲素的线性图。
图4.雷公藤甲素的紫外吸收图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例：
1.实验材料
1.1.实验仪器
Agilent1260高效液相色谱仪(包括输液泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)：美国安捷伦科技有限公司；十万分之一分析天平：德国Sartorius公司；超声机：KQ-500型，昆山市超声仪器有限公司。
1.2.实验试剂与药品
乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯：美国Fisher Scientific公司，水为杭州娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯；雷公藤甲素对照品：大连美仑生物有限公司提供；
昆明山海棠对照药材：中国食品药品检定研究院；21批昆仙胶囊样品由广州白云山陈李济药厂有限公司提供，产品批号分别为：K31002、K31005、K31006、K31007、K31009、K31010、K31013、K31014、L31001、L31002、L31003、L31004、L31005、L31006、L31007、L31008、L31009、J31002保效期24个月，分别编号为S1-S21。
2.实验方法
2.1.雷公藤甲素的薄层色谱鉴别
2.1.1.供试品溶液的制备
取昆仙胶囊内容物20粒，放入具塞锥形瓶中，每次加入300ml甲醇，超声30min，过滤，将滤液减压浓缩至干，残渣加40ml水溶解，二氯甲烷萃取2次，每次40ml，并于萃取过程中加5ml饱和NaCl水溶液，合并二氯甲烷萃取液，减压浓缩至干，残渣加少量甲醇溶解，加1g硅胶(200-300目)拌样，称4g硅胶装入直径为2cm的柱子，上柱。先用120ml石油醚-乙酸乙酯3：1洗脱，再以120ml石油醚-乙酸乙酯2：1洗脱，收集2:1的洗脱液，减压浓缩至干，残渣加入2ml甲醇溶解，作为供试品溶液。
2.1.2.对照品溶液的配制
取雷公藤甲素对照品，加甲醇制成每毫升含502μg雷公藤甲素的溶液，作为对照品储备溶液。
2.1.3.对照药材及阴性样品的制备
取昆明山海棠对照药材10g，按照2.1.1.项下的供试品溶液制备方法，制得对照药材溶液。另取缺昆明山海棠的其他各药材，按照昆仙胶囊的制备方法进行提取后，按照2.1.1.项下的供试品溶液制备方法操作，制得阴性对照溶液。
2.1.4.薄层色谱条件
照薄层色谱法(《中国药典》2020年版附录ⅥB)试验方法，分别吸取上述对照品溶液5μl，对照药材溶液，阴性对照溶液、供试品溶液各10μl，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮(12:1，V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％香草醛的10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的斑点。
2.2.雷公藤甲素的含量测定
2.2.1.供试品溶液的制备
取昆仙胶囊内容物约6g，精密称定，其余步骤同2.1.1.项下的供试品溶液制备方法，制得供试品溶液。
2.2.2.对照品溶液的制备
同2.1.2.项下的方法。
2.2.3.阴性样品溶液的制备
同2.1.3.项下的方法。
2.2.4.色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBA SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(C)-0.1％甲酸溶液(A)；检测波长：220nm(紫外检测时间为40min)；柱温：30℃；流速：0.8ml/min；进样量：10μl。梯度洗脱程序为0-10min A 85％～77％，10-35min A 77％～74％，36-40min A74％～74％，41-52min A 2％～2％。
3.实验结果
3.1.薄层鉴别结果
在2.1.4.项下的薄层条件下，昆仙胶囊供试品色谱中与雷公藤甲素及对照药材相应位置上显示相同颜色的斑点。薄层色谱图见图1。
3.2.雷公藤甲素含量测定方法学考察
3.2.1.系统适应性及专属性实验考察
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μl，在色谱条件下分析，结果显示，其与相邻色谱峰的分离度大于1.5，拖尾因子在0.95-1.10，理论塔板数在5000以上，且阴性样品在各色谱峰的位置上未见干扰，说明该方法专属性良好，其HPLC图谱见图2。
3.2.2.线性关系考察
将雷公藤甲素对照品贮备液用甲醇稀释制成每ml含502.000μg、401.600μg、200.800μg、100.400μg、50.200μg、40.160μg的系列溶液，分别吸取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积Y对质量浓度X(μg/ml)进行线性回归计算，得线性回归方程为Y＝24.459X+347.82，r＝0.9995。结果见表1，雷公藤甲素的线性图见图3。
表1.雷公藤甲素线性关系考察
