CN103257188B - 一种复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法 - Google Patents
一种复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103257188B CN103257188B CN201310003184.2A CN201310003184A CN103257188B CN 103257188 B CN103257188 B CN 103257188B CN 201310003184 A CN201310003184 A CN 201310003184A CN 103257188 B CN103257188 B CN 103257188B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peaks
- drug effect
- compound
- peak
- compound xueshuantong
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Abstract
本发明公开了一种复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法，包括如下步骤:(1)配制复方血栓通制剂供试品溶液，精密吸取10μl复方血栓通制剂供试品溶液，注入双泵双梯度高效液相色谱仪，得到复方血栓通制剂HPLC标准指纹图谱；（2）配制混合对照品溶液，精密吸取10μl复方血栓通制剂供试品溶液，注入双泵双梯度高效液相色谱仪，得到对照品HPLC指纹图谱；（3）利用对照品对照法，采用RRLC/MS/MS技术手段指证指纹图谱中21个化学成分；（4）分析21个化学成分与生物活性差异关联性，阐明生物活性成分群，建立复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱。本发明通过复方血栓通制剂HPLC指纹图谱与谱效分析得到的生物活性成分群相结合，构建复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱，全面监控原料药材、半成品、成品的安全性、有效性、质量均一性。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，特别涉及一种生物活性色谱指纹图谱复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱构建方法。
背景技术
从2000年我国SFDA对中药注射剂提出要建立指纹图谱的要求后，到2010年，中国药典中规定的相关药材指纹图谱有14种，特征图谱7种，指纹图谱在我国的应用越来越广泛，在推动中药质量标准国际化，加速了中药现代化的进程中发挥着举足轻重的作用。随着现代分析技术手段的飞速发展，越趋全面的反映中药中化学信息将是中药指纹图谱技术的发展趋势之一。
2004年美国FDA《植物药研制指导原则》中明确要求植物药的研究在已知成分的基础上提高和药物作用研究，表明对中药中生物活性成分的监控已成为中药走向现代化的关键技术。周立艳等人（牡丹皮高效液相色谱“药效指纹图谱”研究[J].时珍国医国药,2008,19(6)：1337-1339.）将牡丹皮不同提取部位样品进行小鼠活血化瘀实验研究,同时进行HPLC分析,获得牡丹皮不同提取部位的指纹图谱,然后运用数理统计软件分析药效指标与指纹图谱相关信息之间的关系。该技术方案中不足之处在于：（1）药效学指标单一，只有全血黏度，无法全面反映药物临床疗效。（2）所选药效学实验动物模型用于模拟临床阴虚状态，主要体现在生长状况、环核苷酸系统、内分泌系统、免疫系统及物质代谢水平等方面，与所选药物活血化瘀疗效不甚相符。（3）指纹图谱信息与药效信息仅用多元回归分析方法进行关联，方法单一、片面，计算结果欠缺说服力。上述不足也正是制约现今中药谱效结合技术发展的关键问题。
复方血栓通胶囊是中山大学眼科中心与广东众生药业股份有限公司共同研 制的我国第一个用于治疗眼底血管疾病及心脑血管疾病的口服中药，是由三七、丹参、黄芪、玄参四味药组成的复方中成药制剂，具有活血化瘀，益气养阴的功效，主要适应症为血瘀兼气阴两虚证的视网膜静脉阻塞和稳定性劳累型心绞痛,同时涉及眼底疾病、心脑血管、肾病、神经系统疾病等领域的治疗。复方血栓通胶囊作为国家二级中药保护品种，国家级重点新产品，自1996年上市后，临床用药效果显著，在医生和患者中形成了良好口碑，带来了巨大的社会和经济效益。
对中药复方制剂方法的深入研究始终是保证其稳定性和临床使用安全有效性最重要的问题。复方血栓通胶囊HPLC指纹图谱技术于2005年申请国家发明专利，已于2010年获得授权，公开号为CN1670529。该指纹图谱方法不足之处在于：（1）供试品制备方法繁琐，成本较高，且固相萃取（SPE）小柱水淋洗步骤导致水溶性成分流失。（2）使用长度为250mm的常规色谱柱，分析时间较长，流动相耗费较多。（3）指纹图谱所提供的化学信息及化学解释均较少，在同时监控四味药材的基础上，仅检测丹参的脂溶性醌类成分，而未检测其水溶性酚酸类特征成分，及未对所含成分进行质谱确证。（4）指纹图谱中各色谱峰所对应化学成分生物活性不明确，不能有效监控复方血栓通胶囊有效成分含量，无法保证产品的安全性及有效性。
综上所述，现有复方血栓通胶囊指纹图谱构建方法具有较多缺点，在进一步完善其指纹图谱技术的基础上，需对其中的生物活性成分群应加以重点关注。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术中的不足，研究复方血栓通制剂质量控制新模式，提供一种可以同时监控药品整体质量均一性、安全性及有效性，且操作简便、检测快速、稳定性好的复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法。
本发明公开的一种复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法，包括如下步骤:
(1)配制复方血栓通制剂供试品溶液，精密吸取10μl复方血栓通制剂供试品溶液，注入双泵双梯度高效液相色谱仪，得到复方血栓通制剂HPLC标准指纹图谱；
（2）配制混合对照品溶液，精密吸取10μl复方血栓通制剂供试品溶液，注入双泵双梯度高效液相色谱仪，得到对照品HPLC指纹图谱；
（3）利用对照品对照法，采用RRLC/MS/MS技术手段指证指纹图谱中21个化学成分；
（4）分析21个化学成分与生物活性差异关联性，阐明生物活性成分群，建立复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱。
所述步骤（1）的复方血栓通制剂供试品溶液的配制方法为精密称取复方血栓通制剂0.1g～10.0g，用50%～100%甲醇提取1～3次，每次10～60分钟，每次10～100ml，滤过，合并滤液，蒸干，加50%甲醇配成供试品溶液。
所述步骤（2）的混合对照品溶液的配制方法为精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、丹参酮ⅡA、丹酚酸B对照品适量，加50%甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1500μg、人参皂苷Rb1500μg、三七皂苷R1100μg、丹参酮ⅡA20μg、丹酚酸B40μg的混合对照品溶液。
所述HPLC色谱条件采用长度为150mm、十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱温25℃；以乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，0～50分钟，乙腈由15%变至34%，50～95min，乙腈由34%变至75%,流速为1.0ml/min；以紫外检测器检测，检测波长为203nm，270nm。
用指纹图谱相似度评价软件分析得到复方血栓通制剂HPLC标准指纹图谱，有42个共有峰，其中，归属于三七的特征峰为2号峰、4号峰、10号峰、13号峰、14号峰、24号峰、25号峰、26号峰、29号峰、30号峰、32号峰、33号峰、36号峰、38号峰、41号峰，共15个峰；归属于丹参的特征峰为1号峰、3号峰、7号峰、9号峰、11号峰、15号峰、16号峰、18号峰、23号峰、31号 峰、34号峰、35号峰、37号峰、39号峰、40号峰、42号峰，共16个峰；归属于黄芪的特征峰为5号峰、12号峰、17号峰、19号峰、27号峰、28号峰，共6个峰；归属于玄参的特征峰为6号峰、8号峰、22号峰，共3个峰；归属于黄芪、丹参、玄参三味药材浸膏的特征峰为20号峰，共1个峰；归属于三七药材浸膏的特征峰为21号峰，共1个峰。
按《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均大于0.90。利用对照品对照法指证3号峰为原儿茶醛、5号峰为毛蕊异黄酮苷、9号峰为迷迭香酸、10号峰为三七皂苷R1、12号峰为芒柄花苷、13号峰为人参皂苷Rg1、14号峰为人参皂苷Re、15号峰为丹酚酸B、22号峰为哈巴俄苷、26号峰为人参皂苷Rb1、27号峰为芒柄花素、37号峰为隐丹参酮、38号峰为丹参酮Ⅰ、42号峰为丹参酮ⅡA；利用RRLC/MS/MS技术手段，通过质谱中分子离子峰、碎片离子峰以及HPLC-DAD紫外吸收曲线的比较、保留时间匹配信息的比较指证3号峰为原儿茶醛、5号峰为毛蕊异黄酮苷、7号峰为紫草酸、8号峰为安格洛苷C、9号峰为迷迭香酸、10号峰为三七皂苷R1、11号峰为丹酚酸A、12号峰为芒柄花苷、13号峰为人参皂苷Rg1、14号峰为人参皂苷Re、15号峰为丹酚酸B、16号峰为9,10-二甲基氧紫檀烷-3-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、19号峰为毛蕊异黄酮、22号峰为哈巴俄苷、26号峰为人参皂苷Rb1、27号峰为芒柄花素、29号峰为人参皂苷Rd、37号峰为隐丹参酮、38号峰为丹参酮Ⅰ、39号峰为人参炔三醇、42号峰为丹参酮ⅡA。
所述步骤（4）中具体方法为筛选临床常用血液流变及凝血功能药效学检测指标；利用配方约束下均匀设计原则对组方中四味药材进行重新组合构建复方血栓通制剂差异样品；构建差异样品指纹图谱，获得色谱峰信息；进行差异样品大鼠急性血瘀模型药效学实验，获得其生物活性信息；运用因子分析方法简化差异样品生物活性数据并解释其临床意义，运用多种关联分析方法综合分析差异样品中21个已知成分色谱峰差异与生物活性差异关联性，阐明生物活性成分群，建立复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱。
利用冰浴结合皮下注射肾上腺素复制大鼠急性血瘀模型进行药效学实验，考察复方血栓通制剂临床等效剂量即380mg/kg/d、中剂量即760mg/kg/d、高剂量即1520mg/kg/d给药对血液流变及凝血功能药效学指标的影响，筛选出药效学检测指标为切变率为5s-1、30s-1、50s-1、150s-1、200s-1的全血黏度、红细胞聚集指数、红细胞电泳指数，APTT、PT，血小板最大聚集率，血浆粘度，用于复方血栓通差异样品药效学实验，获得差异样品生物活性信息。
以复方血栓通制剂组方中四味药材质量百分含量为四个因素，进行四因素九水平配方约束下均匀设计构建差异样品1～9号，其中三七百分含量依次为64%、61.5%、59%、56.5%、54%、51.5%、49%、46.5%、44%，黄芪百分含量依次为9%、22.5%、36%、4.5%、18%、31.5%、0%、13.5%、27%，丹参百分含量依次为0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%，玄参百分含量依次为27%、13.5%、0%、31.5%、18%、4.5%、36%、22.5%、9%，在该构建方案指导下，按照《中华人民共和国药典》2010年版复方血栓通胶囊标准生产工艺进行制备得到各差异样品浸膏用于药效学实验。
运用因子分析方法中主成分提取法从11个所筛选药效学指标中提取出5个公因子即药效因子1～5，解释原数据信息的97.998%且互不重叠，并通过方差极大旋转法明确药效因子1～5分别表征了大鼠体内红细胞聚集性、血小板聚集性、内源性凝血系统、红细胞变形性及血浆蛋白、外源性凝血系统，利用汤姆逊回归法计算差异样品各药效因子得分表征其生物活性，上述方法运用SPSS18.0中分析项下数据降维中的因子分析模块实现。
以复方血栓通制剂HPLC指纹图谱中所指证的21个色谱峰峰面积为自变量，若在203nm、270nm波长下均能检测到则选择峰面积较大者,以差异样品药效因子1～5因子得分为因变量，运用灰色关联分析、主成分分析、偏最小二乘法、径向基函数神经网络四种方法对两者间关联性进行综合分析。
通过谱效关联分析，明确复方血栓通制剂HPLC标准指纹图谱中42个共有峰中的生物活性成分群为3号峰、5号峰苷、8号峰、26号峰、29号峰、38号、39号峰、42号峰，所述3号峰为原儿茶醛、5号峰为毛蕊异黄酮苷、8号峰为 安格洛苷C、26号峰为人参皂苷Rb1、29号峰为人参皂苷Rd、38号峰为丹参酮Ⅰ、39号峰为人参炔三醇、42号峰为丹参酮ⅡA。
本发明通过复方血栓通制剂HPLC指纹图谱与谱效分析得到的生物活性成分群相结合，构建复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱，全面监控原料药材、半成品、成品的安全性、有效性、质量均一性。
本发明采用优化后条件构建复方血栓通制剂指纹图谱并运用RRLC/MS/MS技术进行化学成分研究，通过多种方法综合分析复方血栓通差异样品色谱峰差异与生物活性差异间关联度明确其生物活性成分群，最终建立复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱，丰富了药品的化学信息并同时控制其中的生物活性成分。所建立的复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱技术可监控原料药材、半成品、成品工艺生产，确保产品的安全性及有效性，进一步提升产品质量。本技术的实施应用可为其他中药复方制剂的发展和创新提供范例。
本发明相比现有技术具有如下优点：（1）供试品制备方法简单，操作简便，重现性好，经济节约，不经SPE小柱处理，直接上样，保留水溶性成分，从而利于指纹图谱中水溶酸性成分的检出；（2）采用长度为150mm的高效色谱柱，进行203nm及270nm双波长同时采集，缩短了分析时间，提高分析效率的同时节约了成本；（3）优化的复方血栓通制剂HPLC指纹图谱所提供的化学信息大大增加，在检测的10批成品中，采用归一化法，得到共有峰峰面积之和占总峰面积的90%以上，且已知成分的峰面积占共有峰总峰面积的75%以上，运用RRLC/MS/MS技术手段指证了指纹图谱中21个化学成分，比原专利技术多指证了12个化学成分；（4）筛选稳定、灵敏且临床常用的多个药效学检测指标对复方血栓通差异样品进行考察，使获得的生物活性信息更加全面、系统的反映药品的功临床疗效；（5）运用因子分析方法将多个药效学指标简化为少数几个药效因子，有效避免了药效信息的重叠、繁杂，并科学解释了各药效因子的临床意义；（6）本发明中大鼠急性血瘀模型是依据中医心肌缺血血淤证的阴虚寒凝为主的病因、病机所设计，既考虑到中医血瘀证的致病因素，又结合了血液微环境的变化，很好的契合了复方血栓通制剂的主要适应症，该模型灵活、快速、 实验周期短，是活血化瘀药物药效筛选实验常用模型；（7）本发明中综合运用灰色关联分析、主成分分析、偏最小二乘法、径向基函数神经网络四种方法进行谱效分析，有效避免自变量间共线性，降低参数估计的误差，分析结果直观、真实、可靠；（8）通过谱效结合分析明确了复方血栓通制剂生物活性成分群，阐明了其药效物质基础，所建立的生物活性色谱指纹图谱技术实现了指纹图谱化学信息与生物学信息的相互结合，从而更好的对药品进行，提高其安全性、有效性及质量均一性。
附图说明
图1是复方血栓通制剂HPLC标准指纹图谱，A图在紫外203nm下检测得到；B图在紫外270nm下检测得到；
图2从下至上分别是复方血栓通制剂、三七阴性对照、三七药材对照色谱图，图中从左到右的数字所指为复方血栓通制剂中归属于三七的色谱峰的峰号，Ⅰ图在紫外203nm下检测，Ⅱ图在紫外270nm下检测；
图3从下至上分别是复方血栓通制剂、丹参阴性对照、丹参药材对照色谱图，图中从左到右的数字所指为复方血栓通制剂中归属于丹参的色谱峰的峰号，Ⅰ图在紫外203nm下检测，Ⅱ图在紫外270nm下检测；
图4从下至上分别是复方血栓通制剂、黄芪阴性对照、黄芪药材对照色谱图，图中从左到右的数字所指为复方血栓通制剂中归属于黄芪的色谱峰的峰号，Ⅰ图在紫外203nm下检测，Ⅱ图在紫外270nm下检测；
图5从下至上分别是复方血栓通制剂、玄参阴性对照、玄参药材对照色谱图，从左到右的数字所指为复方血栓通制剂中归属于黄芪的色谱峰的峰号，Ⅰ图在紫外203nm下检测，Ⅱ图在紫外270nm下检测；
图6从下至上分别是复方血栓通制剂、三七浸膏、三味药材（黄芪、丹参、玄参）浸膏色谱图，20*号峰归属于三味药材（黄芪、丹参、玄参）浸膏，21*号峰归属于三七药材浸膏，Ⅰ图在紫外203nm下检测，Ⅱ图在紫外270nm下检测；
图7是10批复方血栓通制剂指纹图谱相似度评价结果示意图，A图在紫外 203nm下检测；B图在紫外270nm下检测；
图8是复方血栓通制剂差异样品1～9的HPLC图谱，A图在紫外203nm下检测；B图在紫外270nm下检测；
图9是药效因子1自变量标准回归系数岭迹曲线；
图10是药效因子1自变量筛选后标准回归系数岭迹曲线；
图11药效因子1与自变量关联图（图中数字代表对应自变量的键结值大小）；
图12药效因子1复方血栓通差异样品自变量标准化重要性计算结果；
图13是药效因子2自变量标准回归系数岭迹曲线；
图14是药效因子2自变量筛选后标准回归系数岭迹曲线；
图15药效因子2与自变量关联图（图中数字代表对应自变量的键结值大小）；
图16药效因子2复方血栓通差异样品自变量标准化重要性计算结果；
图17是药效因子3自变量标准回归系数岭迹曲线；
图18是药效因子3自变量筛选后标准回归系数岭迹曲线；
图19药效因子3与自变量关联图（图中数字代表对应自变量的键结值大小）；
图20药效因子3复方血栓通差异样品自变量标准化重要性计算结果；
图21是药效因子4自变量标准回归系数岭迹曲线；
图22是药效因子4自变量筛选后标准回归系数岭迹曲线；
图23药效因子4与自变量关联图（图中数字代表对应自变量的键结值大小）；
图24药效因子4复方血栓通差异样品自变量标准化重要性计算结果；
图25是药效因子5自变量标准回归系数岭迹曲线；
图26是药效因子5自变量筛选后标准回归系数岭迹曲线；
图27药效因子5与自变量关联图（图中数字代表对应自变量的键结值大小）；
图28药效因子5复方血栓通差异样品自变量标准化重要性计算结果；
图29是复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱，其中生物活性成分群依次3号峰为原儿茶醛、5号峰为毛蕊异黄酮苷、8号峰为安格洛苷C、26号峰为人参皂苷Rb1、29号峰为人参皂苷Rd、38号峰为丹参酮Ⅰ、39号峰为人参炔三醇、42*号峰为丹参酮ⅡA，图A为紫外203nm下检测，图B为紫外270nm下检测；
注：上述各图中带*的峰为203nm、270nm下均能检测得到的特征峰。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明。
一、复方血栓通制剂HPLC指纹图谱的构建
1、实验材料
1.1实验样品
10批次复方血栓通胶囊成品及半成品三七浸膏及三味药材（丹参、黄芪、玄参）浸膏、三七阴性样品、丹参阴性样品、黄芪阴性样品、玄参阴性样品，均由广东众生药业股份有限公司提供。
1.2实验仪器
十万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司，BP211D型)；超纯水器(美国密理博Millipore公司，Simplicity)；旋转蒸发仪(德国Laborota公司，4001型)；烘箱(德国Memmert公司，UFB400型)；数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司， KQ-250DE型)；Ultimate3000DGLC高效液相色谱仪(美国Dionex公司，DGP-3600SD双三元泵、SRD-3600脱气机、WPS-3000SL自动进样器、TCC3000-RS柱温箱、DAD检测器、Chromeleon6.8数据处理软件)；P680高效液相色谱仪(美国Dionex公司，ASI-100自动进样器、ATH-585柱温箱、P680四元梯度泵、PDA-100检测器)；Agilent高效液相色谱-质谱联用仪(Agilent1200RRLC-6410三重四级杆串联质谱仪)。
色谱柱：Dionex120C18(3μm，150mm×4.6mm)；Dionex
120C18(3μm，150mm×3.0mm)；Agilent Proshell120EC-C18(2.7μm，150mm×3.0mm)；Ultimate XB-C18(3μm，150mm×3.0mm)；DionexPolarAdvantageⅡC18(3μm，150mm×4.6mm)；DionexPolarAdvantageⅡC18(5μm，250mm×4.6mm)。
1.3实验试药
液相色谱所用试剂甲醇、乙腈、磷酸、甲酸为色谱纯；其余所用试剂为分析纯；水为超纯水。所用对照品见表1-2，所有对照药材见表1-3。
表1-2对照品列表
表1-3对照药材列表
2、实验方法与结果
2.1复方血栓通制剂供试品溶液制备：
精密称取复方血栓通胶囊内容物0.1g～10.0g，用50%～100%甲醇提取1～3次，每次10～60分钟，每次10～100ml，滤过，合并滤液，蒸干，加50%甲醇配成供试品溶液
2.2药材供试品溶液的制备：
取复方血栓通制剂的三七、丹参、黄芪、玄参对照药材，分别按照复方血栓通制剂供试品溶液的制备方法制备。
2.3阴性供试品溶液的制备：
取三七阴性样品、丹参阴性样品、黄芪阴性样品、玄参阴性样品，分别按 照复方血栓通制剂供试品溶液的制备方法制备。
2.4三七浸膏、三味药材（黄芪、丹参、玄参）浸膏供试品溶液的制备
取三七浸膏、三味药材（丹参、黄芪、玄参）浸膏，分别按照复方血栓通制剂供试品溶液的制备方法制备。
2.5混合对照品溶液的制备：
取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、丹参酮ⅡA、丹酚酸B对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1500μg、人参皂苷Rb1500μg、三七皂苷R1100μg、丹参酮ⅡA20μg、丹酚酸B40μg的混合对照品溶液。
2.6高效液相色谱分析：
分别精密吸取10μl待测溶液，注入Dionex Ultimate 3000 DGLC双泵双梯度高效液相色谱仪测定；以Dionex120C18(3.0μm，150mm×4.6mm)为分析柱，柱温25℃；采用DAD检测器进行图谱采集，检测波长为203nm、270nm；以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，按下表规定进行梯度洗脱，记录95分钟的色谱图，流速为1.0ml/min。理论板数按三七皂苷R1计，应不低于10000。优化的复方血栓通制剂指纹图谱流动相洗脱梯度如表1-4所示。
表1-4优化的复方血栓通制剂指纹图谱流动相洗脱梯度
2.7色谱图分析
对上述各溶液进行色谱分析，如图1-7所示。
图1为复方血栓通制剂HPLC标准指纹图谱，A图在紫外203nm下检测；B图在紫外270nm下检测；标志*的峰为在203、270nm两个波长下均能检测到的色谱峰。
图2中A为复方血栓通制剂、B为三七阴性对照、C为三七药材对照色谱图，其中Ⅰ图在紫外203nm下检测，Ⅱ图在紫外270nm下检测，图中从左到右的数字所指为复方血栓通制剂中归属于三七的色谱峰的峰号。
图3中A为复方血栓通制剂、B为丹参阴性对照、C为丹参药材对照色谱图，其中Ⅰ图在紫外203nm下检测，Ⅱ图在紫外270nm下检测，图中从左到右的数字所指为复方血栓通制剂中归属于丹参的色谱峰的峰号。
图4中A为复方血栓通制剂、B为黄芪阴性对照、C为黄芪药材对照色谱图，其中Ⅰ图在紫外203nm下检测，Ⅱ图在紫外270nm下检测，图中从左到右的数字所指为复方血栓通制剂中归属于黄芪的色谱峰的峰号。
图5中A为复方血栓通制剂、B为玄参阴性对照、C为玄参药材对照色谱图，其中Ⅰ图在紫外203nm下检测，Ⅱ图在紫外270nm下检测，图中从左到右的数字所指为复方血栓通制剂中归属于玄参的色谱峰的峰号。
图6中A为复方血栓通制剂、B为三七浸膏、C为三味药材（黄芪、丹参、玄参）浸膏色谱图，其中Ⅰ图在紫外203nm下检测，Ⅱ图在紫外270nm下检测，其中20*号峰归属于三味药材（黄芪、丹参、玄参）浸膏；21*号峰归属于三七药材浸膏。
图7是10批复方血栓通制剂指纹图谱相似度评价结果示意图，其中A图在紫外203nm下检测；B图在紫外270nm下检测。