Figure BDA0002829166860000071
3.2.3.精密度实验
取雷公藤甲素对照品溶液(100.4μg/ml)，进样10μl，连续进样6次，测定峰面积，结果见表2，结果显示雷公藤甲素的平均峰面积为2813.93，RSD为0.19％。表明仪器精密度良好。
表2.精密度实验
Figure BDA0002829166860000072
3.2.4.重复性实验
按照供试品溶液制备方法，平行制备6份供试品溶液，分别进样10μl，测定峰面积，计算结果列入表3，雷公藤甲素的平均含量为9.742μg/粒，RSD为3.57％。表明该方法重复性较好。
表3.雷公藤甲素的重复性试验
Figure BDA0002829166860000073
Figure BDA0002829166860000081
3.2.5.稳定性实验
取某一批次(L31008)样品，制备成供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24、36、48小时分别进样测定雷公藤甲素的峰面积，结果列入表4，结果显示雷公藤甲素平均峰面积为2647.16，RSD为1.53％，说明供试品溶液在48小时内稳定。
表4.昆仙胶囊中雷公藤甲素的稳定性试验
Figure BDA0002829166860000082
3.2.6.加样回收率实验
采用加样回收法，分别精密称取6份已知含量的样品约6g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，按照接近1：1的量计算所需添加的雷公藤甲素对照品质量，加入到样品中，按供试品溶液制备方法平行制成6份供试品溶液。进样10μl，记录峰面积，结果显示雷公藤甲素的平均回收率为98.12％，RSD为8.25％，说明该方法准确度较好。计算结果见表5。
表5.昆仙胶囊中雷公藤甲素的回收率试验
Figure BDA0002829166860000091
3.2.7.含量测定结果
分别取每批昆仙胶囊粉末约6g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，每批样品平行制备2份，每份进3针，进样10μl，记录峰面积，计算结果见表6。
表6. 21批昆仙胶囊中雷公藤甲素的含量测定结果
Figure BDA0002829166860000092
Figure BDA0002829166860000101
4.讨论
4.1.样品前处理条件的选择
由于雷公藤甲素在昆仙胶囊中属于微量成分，无法直接通过简单的样品前处理进行含量测定，因此，需要对其前处理条件进行优化探索。首先，我们重复了厂家的样品前处理方法，即利用甲醇提取供试品，取上清液挥发浓缩后直接过中性氧化铝-硅胶层析柱的方法，结果得到的目标化合物含量极低，且操作方法可重复性差；为此，我们通过考察不同提取溶剂(甲醇，乙醇，二氯甲烷及乙酸乙酯等)，不同纯化及富集方式(多次萃取或者直接过硅胶层析柱)，均不能对胶囊中的雷公藤甲素实现有效测定；最终确定了优选方法为甲醇超声提取供试品后，先利用二氯甲烷萃取，再通过硅胶柱层析法对目标成分进行富集和纯化，如此，不仅大大提高了雷公藤甲素的含量，且提高了液相方法测定雷公藤甲素的准确度。其次，整个前处理探索过程中，我们也比较了不同填料的层析柱，结果均不如本发明的方法。
4.2.薄层条件选择
薄层色谱板载体方面的选择上，本实验分别对硅胶G预制板、硅胶H预制板、高效硅胶G预制板进行了比较考察，得出高效硅胶G预制板分离效果最佳；展开剂选择上，分别对氯仿-乙醚(2：1)、二氯甲烷-乙酸乙酯(10：1)、二氯甲烷-丙酮(11：1)、二氯甲烷-丙酮(10：1)、二氯甲烷-丙酮(12：1)进行了考察，结果显示以二氯甲烷-丙酮(12:1)作为展开剂时分离效果最佳。在此基础上，我们进一步比较了标准品和样品的点样量、点样方式以及显色方式，确认吸取标准品溶液5μl，样品液(含对照药材)10μl点样，斑点清晰，分离效果好。2％香草醛的10％浓硫酸乙醇溶液喷雾显色优于10％浓硫酸乙醇溶液和2％3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液与2mol/L氢氧化钠的混合乙醇溶液(1：3)。手动点样方式优于自动点样的条带式点样；综上，本实验最优选的薄层色谱条件为：载体为高效硅胶G预制板，展开剂为二氯甲烷-丙酮(12：1)，显色剂为2％香草醛的10％浓硫酸乙醇溶液，点样方式为手动点样。
4.3.色谱条件选择
由于样品中雷公藤甲素含量较低，其他成分相对含量高，故按照现行的部颁标准测定目标成分时，往往容易出现色谱柱对目标成分的分离效果差，含量测定结果重复性、重现性不理想，RSD较大等问题。为此，本实验对定量测定昆仙胶囊中雷公藤甲素含量的色谱条件进行了优化。我们通过比较Diamonsil C18(5μm，250×4.6mm)、Agilent Zorbax SB-C18(5μm，250×4.6mm)、Amethyst C18(5μm，250×4.6mm)以及Waters SunFireTm C18(5μm，250×4.6mm)色谱柱的分离效果，最终以Agilent Zorbax SB-C18(5μm，250×4.6mm)色谱柱的分离效果最佳。