2.8共有峰确定：对10批复方血栓通制剂进行分析，所得供试品溶液的指纹图谱应检出与三七、丹参、黄芪、玄参4味对照药材指纹图谱相同的色谱峰。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》进行评价，相似度评价结果示意图形如说明书附图中的图7所示，共出现42个共有峰，如表1-5所示：
表1-5
所述复方血栓通制剂HPLC指纹图谱共检测出42个共有峰。其中，归属于三七的特征峰为[2]、[4*]、[10]、[13]、[14]、[24]、[25]、[26]、[29]、[30]、[32]、[33]、[36]、[38]、[41]号峰，共15个峰；归属于丹参的特征峰为[1*]、[3]、[7]、[9*]、[11*]、[15*]、[16]、[18*]、[23*]、[31]、[34]、[35]、[37*]、[39]、[40]、[42*]号峰，共16个峰；归属于黄芪的特征峰为[5*]、[12]、[17]、[19]、[27]、[28]号峰，共6个峰；归属于玄参的特征峰为[6]、[8*]、[22]号峰，共3个峰；归属于黄芪、丹参、玄参三味药材浸膏的特征峰为[20*]，共1个峰；归属于三七药材浸膏的特征峰为[21*]，共1个峰（注：带*的峰为203nm、270nm下均能检测得到的特征峰），所述图谱的图形如说明书附图中的图1所示。
利用对照品对照法确证3号峰为原儿茶醛、5*号峰为毛蕊异黄酮苷、9*号峰为迷迭香酸、10号峰为三七皂苷R1、12号峰为芒柄花苷、13号峰为人参皂苷Rg1、14号峰为人参皂苷Re、15*号峰为丹酚酸B、22号峰为哈巴俄苷、26号峰为人参皂苷Rb1、27号峰为芒柄花素、37*号峰为隐丹参酮、38号峰为丹参酮Ⅰ、42*号峰为丹参酮ⅡA。利用RRLC/MS/MS技术手段，通过质谱中分子离子峰、碎片离子峰以及HPLC-DAD紫外吸收曲线的比较、保留时间匹配等信息的比较指证：3号峰为原儿茶醛、5*号峰为毛蕊异黄酮苷、7号峰为紫草酸、8号峰为安格洛 苷C、9*号峰为迷迭香酸、10号峰为三七皂苷R1、11*号峰为丹酚酸A、12号峰为芒柄花苷、13号峰为人参皂苷Rg1、14号峰为人参皂苷Re、15*号峰为丹酚酸B、16号峰为9,10-二甲基氧紫檀烷-3-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、19号峰为毛蕊异黄酮、22号峰为哈巴俄苷、26号峰为人参皂苷Rb1、27号峰为芒柄花素、29号峰为人参皂苷Rd、37*号峰为隐丹参酮、39号峰为人参炔三醇、38号峰为丹参酮Ⅰ、42*号峰为丹参酮ⅡA（注：带*的峰为203nm、270nm下均能检测得到的特征峰）。
2.9指纹图谱精密度试验：取同一份复方血栓通制剂供试品溶液，连续进样6次，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》进行评价。结果显示仪器的精密度很好，相似度均大于0.99。相似度结果如表1-6所示。
表1-6指纹图谱精密度试验结果
| 203nm | 精密度1 | 精密度2 | 精密度3 | 精密度4 | 精密度5 | 精密度6 |
| 精密度1 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 精密度2 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 精密度3 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 精密度4 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 精密度5 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 精密度6 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 270nm | 精密度1 | 精密度2 | 精密度3 | 精密度4 | 精密度5 | 精密度6 |
| 精密度1 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 精密度2 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 精密度3 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 精密度4 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 精密度5 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 精密度6 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
2.10指纹图谱稳定性试验：取同一份复方血栓通制剂供试品溶液，分别 于制备后的0、4、8、12、24、48小时进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》进行评价。稳定性良好，相似度均大于0.99，表明供试品溶液在放置48小时内稳定。相似度结果表1-7：
表1-7指纹图谱稳定性试验结果
| 203nm | 稳定性0h | 稳定性4h | 稳定性8h | 稳定性12h | 稳定性24h | 稳定性48h |
| 稳定性0h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 稳定性4h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 稳定性8h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 稳定性12h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 稳定性24h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 稳定性48h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 270nm | 稳定性0h | 稳定性4h | 稳定性8h | 稳定性12h | 稳定性24h | 稳定性48h |
| 稳定性0h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.999 |
| 稳定性4h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.999 |
| 稳定性8h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.999 |
| 稳定性12h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.999 |
| 稳定性24h | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.999 |
| 稳定性48h | 0.999 | 0.999 | 0.999 | 0.999 | 1.000 | 1.000 |
2.11指纹图谱重复性试验：取同一批复方血栓通制剂6份制备成供试品溶液，分别进样，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》进行评价。相似度均大于0.99，方法重复性好。相似度结果表1-8：
表1-8指纹图谱重复性试验结果
| 203nm | 重复性1 | 重复性2 | 重复性3 | 重复性4 | 重复性5 | 重复性6 |
| 重复性1 | 1.000 | 0.999 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 重复性2 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 重复性3 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 重复性4 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
[0112]
| 重复性5 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 重复性6 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 270nm | 重复性1 | 重复性2 | 重复性3 | 重复性4 | 重复性5 | 重复性6 |
| 重复性1 | 1.000 | 0.999 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 重复性2 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 重复性3 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 重复性4 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.999 |
| 重复性5 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 重复性6 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.999 | 1.000 | 1.000 |
2.12中间精密度：精密称取同一批复方血栓通制剂，分别在不同日期、不同分析人员等变动因素条件下，依法测定，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》进行评价。表明该方法中间精密度好，复方血栓通制剂HPLC指纹图谱质量控制方法可行。相似度结果如下表1-9、表1-10所示。
表1-9不同日期试验结果
| 203nm | 分析日期1 | 分析日期2 | 分析日期3 |
| 分析日期1 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 分析日期2 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 分析日期3 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 270nm | 分析日期1 | 分析日期2 | 分析日期3 |
| 分析日期1 | 1.000 | 1.000 | 0.999 |
| 分析日期2 | 1.000 | 1.000 | 1.000 |
| 分析日期3 | 0.999 | 1.000 | 1.000 |
表1-10不同分析人员试验结果
| 203nm | 分析人员1 | 分析人员2 |
| 分析人员1 | 1.000 | 1.000 |
| 分析人员2 | 1.000 | 1.000 |
[0118]
| 270nm | 分析人员1 | 分析人员2 |
| 分析人员1 | 1.000 | 0.999 |
| 分析人员2 | 0.999 | 1.000 |
二、复方血栓通制剂差异样品指纹图谱的构建及其药效学研究
1、实验材料
1.1实验动物
大鼠，SD属，SPF级，雄性，由广东省医学实验动物中心供给，合格证号：SCXK-(粤)2008-0004，60只，体重180～220g。
1.2实验药品与试剂
药效实验：差异样品浸膏（批号：120523），由广东众生药业股份有限公司提供，用生理盐水分别配制为152mg/mL浓度的药液；0.1%盐酸肾上腺素注射液，规格1mg：1mL，上海禾丰制药有限公司，国药准字H31021062，批号：20111109、20120315，用生理盐水稀释至0.4mg/mL，现用现配；阿司匹林肠溶片，吉林市鹿王制药公司，国药准字H22025784，批号：BTA7WH2；复方丹参滴丸，天津天士力制药股份有限公司，国药准字Z10950111，批号：120201；氯化钠注射液（0.9%），广东利泰制药股份有限公司，批号：11100852、广东科伦药业有限公司，批号：D12070311-2；二水合柠檬酸三钠，广州化学试剂厂，批号：20030904-1；水合氯醛（水合三氯乙醛），天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20111114。
色谱部分：液相色谱所用试剂乙腈(Burdick & Jackson，Honeywell)、磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）为色谱纯，水为超纯水，其余所用试剂为分析纯。
1.3实验仪器
药效实验：涡旋振荡器：Scientific Industries Vortex-Genie2；十万 分之一电子天平：sartorius BP211D、ACCULAB ALC-210.4；超低温冰箱：海尔BCD-568W；冷冻离心机：Eppendorf5430R、TD5A-WS、TDL-5M；北京普利生LBY-NJ4血小板聚集仪；Sysmex CA-510全自动血凝分析仪；北京普利生LBY-N6B全自动自清洗血流变仪；北京普利生LBY-XC40全自动动态血沉测试仪。
色谱部分：Ultimate3000DGLC高效液相色谱仪(美国Dionex公司，DGP-3600SD双三元泵、SRD-3600脱气机、WPS-3000SL自动进样器、TCC3000-RS柱温箱、DAD检测器、Chromeleon6.8数据处理软件)；十万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司，BP211D型)；超纯水器(美国密理博Millipore公司，Simplicity)；旋转蒸发仪(德国Laborota公司，4001型)；数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司，KQ-250DE型)；烧杯、锥形瓶、茄形瓶、滴管、移液管等玻璃仪器。
色谱柱型号：Dionex
120C18(3μm，150mm×4.6mm)。
1.4实验环境
（1）饲养环境
经中山大学生命科学学院动物伦理委员会批准饲养于广东省中山大学海洋与中药实验室SPF级动物房，许可证号：SCXK-(粤)2008-0002观察室温度20℃～23℃，相对湿度50%～65%，颗粒饲料，在实验动物适应新环境一周后开始实验并实验过程中采取适当的方法减轻对动物的伤害。
（2）检测环境
广州医药工业研究院药物非临床评价研究中心动物医学部，广东省中山大学海洋与中药实验室。
2、实验方法
2.1差异样品的构建及指纹图谱分析
（1）差异样品的构建
根据复方血栓通制剂的处方组成，三七：黄芪：丹参：玄参为25:8:5:8，因此进行配方约束下四因素九水平的均匀设计，每个水平表示相应药材占四位药材总量的百分比，其中三七变化为44%～64%，黄芪为0～36%，丹参为0～20%，玄参为0～36%，见表2-1。
表2-1复方血栓通差异样品构建方案
| 差异样品 | 三七% | 黄芪% | 玄参% | 丹参% |
| 1 | 64 | 9 | 27 | 0 |
| 2 | 61.5 | 22.5 | 13.5 | 2.5 |
| 3 | 59 | 36 | 0 | 5 |
| 4 | 56.5 | 4.5 | 31.5 | 7.5 |
| 5 | 54 | 18 | 18 | 10 |
| 6 | 51.5 | 31.5 | 4.5 | 12.5 |
| 7 | 49 | 0 | 36 | 15 |
| 8 | 46.5 | 13.5 | 22.5 | 17.5 |
| 9 | 44 | 27 | 9 | 20 |
（2）差异样品的制备
在构建方案表的指导下，差异样品委托东莞市众生药业股份有限公司按照《中华人民共和国药典》2010年版一部中复方血栓通制剂标准生产工艺进行制备，每组浸膏重量及其所含的各药材的重量见表2-2。
表2-2差异样品浸膏及其所含各药材重量
| 差异样品 | 浸膏总重g | 三七g | 黄芪g | 玄参g | 丹参g |
| 1 | 400 | 696 | 98 | 294 | 0 |
| 2 | 405 | 730 | 267 | 160 | 30 |
| 3 | 401 | 771 | 471 | 0 | 65 |
| 4 | 405 | 579 | 46 | 323 | 77 |
| 5 | 400 | 600 | 200 | 200 | 111 |
[0145]
| 6 | 402 | 626 | 383 | 55 | 152 |
| 7 | 411 | 474 | 0 | 348 | 145 |
| 8 | 404 | 486 | 141 | 235 | 183 |
| 9 | 402 | 500 | 307 | 102 | 227 |
分别取复方血栓通差异样品1～9号约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中加70％的甲醇20ml，密塞，超声处理（功率250W，频率40kHz)30分钟，滤过，将滤纸及残渣置同一锥形瓶中，再加入甲醇20ml，超声处理（功率250W，频率40kHz)30分钟，滤过，合并两次滤液，减压回收溶剂至近干，加50%甲醇使溶解，定量转移至10ml量瓶，加50%甲醇至刻度，摇匀，用0.22μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
（3）差异样品指纹图谱分析及聚类分析
按照优化的复方血栓通制剂指纹图谱方法，将制备得的差异样品1～9号进行HPLC分析，通过SPSS18.0对差异样品1～9号的指纹图谱按照共有峰面积大小进行聚类分析。
2.2差异样品药效学实验
（1）实验分组及给药
分组：体重180～220g的SD大鼠130只，随机分为13组，雄性，分别为空白对照组，急性血瘀模型组，阳性对照阿司匹林（Asp）给药组，阳性对照复方丹参滴丸（Fdd）给药组,复方血栓通差异样品1～9组。
给药：药效学指标筛选实验，阳性对照阿司匹林给药组0.1g/kg，阳性对照复方丹参滴丸给药组0.8g/kg,复方血栓通差异样品1～9组1.52g/kg。实验动物在饲养环境中适应一周后开始给药，每天灌胃给药一次，给药体积均为10mL/kg，空白对照组与模型组灌胃给予同体积生理盐水，连续给药10d。
（2）大鼠急性血瘀模型建立
末次给药后30min，除空白对照组外其余各组大鼠均皮下注射盐酸肾上腺素0.8mg/kg，空白组大鼠皮下注射等量生理盐水，过2h后除空白对照组外其余各组大鼠均浸入0～4℃冰水内进行冷刺激5min，2h后再次皮下注射等量盐酸肾上腺素0.8mg/kg，处置后禁食12h后各组进行灌胃给药，1h后10%水合氯醛0.35mL/100g腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，枸橼酸钠1:9抗凝，血样处理及检测全部按照标准操作规程进行，所取血液全部用于血液流变和凝血功能相关药效指标检测。
（3）大鼠血液药效指标检测
取1.5ml抗凝血液放入TDL-5M冷冻离心机进行离心，3820r/m，相对离心力2000g，20℃，15min；得血浆；血浆放入Sysmex CA-510全自动血凝分析仪进行PT、APTT项目检测；血浆放入北京普利生LBY-N6B全自动自清洗血流变仪进行毛细管血浆粘度检测；一次性灭菌注射器取0.9ml抗凝血液放入北京普利生LBY-N6B全自动自清洗血流变仪进行全血粘度检测，切变率设定为5s-1、30s-1、50s-1、150s-1、200s-1；一次性灭菌注射器取0.9ml抗凝血液放入北京普利生LBY-XC40全自动动态血沉测试仪进行血沉检测，半小时后放入TDL-5M冷冻离心机进行离心，3820r/m，相对离心力2000g，20℃，15min，重新放入北京普利生LBY-XC40全自动动态血沉测试仪进行红细胞压积检测。
（4）数据处理方法
所得计量资料均以
表示，采用SPSS18.0版本运用单因素方差分析(ANOVA)和T检验的方法进行数据分析，P值小于0.05或P值小于0.01被认为存在统计学差异。
3实验结果
3.1差异样品指纹图谱分析及聚类分析
（1）指纹图谱分析
按照优化的复方血栓通制剂指纹图谱方法，将制备得的差异样品1～9进行HPLC分析，其指纹图谱与峰面积见图8、表2-3。通过液相色谱-高分辨串联质谱联用等方法，检测所含化学成分的准确分子量，以及二级质谱碎片离子信息，结合文献查阅，以及标准品对照的方法，已指证了21个化学成分，并用于下一步谱效结合计算中。
表2-3复方血栓通制剂差异样品1～9的图谱特征
| 波长 | 203nm | 203nm | 203nm | 203nm | 203nm | 203nm | 203nm |
| 自变量 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 |
| tR//min | 11.3 | 17.8 | 21.6 | 23.6 | 24.3 | 26.3 | 26.8 |
| 1 | 3.469657 | 0 | 32.59619 | 27.83375 | 0 | 142.2595 | 17.18819 |
| 2 | 5.504858 | 3.663869 | 21.14224 | 32.23622 | 9.204978 | 157.4263 | 18.83128 |
| 3 | 8.624 | 6.852333 | 0 | 38.94718 | 21.24663 | 186.5645 | 22.20814 |
| 4 | 3.045673 | 7.577144 | 44.22085 | 25.16088 | 22.58781 | 127.9925 | 15.72775 |
| 5 | 5.272476 | 10.12372 | 32.56557 | 27.34879 | 32.64699 | 140.0661 | 16.45797 |
| 6 | 7.609939 | 12.68167 | 18.07413 | 27.96695 | 45.64915 | 144.3745 | 17.07354 |
| 7 | 0 | 13.32355 | 49.84946 | 19.49649 | 44.15874 | 97.77023 | 12.04868 |
| 8 | 4.783877 | 15.5656 | 35.72202 | 21.90768 | 56.31236 | 108.695 | 13.11728 |
| 9 | 7.459186 | 19.80187 | 30.28713 | 24.99046 | 72.69708 | 120.1247 | 14.37565 |
| 波长 | 203nm | 203nm | 203nm | 203nm | 203nm | 270nm | 270nm |
| 自变量 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 | P13 | P14 |
| tR//min | 28.1 | 29.5 | 49.5 | 56.8 | 80.9 | 5.6 | 22.6 |
| 1 | 0 | 1.991166 | 94.47364 | 22.02813 | 0 | 0.392879 | 0 |
| 2 | 119.6052 | 3.029968 | 102.8326 | 23.20365 | 1.949089 | 0.476434 | 0.703211 |
| 3 | 258.6708 | 6.567938 | 118.8204 | 27.78967 | 3.585909 | 0.5049 | 1.686622 |
| 4 | 288.7507 | 1.329302 | 82.89505 | 20.0599 | 3.59884 | 0.794605 | 1.889114 |
| 5 | 408.8076 | 2.775487 | 89.89639 | 20.54526 | 5.120547 | 0.845753 | 2.797132 |
| 6 | 552.7789 | 4.778973 | 92.37746 | 21.37821 | 5.196973 | 0.768394 | 3.842657 |
[0165]
| 7 | 544.2646 | 0 | 64.66772 | 16.30612 | 5.969572 | 1.139765 | 3.74577 |
| 8 | 647.7422 | 2.125719 | 68.4019 | 17.86664 | 7.639584 | 1.121465 | 4.516768 |
| 9 | 862.138 | 4.188698 | 76.13447 | 18.81802 | 10.31015 | 1.221675 | 6.038513 |
| 波长 | 270nm | 270nm | 270nm | 270nm | 270nm | 270nm | 270nm |
| 自变量 | P15 | P16 | P17 | P18 | P19 | P20 | P21 |
| tR//min | 25.2 | 32 | 33.5 | 52 | 81.9 | 82.7 | 90.8 |