同时，本实验也对流动相的选择进行了考察，实验先后试用了4种流动相系统:乙腈-0.1％甲酸水溶液,乙腈-0.2％甲酸水溶液,乙腈-0.1％磷酸水溶液，乙腈-水，甲醇-0.1％甲酸水溶液，结果表明乙腈系统优于甲醇系统，且以0.1％甲酸水溶液为水相时，效果最佳。而后又对不同的紫外吸收波长(220nm、225nm、254nm、210nm)进行了考察，结果显示检测波长为220nm时，样品中雷公藤甲素的峰面积最大，基线相对较平稳，254nm波长下，则无紫外吸收，紫外吸收图见图4。除此之外，我们也对不同柱温(25℃、30℃、35℃、40℃)、不同体积流量(0.8ml/min、0.9ml/min、1.0ml/min)进行了考察，结果显示柱温为30℃流速为0.8ml/min时，目标峰分离完全，效果最佳。综上，最终优选的色谱条件为：以AgilentZorbax SB-C18(5μm，250×4.6mm)为色谱柱，以乙腈-0.1％甲酸水溶液为流动相，以220nm为检测波长，以30℃为恒定柱温，以0.8ml/min为最终的体积流量，所得样品中雷公藤甲素的分离度大于1.5，理论塔板数大于5000，符合要求。
4.4.雷公藤甲素含量测定结果分析
雷公藤甲素具有显著的免疫抑制和抗炎镇痛作用，在治疗类风湿关节炎、慢性肾炎、强直性脊柱炎等免疫性疾病方面具有独特的效果，但它的毒性也很强，主要表现为肝损伤、肾脏毒性、胃肠道毒性及生殖毒性等。另一方面，雷公藤甲素的有效剂量和中毒剂量又极为相近，因此为了保证患者用药的安全性及有效性，有必要对昆仙胶囊中的雷公藤甲素的含量进行限定。本发明中，利用高效液相色谱法对21批昆仙胶囊中雷公藤甲素含量测定的结果表明，昆仙胶囊中雷公藤甲素的含量大致在5.928～13.255μg/粒之间，个别批次间目标成分的含量差异较大，如S4的含量仅为5.928μg/粒，而S14的含量高达13.255μg/粒，相差大于两倍。分析其原因，一方面雷公藤甲素含量极低，确实给昆仙胶囊中雷公藤甲素的含量测定带来了一定困难，可能是实际操作过程中某些细节的差异引起的微小误差；另一方面，影响昆仙胶囊中雷公藤甲素含量差异的主要原因可能也与原料药材的质量差异和投料真实性差异有关，提示厂家在生产该复方制剂过程中，应保证原药材来源的标准化，并细化制备过程中的每一个工艺参数，以达到量化产品指标的目的，以此保证患者用药的安全性、有效性。综上，本发明建立了一种昆仙胶囊中雷公藤甲素薄层鉴别及含量测定的方法，不仅解决了原标准中雷公藤甲素难测定，重复性差等难点，同时，也为其他含昆明山海棠或雷公藤属中药的复方或制剂的微量萜类成分的含量测定提供参考，也为完善昆仙胶囊的综合质量评价提供了实验参考。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (5)

1.一种昆仙胶囊中雷公藤甲素的鉴别及含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、样品前处理：
昆仙胶囊内容物，甲醇超声提取后，先利用二氯甲烷萃取，再通过硅胶柱层析法对雷公藤甲素进行富集和纯化，得到供试品溶液；
B、对供试品溶液采用薄层色谱法定性分析：
薄层色谱条件：载体为高效硅胶G预制板，展开剂为体积比12：1的二氯甲烷-丙酮，显色剂为2％香草醛的10％浓硫酸乙醇溶液，点样方式为手动点样；
C、对供试品溶液采用高效液相色谱定量分析：
高效液相色谱条件：以Agilent Zorbax SB-C18为色谱柱，以乙腈-0.1％甲酸水溶液为流动相，以220nm为检测波长，以30℃为恒定柱温，以0.8ml/min为最终的体积流量。
2.根据权利要求1所述的昆仙胶囊中雷公藤甲素的鉴别及含量测定方法，其特征在于，所述的步骤A样品前处理的方法包括以下步骤：取昆仙胶囊内容物20粒，每次加入300ml甲醇，超声30min，过滤，将滤液减压浓缩至干，残渣加40ml水溶解，二氯甲烷萃取2次，每次40ml，并于萃取过程中加5ml饱和NaCl水溶液，合并二氯甲烷萃取液，减压浓缩至干，残渣加少量甲醇溶解，加1g硅胶拌样，称4g硅胶装入直径为2cm的柱子，上柱；先用120ml石油醚-乙酸乙酯3：1洗脱，再以120ml石油醚-乙酸乙酯2：1洗脱，收集2:1的洗脱液，减压浓缩至干，残渣加入2ml甲醇溶解，得到供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的昆仙胶囊中雷公藤甲素的鉴别及含量测定方法，其特征在于，所述的步骤B薄层色谱法定性分析方法包括以下步骤：吸取供试品溶液10μl，点于高效硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％香草醛的10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。
4.根据权利要求1所述的昆仙胶囊中雷公藤甲素的鉴别及含量测定方法，其特征在于，所述的步骤C高效液相色谱定量分析方法中：紫外检测时间为40min；进样量为10μl。
5.根据权利要求1所述的昆仙胶囊中雷公藤甲素的鉴别及含量测定方法，其特征在于，所述的步骤C高效液相色谱定量分析方法中：梯度洗脱程序为0-10min A85％～77％，10-35min A77％～74％，36-40min A74％～74％，41-52minA2％～2％。
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