| 1 | 0.436296 | 1.351865 | 16.99246 | 0.628544 | 0.365297 | 0 | 0 |
| 2 | 1.010554 | 3.50565 | 9.052047 | 1.930638 | 0.409126 | 1.021979 | 2.580606 |
| 3 | 1.864222 | 6.64944 | 0 | 3.526948 | 0.497083 | 2.115813 | 5.650886 |
| 4 | 0.384419 | 0 | 19.95471 | 0.330292 | 0.419304 | 2.511267 | 6.199453 |
| 5 | 0.793299 | 2.21511 | 12.33519 | 1.730075 | 0.351142 | 3.404362 | 9.051231 |
| 6 | 1.458096 | 4.956211 | 3.960109 | 2.777555 | 0.348049 | 3.766545 | 11.60698 |
| 7 | 0 | 0 | 19.94117 | 0 | 0.321597 | 4.083219 | 10.53467 |
| 8 | 0.465735 | 1.718156 | 13.29263 | 0.958943 | 0.317096 | 5.511302 | 14.17995 |
| 9 | 1.21362 | 4.188571 | 8.373249 | 2.364809 | 0.264362 | 5.19757 | 16.85369 |
（2）聚类分析
根据HPLC得到的九份差异样品的21个共有峰的峰面积，将其导入SPSS18.0中进行聚类分析，聚类方法采用类间平均链锁法Between-groups linkage，距离计算方法采用相关系数距离Pearson correlation。结果表明，当聚类重新标定距离(Rescaled Distance Cluster Combine)为5时，9批样品可分为七类：2、3为一类，7、8为一类，其余自成一类。
3.2差异样品药效实验
（1）全血粘度（5s-1、30s-1、50s-1、150s-1、200s-1）
实验结果由表2-4及图9表明：急性血瘀大鼠各切变率下全血黏度显著升高(P＜0.01)，而Asp、Fdd、差异样品1、2、3、4、5组在5s-1、30s-1、50s-1、150s-1切变率下，30s-1切变率下差异样品7、8组及50s-1切变率下差异样品8组对大鼠全血黏度升高有显著抑制作用(P＜0.05)，对200s-1切变率下全血黏度的 升高Asp、Fdd及各差异样品1、2、3、4、5、8组有一定的抑制作用，其余各组与模型组比较无统计学差异。
表2-4差异样品对各切变率下全血粘度的改善作用
注：*P＜0.05and**P＜0.01vs正常组，#P＜0.05and##P＜0.01vs模型组(n=10)（2）红细胞聚集、电泳指数
实验结果如表2-5表明，急性血瘀大鼠红细胞聚集指数显著高(P＜0.01)，红细胞电泳指数显著降低(P＜0.01)，而Asp、Fdd、差异样品1、2、3、4、5、6、8组对红细胞聚集指数升高有显著抑制作用(P＜0.05)，差异样品2、4、5对红细胞电泳指数的降低有显著的改善作用(P＜0.05)，其余各组与模型组比较无统计学差异。
表2-5差异样品对红细胞聚集、电泳指数的改善作用
| 组别 | 剂量mg/kg | 红细胞聚集指数 | 红细胞电泳指数 |
| 空白 | NS（等体积） | 1.72±0.12 | 4.87±0.23 |
| 模型 | NS（等体积） | 2.12±0.18** | 3.69±0.31** |
| Asp | 100 | 1.58±0.26## | 4.04±0.89 |
| Fdd | 800 | 1.62±0.29## | 3.89±0.77 |
| X1 | 1520 | 1.65±0.22## | 4.11±0.3 |
| X2 | 1520 | 1.56±0.17## | 4.25±0.28# |
| X3 | 1520 | 1.67±0.13## | 3.67±0.12 |
| X4 | 1520 | 1.53±0.16## | 4.35±0.44# |
| X5 | 1520 | 1.61±0.22## | 4.62±0.24## |
| X6 | 1520 | 1.87±0.3# | 3.64±0.25 |
| X7 | 1520 | 1.94±0.35 | 3.62±0.23 |
| X8 | 1520 | 1.83±0.21# | 3.57±0.32 |
| X9 | 1520 | 2±0.23 | 3.71±0.42 |
注：*P＜0.05and**P＜0.01vs正常组，#P＜0.05and##P＜0.01vs模型组(n=10)（3）PT、APTT
实验结果表明（表2-6），急性血瘀大鼠PT显著降低(P＜0.01)及APTT显著降低(P＜0.05)，而Asp、Fdd、差异样品各组中只有差异样品3组对APTT的降低有显著抑制作用(P＜0.05)，其余各组除了差异样品7组外对PT、APTT均有一定的提升作用，但与模型组比较无显著性差异。
表2-6差异样品对PT、APTT的改善作用
| 组别 | 剂量mg/kg | APTT（s） | PT（s） |
| 空白 | NS（等体积） | 14.04±1.03 | 8.74±0.28 |
| 模型 | NS（等体积） | 12.29±0.93* | 7.98±0.25** |
| Asp | 100 | 13.01±0.7 | 8.13±0.3 |
| Fdd | 800 | 12.81±1.09 | 8.1±0.29 |
| X1 | 1520 | 13.26±1.36 | 8±0.18 |
[0181]
| X2 | 1520 | 13.19±0.81 | 7.98±0.25 |
| X3 | 1520 | 13.79±1.22# | 8.14±0.34 |
| X4 | 1520 | 13.6±0.92 | 8.04±0.23 |
| X5 | 1520 | 13.84±1.2# | 8.08±0.36 |
| X6 | 1520 | 12.93±1.51 | 8.1±0.3 |
| X7 | 1520 | 13.45±1.37 | 7.88±0.16 |
| X8 | 1520 | 12.7±1.36 | 8.06±0.29 |
| X9 | 1520 | 13.15±0.48 | 8.06±0.42 |
注：*P＜0.05and**P＜0.01vs正常组，#P＜0.05and##P＜0.01vs模型组(n=10)（4）血小板最大聚集率、血浆粘度
实验结果表明（表2-7），急性血瘀大鼠血浆粘度及血小板最大聚集率均显著升高(P＜0.01)，而Asp、差异样品1、5组对血小板最大聚集率的升高有显著抑制作用(P＜0.01)，其余各组则均有一定的改善作用，Asp、Fdd、差异样品各组对血浆粘度的改善作用较弱，与模型组比较无统计学差异。
表2-7差异样品对血浆粘度、血小板最大聚集率的影响
注：*P＜0.05and**P＜0.01vs正常组，#P＜0.05and##P＜0.01vs模型组(n=10)
4小结
复方血栓通差异样品间化学成分差异明显，且通过考察全血黏度（5s-1、30s-1、50s-1、150s-1、200s-1）、红细胞聚集指数、红细胞电泳指数，APTT、PT，血小板最大聚集率，血浆粘度11个药效学指标获得的差异样品间生物活性差异明显。三、复方血栓通制剂基于谱效结合的生物活性成分群研究
1、方法
采用灰色关联分析、主成分分析、偏最小二乘法（岭回归RR）-径向基函数（RBF）神经网络结合分析、因子分析方法对复方血栓通制剂基于谱效结合的生物活性成分群进行研究。
2、结果
为方便各种分析方法的计算，在进行谱效结合之前先对指纹图谱原始数据用均值化方法进行无量纲化处理，对药效作用原始数据中的负向指标先做正向化处理（取倒数）再用均值化方法进行无量纲化处理，见表3-1、3-2、3-3。
表3-1均值化处理后复方血栓通制剂差异样品指纹特征
| 波长 | 203nm | 203nm | 203nm | 203nm | 203nm | 203nm | 203nm |
| 自变量 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 |
| tR//min | 11.3 | 17.8 | 21.6 | 23.6 | 24.3 | 26.3 | 26.8 |
| 1 | 0.6823 | 0 | 1.1093 | 1.0188 | 0 | 1.0449 | 1.0521 |
| 2 | 1.0825 | 0.3681 | 0.7195 | 1.1799 | 0.2721 | 1.1563 | 1.1527 |
| 3 | 1.6958 | 0.6884 | 0 | 1.4255 | 0.628 | 1.3704 | 1.3594 |
| 4 | 0.5989 | 0.7612 | 1.5049 | 0.9209 | 0.6676 | 0.9401 | 0.9627 |
| 5 | 1.0368 | 1.017 | 1.1083 | 1.001 | 0.9649 | 1.0288 | 1.0074 |
| 6 | 1.4964 | 1.274 | 0.6151 | 1.0236 | 1.3492 | 1.0605 | 1.0451 |
[0196]
| 7 | 0 | 1.3385 | 1.6965 | 0.7136 | 1.3052 | 0.7182 | 0.7375 |
| 8 | 0.9407 | 1.5637 | 1.2157 | 0.8019 | 1.6644 | 0.7984 | 0.8029 |
| 9 | 1.4668 | 1.9893 | 1.0307 | 0.9147 | 2.1487 | 0.8824 | 0.88 |
| 波长 | 203nm | 203nm | 203nm | 203nm | 203nm | 270nm | 270nm |
| 自变量 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 | P13 | P14 |
| tR//min | 28.1 | 29.5 | 49.5 | 56.8 | 80.9 | 5.6 | 22.6 |
| 1 | 0 | 0.669 | 1.0756 | 1.0546 | 0 | 0.4866 | 0 |
| 2 | 0.2923 | 1.018 | 1.1708 | 1.1108 | 0.4045 | 0.5901 | 0.2509 |
| 3 | 0.6321 | 2.2067 | 1.3528 | 1.3304 | 0.7441 | 0.6254 | 0.6019 |
| 4 | 0.7057 | 0.4466 | 0.9438 | 0.9603 | 0.7468 | 0.9843 | 0.6742 |
| 5 | 0.9991 | 0.9325 | 1.0235 | 0.9836 | 1.0626 | 1.0476 | 0.9982 |
| 6 | 1.3509 | 1.6056 | 1.0517 | 1.0234 | 1.0784 | 0.9518 | 1.3713 |
| 7 | 1.3301 | 0 | 0.7363 | 0.7806 | 1.2388 | 1.4118 | 1.3367 |
| 8 | 1.583 | 0.7142 | 0.7788 | 0.8553 | 1.5853 | 1.3891 | 1.6119 |
| 9 | 2.1069 | 1.4073 | 0.8668 | 0.9009 | 2.1395 | 1.5132 | 2.1549 |
| 波长 | 270nm | 270nm | 270nm | 270nm | 270nm | 270nm | 270nm |
| 自变量 | P15 | P16 | P17 | P18 | P19 | P20 | P21 |
| tR//min | 25.2 | 32 | 33.5 | 52 | 81.9 | 82.7 | 90.8 |
| 1 | 0.5149 | 0.4949 | 1.4719 | 0.397 | 0.9984 | 0 | 0 |
| 2 | 1.1926 | 1.2833 | 0.7841 | 1.2195 | 1.1182 | 0.3331 | 0.303 |
| 3 | 2.2 | 2.4342 | 0 | 2.2279 | 1.3585 | 0.6896 | 0.6634 |
| 4 | 0.4537 | 0 | 1.7285 | 0.2086 | 1.146 | 0.8185 | 0.7278 |
| 5 | 0.9362 | 0.8109 | 1.0685 | 1.0928 | 0.9597 | 1.1096 | 1.0627 |
| 6 | 1.7208 | 1.8144 | 0.343 | 1.7545 | 0.9512 | 1.2277 | 1.3627 |
| 7 | 0 | 0 | 1.7273 | 0 | 0.8789 | 1.3309 | 1.2368 |
| 8 | 0.5496 | 0.629 | 1.1514 | 0.6057 | 0.8666 | 1.7964 | 1.6648 |
| 9 | 1.4322 | 1.5333 | 0.7253 | 1.4938 | 0.7225 | 1.6941 | 1.9787 |
表3-2正向化（取倒数）处理后复方血栓通差异样品药效作用
| 药效学指标 | 全血粘度5s-1 | 全血粘度30s-1 | 全血粘度50s-1 | 全血粘度150s-1 | 全血粘度200s-1 |
| 1 | 0.1176 | 0.1625 | 0.1773 | 0.2024 | 0.2114 |
| 2 | 0.1354 | 0.1658 | 0.1807 | 0.2039 | 0.2061 |
| 3 | 0.1178 | 0.1605 | 0.1756 | 0.2019 | 0.204 |
| 4 | 0.1306 | 0.1619 | 0.175 | 0.2 | 0.202 |
| 5 | 0.1327 | 0.1616 | 0.176 | 0.2033 | 0.207 |
| 6 | 0.1078 | 0.1429 | 0.1567 | 0.1907 | 0.2008 |
| 7 | 0.1084 | 0.1486 | 0.1563 | 0.1914 | 0.1975 |
| 8 | 0.1134 | 0.1501 | 0.1648 | 0.1917 | 0.2049 |
| 9 | 0.0989 | 0.1379 | 0.1562 | 0.186 | 0.1954 |
表3-3均值化处理后复方血栓通差异样品药效作用
| 药效学指标 | 全血粘度5s-1 | 全血粘度30s-1 | 全血粘度50s-1 | 全血粘度150s-1 | 全血粘度200s-1 |
| 1 | 0.996 | 1.0508 | 1.0506 | 1.0283 | 1.0403 |
| 2 | 1.1472 | 1.0724 | 1.0711 | 1.0361 | 1.0139 |
| 3 | 0.9977 | 1.0378 | 1.0404 | 1.0258 | 1.0036 |
| 4 | 1.1058 | 1.0471 | 1.0371 | 1.0164 | 0.9939 |
| 5 | 1.1243 | 1.0447 | 1.0432 | 1.0329 | 1.0188 |
| 6 | 0.9128 | 0.9238 | 0.9289 | 0.9691 | 0.9879 |
| 7 | 0.9182 | 0.961 | 0.9261 | 0.9726 | 0.9717 |
| 8 | 0.9603 | 0.9704 | 0.9768 | 0.9739 | 1.0083 |
| 9 | 0.8377 | 0.8918 | 0.9258 | 0.9449 | 0.9616 |
2.1药效指标整体因子分析
本研究所涉及的药效指标有11个，包括全血粘度5s-1、全血粘度30s-1、全血粘度50s-1、全血粘度150s-1、全血粘度200s-1、PT、APTT、血浆粘度120(1/s)mPa.s、血小板最大聚集率、红细胞聚集指数、红细胞电泳指数，由于指标过多，且为了避免指标间信息的重合，运用因子分析方法对11个指标提取 公因子并对其进行解释，实现对药效指标信息简化，并可进一步解释所选取的药效指标的临床意义。计算结果如表3-4、3-5、3-6。
表3-4药效因子解释总方差
| 方差% | 累计方差% | |
| 药效因子1 | 61.606 | 61.606 |
| 药效因子2 | 14.197 | 75.803 |
| 药效因子3 | 8.681 | 84.484 |
| 药效因子4 | 7.254 | 91.738 |
| 药效因子5 | 6.260 | 97.998 |
表3-5各药效指标与药效因子关联性-旋转成分矩阵
| 药效指标 | 药效因子1 | 药效因子2 | 药效因子3 | 药效因子4 | 药效因子5 |
| HBC聚集 | 0.9646 | 0.1895 | 0.0897 | 0.0848 | 0.0788 |
| WBC_5s | 0.9320 | 0.2218 | 0.1369 | 0.0500 | -0.0573 |
| WBC_30s | 0.9024 | 0.0849 | 0.2111 | 0.3540 | -0.0729 |
| WBC_50s | 0.8952 | 0.1588 | 0.0912 | 0.3541 | 0.1000 |
| WBC_150s | 0.8733 | 0.1583 | 0.2430 | 0.3596 | 0.0448 |
| HBC电泳 | 0.7094 | 0.6681 | 0.1774 | -0.1019 | -0.0787 |
| MPAR | 0.1965 | 0.9388 | 0.0400 | 0.2461 | 0.1252 |
| APTT | 0.1637 | 0.0353 | 0.9598 | -0.0473 | -0.1557 |
| 血浆粘度 | 0.3377 | 0.1701 | 0.6441 | 0.6305 | -0.0370 |
| WBC_200s | 0.5963 | 0.3062 | -0.1867 | 0.7006 | 0.0453 |
| PT | 0.0273 | 0.0757 | -0.1442 | 0.0083 | 0.9858 |
表3-6药效指标各因子得分及差异样品综合得分
| 差异样品 | 药效因子1 | 药效因子2 | 药效因子3 | 药效因子4 | 药效因子5 | 综合得分 |
| 1 | 0.1860 | 0.8201 | -0.6073 | 1.5533 | -0.5988 | 0.25 |
| 2 | 1.5403 | -0.5542 | -0.6996 | -0.1696 | -0.9001 | 0.74 |
| 3 | 0.3091 | -1.4263 | 1.2073 | 0.7950 | 1.6147 | 0.25 |
| 4 | 1.2594 | 0.0493 | 0.1388 | -1.4871 | 0.0288 | 0.69 |
[0211]
| 5 | 0.3325 | 1.9929 | 1.1165 | 0.2402 | 0.4671 | 0.63 |
| 6 | -0.6231 | -0.2070 | -1.1009 | -0.8173 | 0.6750 | -0.53 |
| 7 | -1.0138 | -0.7583 | 1.3275 | -0.0950 | -1.8381 | -0.74 |
| 8 | -0.5457 | -0.4002 | -1.1856 | 0.9853 | 0.1786 | -0.41 |
| 9 | -1.4446 | 0.4838 | -0.1967 | -1.0048 | 0.3727 | -0.89 |
注：综合得分=0.61606*药效因子1+0.14197*药效因子2+0.08681*药效因子3+0.07254*药效因子4+0.0626*药效因子5(根据各因子的方差贡献率进行计算)
由表3-4可知从11个药效指标中提取出的5个药效因子反映了原始数据的98%的信息。由表3-5可知药效因子1与红细胞聚集指数、低、中切变率下血液粘度关联最为密切，药效因子2与血小板最大聚集率关联最为密切，药效因子3与APTT关联最为密切，药效因子4与高切变率下血液粘度及血浆粘度关联最为密切，药效因子5与PT关联最为密切，由于各个药效因子变量间不存在线性相关关系，彼此独立，由此可知药效因子1～5分别代表了表征血液系统功能正常的5个方面，依次是红细胞聚集性、血小板聚集性、内源性凝血系统、红细胞变形性及血浆蛋白、外源性凝血系统，因此通过因子分析使11个药效指标的临床意义避免了重合，更加明确，并大大减少了计算工作量，为接下来的谱效计算奠定了铺垫。
比较各个差异样品综合得分可知（表3-6），药效排在前三的是5、4、2号差异样品，6、7、8、9号差异样品药效较差而1、3号差异样品药效居中。
2.2谱效结合计算
分析药材中各个化学成分与药效差异的关联，明确其生物活性物质基础。由于已经将11个药效指标分解成具有明确临床意义的5个药效因子，因此接下来分别计算差异样品指纹图谱化学成分与5个药效因子间的关联性，并解释相关计算结果，相关药效因子得分见表3-6。
（1）药效因子1
a灰色关联分析
从表3-7可得，各个自变量所代表的化学成分与药效因子1的关联度排序如下：P10＞P7＞P6＞P19＞P11＞P4＞P3＞P17＞P1＞P18＞P9＞P15＞P16＞P13＞P12＞P20＞P2＞P21＞P8＞P14＞P5。
其中P10、P7、P6、P19、P11、P4所对应的化学成分与药效间的关联度大于0.7，提示这六种成分与药效关系最为密切，它们均归属于三七药材。
关联度大于0.6（P3＞……＞P16）所对应的化学成分对药效也发挥一定的协同作用，这些化学成分来自于黄芪和玄参两位药材。
关联度小于0.6（P13＞……＞P5）所对应的化学成分与药效间关联性较弱，但是在本次差异样品中P13、P12、P20、P2、P21、P8、P14、P5均是丹参中化学成分，自变量间存在较严重的共线性，加之灰色关联分析以绝对值进行分析，不能体现化学成分与药效间的负相关关系，因此有必要结合下面两种方法综合考虑以全面反映各个化学成分的生物活性，确定哪些物质为有效成分、无效成分或有害成分。
表3-7复方血栓通差异样品药效因子1灰色关联分析结果
| 自变量 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 |
| 关联度 | 0.6421 | 0.5449 | 0.6810 | 0.7234 | 0.5283 | 0.7309 | 0.7309 |
| 自变量 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 | P13 | P14 |
| 关联度 | 0.5340 | 0.6250 | 0.7368 | 0.7250 | 0.5600 | 0.5957 | 0.5290 |
| 自变量 | P15 | P16 | P17 | P18 | P19 | P20 | P21 |
| 关联度 | 0.6218 | 0.6056 | 0.6666 | 0.6276 | 0.7272 | 0.5532 | 0.5423 |
b主成分分析
由于差异样品共线性现象比较严重，导致多元线性回归分析参数估计不稳定，模型适用度差，为此需要从21个自变量提取主成分，把原来彼此相关的自 变量转换为独立的自变量，重新进行回归分析，利用因子得分矩阵计算原自变量的参数值，最后通过比较各个原自变量的参数值的大小来分析其对因变量的贡献程度。
主成分提取的过程如下：
从共同度Communalities得到，共有峰19在因子分析后，能被因子变量解释的方差为72.3%，损失较大，除此之外，主成分几乎包含了各个原始变量至少90%的信息。总方差解释部分Total Variance Explained显示了保留2个主成分为宜，集中了原始变量的96.67%。经计算，因子得分矩阵Component Score Coefficient Matrix见表3-8。
表3-8因子得分矩阵
| 变量 | F1 | F2 |
| P1 | 0.0416 | 0.1048 |
| P2 | 0.1049 | 0.0288 |
| P3 | -0.0024 | -0.0958 |
| P4 | -0.0342 | 0.0730 |
| P5 | 0.1056 | 0.0304 |
| P6 | -0.0404 | 0.0686 |
| P7 | -0.0445 | 0.0650 |
| P8 | 0.1054 | 0.0298 |
| P9 | 0.0309 | 0.1064 |
| P10 | -0.0483 | 0.0617 |
| P11 | -0.0428 | 0.0661 |
| P12 | 0.1045 | 0.0318 |
| P13 | 0.0877 | -0.0107 |
| P14 | 0.1053 | 0.0293 |
| P15 | 0.0304 | 0.1064 |
| P16 | 0.0344 | 0.1065 |
[0231]
| P17 | -0.0374 | -0.1068 |
| P18 | 0.0375 | 0.1077 |
| P19 | -0.0657 | 0.0249 |
| P20 | 0.1001 | 0.0205 |
| P21 | 0.1056 | 0.0315 |
通过计算因子得分矩阵可得因子得分函数：
F1=0.0416P1+0.1049P2+……+0.1056P21
F2=0.1048P1+0.0288P2+……+0.0315P21
SPSS18.0可根据因子得分函数自动计算9个样本的2个因子得分，并作为新变量保存为FAC1_1、FAC2_1（表3-9），进而可以采用FAC1_1、FAC2_1作为新自变量对因变量药效因子1进行回归分析。
经逐步回归法Stepwise可得回归方程如下：
Y1=1-0.552XFAC1_1（P＜0.01）
此外本研究还尝试采用强迫引入法Enter、强迫剔除法Remove、向后引入法Backward及向前剔除法Forward等方法分别建立回归方程。结果显示，强迫引入法、强迫剔除法和向后引入法所建立的方程，自变量FAC2_1对因变量药效因子1影响不显著（P＞0.05），模型稳定性差，故排除由这几种方法分析所得到的回归方程，向前剔除法所建立的回归方程，与逐步回归法所得的结果一致。
将因子得分函数带入上述方程后可得(原自变量的参数值见表3-10)
Y1=1-0.0230P1-0.0579P2+0.0014P3+0.0189P4-0.0583P5+0.0223P6+0.0246P7-0.0582P8-0.0171P9+0.0266P10+0.0236P11-0.0577P12-0.0484P13-0.0581P14-0.0168P15-0.0190P16+0.0206P17-0.0207P18+0.0363P19-0.0553P20-0.0583P21
各自变量的系数可视为权重系数，在一定程度上反映了各个自变量所对应 的化学成分的相对重要性。如P19、P10、P7、P11、P6的系数为正且绝对值相对较大，表明其对应的化学成分对药效因子1贡献较大，它们均归属于三七药材。P5、P21、P8、P14、P2、P12、P20的系数为负且绝对值相对较大，它们均归属以丹参药材。其他自变量的系数绝对值相对较小，说明其对应的化学成分对药效因子1的影响较小。
主成分分析结果与灰关联分析结果基本一致，二者都在一定程度上表明了三七药材对药效因子1的贡献要强于其余三位药材。
表3-9复方血栓通差异样品主成分分析因子得分及药效因子
表3-10复方血栓通差异样品药效因子1主成分分析结果
| 自变量 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 |
| 系数/10-2 | -2.2970 | -5.7882 | 0.1351 | 1.8863 | -5.8318 | 2.2303 | 2.4565 |
| 自变量 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 | P13 | P14 |
| 系数/10-2 | -5.8180 | -1.7057 | 2.6647 | 2.3628 | -5.7669 | -4.8433 | -5.8139 |
| 自变量 | P15 | P16 | P17 | P18 | P19 | P20 | P21 |
| 系数/10-2 | -1.6760 | -1.8997 | 2.0623 | -2.0721 | 3.6266 | -5.5261 | -5.8312 |
C RR-RBF神经网络结合分析
取岭参数K最小值为0.02，最大值为1，增量为0.02，绘制岭迹图如图9，其中横坐标为岭参数K，纵坐标为自变量标准回归系数。
根据岭迹图，剔除掉标准化岭回归系数比较稳定且绝对值很小的自变量及随着K的增加回归系数不稳定、震动趋于零的自变量，最终筛选的有效、稳定的自变量为P4、P6、P9、P10、P14、P16、P17、P19，重新进行岭回归得到岭迹图如图10。
通过岭迹图观察可知当K≥0.18时，岭迹曲线趋于稳定，因此取K=0.18，得到所选自变量的参数如表3-11：
表3-11K=0.18时各自变量标准回归系数
| 自变量 | P4 | P6 | P9 | P10 | P14 | P16 | P17 | P19 |
| K=0.18 | 0.16 | 0.2 | -0.17 | 0.13 | -0.26 | -0.2 | 0.1 | 0.26 |
上述自变量的标准回归系数大小显示了其对应化学成分的相对重要性，由表3-11比较可知，P19、P6、P4、P10、P17对药效因子1具有正相关关系，其中P19系数绝对值相对较大，它与P6、P4、P10均归属于三七药材。P14、P16、P9对药效因子1具有负相关关系，其中P14系数绝对值相对较大，它归属于丹参药材。
运用上述选取的自变量构建9样本有效训练的RBF神经网络，计算各个自变量与因变量药效因子1之间的键结值及自变量标准化重要性，见图11及图12。
自变量与因变量间的键结值表征了两者间相关的正负强弱，而自变量标准化重要性的大小则表征了其与因变量相关的可靠程度，即所计算的键结值的可信度。由图11及图12可知，P19的键结值为正且绝对值远大于其余自变量，其自变量标准化重要性为100%，表明P19可显著影响药效因子1。P10、P6、P4的键结值为正且绝对值相对较大，上述四种成分均归属于三七药材。P14的键结值为负且绝对值相对较大，但由于其标准化重要性仅为57.73%，因此推测P14可 能对药效因子1起到负作用。上述分析结果与岭回归分析结果基本一致。
d小结
药效因子1表征了大鼠体内全身性红细胞聚集性的强弱，宏观上体现为大鼠低、中切变率下全血黏度。通过灰色关联分析、主成分分析、RR-RBF神经网络结合分析相互结合，基本能够反映复方血栓通差异样品指纹图谱与药效因子1之间的关系。
P19、P10、P6、P4对药效因子1具有正作用且贡献较大，其中P19的贡献作用为最强，它们均归属于三七药材，为主要活性成分。丹参药材中P14对药效因子1可能起到负作用。
（2）药效因子2
a灰色关联分析
从表3-12可得，各个自变量所代表的化学成分与药效因子2的关联度排序如下：P3＞P10＞P7＞P13＞P6＞P11＞P4＞P17＞P19＞P9＞P1＞P20＞P12＞P15＞P2＞P18＞P21＞P8＞P14＞P5＞P16。
其中P3、P10、P7、P13、P6、P11、P4、P17、P19所对应的化学成分与药效间的关联度大于0.7，提示这九种成分与药效关系最为密切。
P9、P1、P20、P12、P15、P2、P18、P21、P8、P14、P5、P16所对应的化学成分与药效关联度介于0.6到0.7之间，并未达到高值，这提示这些化学物质可能对药效起到协同作用，但上述12种成分来自于丹参及黄芪两味药材，自变量间共线性现象仍然存在，加之灰色关联分析以绝对值进行分析，不能体现化学成分与药效间的负相关关系，因此有必要结合下面两种方法综合考虑已全面反映各个化学成分的生物活性，确定哪些物质为有效成分、无效成分或有害成分。
表3-12复方血栓通差异样品药效因子2灰色关联分析结果
| 自变量 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 |
| 关联度 | 0.6725 | 0.6403 | 0.7433 | 0.7330 | 0.6192 | 0.7342 | 0.7356 |
| 自变量 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 | P13 | P14 |
| 关联度 | 0.6259 | 0.6767 | 0.7358 | 0.7335 | 0.6491 | 0.7350 | 0.6194 |
| 自变量 | P15 | P16 | P17 | P18 | P19 | P20 | P21 |
| 关联度 | 0.6458 | 0.6174 | 0.7234 | 0.6340 | 0.7180 | 0.6532 | 0.6326 |
b主成分分析
表3-13主成分与药效因子2偏相关系数
| Y2 | F1 | F2 |
| 偏相关系数 | 0.039 | -0.266 |
由表3-13可知药效因子2与主成分F1偏相关系数极小，认为两者不相关，与主成分F2偏相关系数为-0.266，为较弱的负相关，故无法对主成分F1、F2建立多元线性方程。因此可认为针对药效因子2没有影响显著的自变量存在，即并不存在某个或某些化学成分对药效因子2起显著影响作用。
此外由pearson相关系数可知（表3-14），P3、P17的相关系数为正且明显大于其余正相关自变量，说明其对应的化学成分对药效因子2贡献较大，但由于相关系数仍较小，并不能起到决定性作用，两者归属于玄参药材，P19的相关系数为负且绝对值明显大于其余负相关自变量，说明其对应的化学成分对药效因子2可能起负作用，但由于绝对值仍较小，并不能对药效产生显著影响。其余自变量的系数绝对值很小，绝大部分小于0.3，因此可认为其对应的化学成分单独对药效因子2的贡献均较小，呈现弱相关关系，它们之间可能具有复杂的协同起效作用。主成分分析结果与灰关联分析结果基本一致，即玄参药材对药效因子2的贡献作用较强。
表3-14复方血栓通差异样品与药效因子2相关性分析结果
| F2 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 |
| pearson相关系数 | -0.0806 | -0.0129 | 0.3447 | -0.2649 | 0.0025 | -0.1909 | -0.2208 |
| F2 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 | P13 | P14 |
| pearson相关系数 | 0.0112 | -0.2308 | -0.1791 | -0.2737 | 0.0211 | 0.0737 | 0.0227 |
| F2 | P15 | P16 | P17 | P18 | P19 | P20 | P21 |
| pearson相关系数 | -0.2448 | -0.3082 | 0.3126 | -0.2032 | -0.4232 | -0.0166 | 0.0216 |
cRR-RBF神经网络结合分析:
取岭参数K最小值为0.02，最大值为1，增量为0.02，绘制岭迹图如图13，其中横坐标为岭参数K，纵坐标为自变量标准回归系数。
根据岭迹图，剔除掉标准化岭回归系数比较稳定且绝对值很小的自变量及随着K的增加回归系数不稳定、震动趋于零的自变量，最终筛选的有效、稳定的自变量为P1、P2、P3、P5、P16、P17、P19，重新进行岭回归得到岭迹图14：
通过岭迹图观察可知当K≥0.18时，岭迹曲线趋于稳定，因此取K=0.18，得到所选自变量的参数如表3-15：
表3-15K=0.18时各自变量标准回归系数
| 自变量 | P1 | P2 | P3 | P5 | P11 | P16 | P17 | P19 |
| K=0.18 | 0.51 | -0.2 | 0.24 | -0.21 | 0.05 | -0.18 | 0.19 | -0.52 |
上述自变量的标准回归系数大小显示了其对应化学成分的相对重要性，由表3-15比较可知，P1、P3、P17、P11对药效因子2具有正相关关系，其中P1、P3、P17系数较大，它们分别归属于黄芪、玄参药材，P19、P5、P2、P16对药效因子2具有负相关关系，其中P19系数绝对值较大，它归属于三七药材。
运用上述选取的自变量构建9样本有效训练的RBF神经网络，计算各个自变量与因变量药效因子2之间的键结值及自变量标准化重要性，见图15及图16。
自变量与因变量间的键结值表征了两者间相关的正负强弱，而自变量标准化重要性的大小则表征了其与因变量相关的可靠程度，即所计算的键结值的可 信度。由图15及图16可知，各自变量标准化重要性相当，P3、P17的键结值为正且绝对值较大，对药效因子2具有正相关关系，两者归属于玄参药材，与岭回归分析结果稍有不同。P19的键结值为负且绝对值较大，它归属于三七药材，与岭回归分析结果一致。
d小结
药效因子2表征了大鼠体内血小板聚集性的强弱，与全身血液高凝状态密切相关。通过灰色关联分析、主成分分析、RR-RBF神经网络结合分析相互结合，基本能够反映复方血栓通差异样品指纹图谱与药效因子2之间的关系。
P3、P17对药效因子2起到正作用且贡献较大，其中P3贡献作用为最强，它们均归属于玄参药材，为主要活性成分。三七药材中的P19可能对药效因子2起到负作用。
（3）药效因子3
a灰色关联分析
从表3-16可得，各个自变量所代表的化学成分与药效因子3的关联度排序如下：P13＞P19＞P7＞P10＞P6＞P3＞P11＞P4＞P17＞P15＞P9＞P18＞P20＞P1＞P12＞P2＞P21＞P16＞P8＞P14＞P5。
从整体上来讲，各个自变量与药效间的关联度均小于0.7，说明针对药效因子3可能并无某种或某几种化学成分起到决定性作用。
其中P13、P19、P7、P10、P6、P3、P11、P4、P17、P15、P9所对应的化学成分与药效间的关联度介于0.6到0.7之间，与药效间有一定的关联，说明上述化学成分对药效可能起到协同作用。
P18、P20、P1、P12、P2、P21、P16、P8、P14、P5所对应的化学成分与药效关联度小于0.6，对药效作用不明显，但其中P20、P12、P2、P21、P8、P14、 P5归属于丹参药材，P18、P1、P16归属于黄芪药材，自变量间共线性现象仍然存在，加之灰色关联分析以绝对值进行分析，不能体现化学成分与药效间的负相关关系，因此有必要结合下面两种方法综合考虑已全面反映各个化学成分的生物活性，确定哪些物质为有效成分、无效成分或有害成分。
表3-16复方血栓通差异样品药效因子3灰色关联分析结果
| 自变量 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 |
| 关联度 | 0.5952 | 0.5895 | 0.6369 | 0.6358 | 0.5650 | 0.6376 | 0.6390 |
| 自变量 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 | P13 | P14 |
| 关联度 | 0.5728 | 0.6064 | 0.6379 | 0.6362 | 0.5928 | 0.6568 | 0.5654 |
| 自变量 | P15 | P16 | P17 | P18 | P19 | P20 | P21 |
| 关联度 | 0.6179 | 0.5753 | 0.6336 | 0.5995 | 0.6502 | 0.5980 | 0.5758 |
b主成分分析
表3-17药效因子3与主成分偏相关系数
| Y3 | F1 | F2 |
| 偏相关系数 | -0.080 | -0.019 |
由表3-17可知药效因子3与主成分F1与F2偏相关系数均极小，无相关关系。因此可认为针对药效因子3没有影响显著的自变量存在，即并不存在某个或某些化学成分对药效因子3起显著影响作用。
此外由pearson相关系数可知（表3-18），P19的相关系数为正且明显大于其余自变量，但其相关系数仍较小，表明其可能只是相对于其余化学成分对药效因子3有较大的贡献作用，并不能起到决定性作用。其余自变量与药效因子3的相关系数绝对值均很小，大部分小于0.1，因此可认为其对应的化学成分单独对药效因子3的贡献均较小，呈现弱相关关系，它们之间可能具有复杂的协同起效作用。主成分分析结果与灰关联分析结果基本一致。
表3-18复方血栓通差异样品与药效因子3相关性分析结果
cRR-RBF神经网络结合分析：
取岭参数K最小值为0.02，最大值为1，增量为0.02，绘制岭迹图如图17，其中横坐标为岭参数K，纵坐标为自变量标准回归系数。
根据岭迹图，剔除掉标准化岭回归系数比较稳定且绝对值很小的自变量及随着K的增加回归系数不稳定、震动趋于零的自变量，最终筛选的有效、稳定的自变量为P1、P2、P3、P4、P6、P7、P10、P11、P12、P13、P17、P19，重新进行岭回归得到岭迹图18：
通过岭迹图观察可知当K≥0.18时，岭迹曲线趋于稳定，因此取K=0.18，得到所选自变量的参数如表3-19：
表3-19K=0.18时各自变量标准回归系数
| 自变量 | P1 | P2 | P3 | P4 | P6 | P7 | P10 | P11 | P12 | P13 | P17 | P19 |
| K=0.18 | -0.61 | 0.16 | 0.14 | 0.25 | 0.3 | 0.08 | 0.25 | 0.15 | 0.27 | 0.34 | 0.12 | 0.23 |
上述自变量的标准回归系数大小显示了其对应化学成分的相对重要性，由表3-19比较可知，P1的系数为负且绝对值较大，表明其对应的化学成分可能对药效因子3起到负作用，它归属于黄芪药材，其余自变量的系数均为正且绝对值较小，表明这些化学成分单独对药效的贡献均较小，它们之间可能具有协同起效的作用。
运用上述选取的自变量构建9样本有效训练的RBF神经网络，计算各个自变量与因变量药效因子3之间的键结值及自变量标准化重要性，见图19及图20。
自变量与因变量间的键结值表征了两者间相关的正负强弱，而自变量标准化重要性的大小则表征了其与因变量相关的可靠程度，即所计算的键结值的可信度。由图19及图20可知，P1的键结值为负且绝对值相对较大，此外其标准化重要性为100%，因此可知P1所对应的化学成分对药效因子3很可能起到负作用，它归属于黄芪药材。P3、P17的键结值为正且绝对值相对较大，其标准化重要性较高，分别为91.37%和85.97%，表明两者对药效因子3具有较大贡献，它们归属于玄参药材。其余自变量的键结值均为正但绝对值均较小，对药效因子3影响很小，它们之间可能协同作用。上述分析结果与岭回归分析结果基本一致。
d小结
药效因子3表征了大鼠体内内源性凝血系统的正常与否，宏观体现为大鼠血浆活化部分凝血酶时间即APTT。通过灰色关联分析、主成分分析、RR-RBF神经网络结合分析相互结合，基本能够反映复方血栓通差异样品指纹图谱与药效因子3之间的关系。
P13、P3、P17、P19的贡献为正且明显大于其余自变量，对药效因子3贡献作用较强，黄芪药材中的P1可能对药效因子3起到负作用。但从整体上来讲各自变量所对应的化学成分与药效因子3呈现均弱相关关系，各自单独对药效的贡献均较小，说明可能各化学成分为协同作用，并不存在某个化学物质，其含量对药效起决定性作用。
（4）药效因子4
a灰色关联分析
从表3-20可得，各个自变量所代表的化学成分与药效因子4的关联度排序 如下：P19＞P11＞P4＞P6＞P10＞P7＞P17＞P3＞P12＞P1＞P13＞P21＞P20＞P2＞P5＞P8＞P14＞P9＞P18＞P16＞P15。
其中只有P19所对应的化学成分与药效间的关联度大于0.7，它归属于三七药材，这表明其含量的高低可能在很大程度上影响着药效的强弱。
关联度介于0.6至0.7之间（P11……＞P18）的化学成分与药效有一定关联，其中P11、P4、P6、P10、P7、P17、P3的关联度大于0.65且接近于0.7，这表明它们可能对药效有着较强的协同作用，它们分别归属于三七及玄参药材，P9、P18的关联度稍大于0.6，关联作用不强，两者归属于黄芪药材。
P15、P16所对应的化学成分与药效关联度小于0.6，对药效作用不明显，但它们均来自黄芪药材，自变量间共线性现象存在，加之灰色关联分析以绝对值进行分析，不能体现化学成分与药效间的负相关关系，因此有必要结合下面两种方法综合考虑已全面反映各个化学成分的生物活性，确定哪些物质为有效成分、无效成分或有害成分。
表3-20复方血栓通差异样品药效因子4灰色关联分析结果
| 自变量 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 |
| 关联度 | 0.6364 | 0.6175 | 0.6510 | 0.6898 | 0.6173 | 0.6893 | 0.6888 |
| 自变量 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 | P13 | P14 |
| 关联度 | 0.6108 | 0.6027 | 0.6890 | 0.6928 | 0.6386 | 0.6350 | 0.6104 |
| 自变量 | P15 | P16 | P17 | P18 | P19 | P20 | P21 |
| 关联度 | 0.5793 | 0.5889 | 0.6769 | 0.6022 | 0.7077 | 0.6264 | 0.6319 |
b主成分分析
表3-21药效因子4与主成分偏相关系数
| Y4 | F1 | F2 |
| 偏相关系数 | -0.369 | 0.024 |
由表3-21可知药效因子4与主成分F2偏相关系数极小，认为两者不相关， 与主成分F1偏相关系数为-0.369，相关性极弱，故无法对主成分F1、F2建立多元线性方程。因此可认为针对药效因子4没有影响显著的自变量存在，即并不存在某个或某些化学成分对药效因子4起显著影响作用。
此外由pearson相关系数可知（表3-22），P11、P10、P6、P4、P7、P19的相关系数为正且绝对值相对较大，表明其对应的化学成分对药效因子4贡献较大，它们均归属于三七药材。P2、P8、P14、P12、P21、P5、P13、P20的相关系数为负且绝对值相对较大，它们均归属以丹参药材。此外21个自变量与药效因子4的相关系数绝对值均小于0.5，大部分小于0.3，因此可认为其对应的化学成分单独对药效的贡献均较小，呈现弱相关关系，它们之间可能具有复杂的协同起效作用。
主成分分析结果与灰关联分析结果基本一致，二者都在一定程度上表明了三七药材对药效因子4的贡献要强于其余三位药材。
表3-22复方血栓通差异样品与药效因子4相关性分析结果
cRR-RBF神经网络结合分析:
取岭参数K最小值为0.02，最大值为1，增量为0.02，绘制岭迹图如图21，其中横坐标为岭参数K，纵坐标为自变量标准回归系数。
根据岭迹图，剔除掉标准化岭回归系数比较稳定且绝对值很小的自变量及随着K的增加回归系数不稳定、震动趋于零的自变量，最终筛选的有效、稳定的自变量为P1、P2、P3、P4、P6、P7、P10、P11、P12、P13、P17、P19，重新进行岭回归得到岭迹图22：
通过岭迹图观察可知当K≥0.18时，岭迹曲线趋于稳定，因此取K=0.18，得到所选自变量的参数如表3-23：
表3-23K=0.18时各自变量标准回归系数
| 自变量 | P3 | P8 | P11 | P15 | P18 |
| K=0.18 | -0.52 | -0.16 | 0.51 | -0.42 | -0.15 |
上述自变量的标准回归系数大小显示了其对应化学成分的相对重要性，由表3-23比较可知，仅有P11系数为正且绝对值较大，表明其所对应化学成分对药效因子4可能有较大贡献，它归属于三七药材。P3、P15、P8、P18系数为负，其中P3、P15系数绝对值相对较大，对药效因子4可能起到负作用。
运用上述选取的自变量构建9样本有效训练的RBF神经网络，计算各个自变量与因变量药效因子4之间的键结值及自变量标准化重要性，见图23及图24。
自变量与因变量间的键结值表征了两者间相关的正负强弱，而自变量标准化重要性的大小则表征了其与因变量相关的可靠程度，即所计算的键结值的可信度。由图22及图23可知，P11的键结值为正且绝对值较大，其标准化重要性为100%，表明P11很可能对药效因子4起到非常显著正作用，他归属与三七药材。其余自变量的标准化重要性相近，其中P15、P3的键结值为负且绝对值较大，表明其对药效因子4可能起到负作用。上述分析结果与岭回归分析结果基本一致。
d小结
药效因子4表征了大鼠体内红细胞变形性的强弱及血液中血浆蛋白等非细 胞成分含量的高低，宏观体现为大鼠血浆粘度及高切变率下全血黏度。通过灰色关联分析、主成分分析、RR-RBF神经网络结合分析相互结合，基本能够反映复方血栓通差异样品指纹图谱与药效因子4之间的关系。
P11、P10、P6、P4、P7、P19对药效因子4为正作用且贡献较大，其中P11的贡献最强，它们均归属于三七药材，为主要活性成分。P15、P3可能对药效因子4起到负作用。
（5）药效因子5
a灰色关联分析
从表3-24可得，各个自变量所代表的化学成分与药效因子5的关联度排序如下：P1＞P9＞P15＞P18＞P13＞P6＞P4＞P11＞P7＞P10＞P19＞P16＞P20＞P21＞P2＞P3＞P8＞P12＞P14＞P5＞P17。
其中只有P1所对应的化学成分与药效间的关联度大于0.8，它归属于黄芪药材，这表明该成分可能对药效因子5起到决定性作用，其含量的高低在很大程度上影响着药效的强弱。
关联度介于0.7至0.8之间（P9＞……＞P19）的化学成分与药效关联性较强，其中P9、P15、P18的关联度排在前三且在0.75附近，这表明它们可能对药效有着较强的协同作用，它们同P1均归属于黄芪药材，以上表明黄芪对于药效因子5可能具有很强的影响作用。P6、P4、P11、P7、P10、P19的关联度稍大于0.7，对药效起到一定的协同作用，它们均归属于三七药材。
P16、P20、P21、P2、P3、P8、P12、P14、P5、P17所对应的化学成分与药效关系较小（介于0.6至0.7之间），由于自变量间共线性现象依然存在，加之灰色关联分析以绝对值进行分析，不能体现化学成分与药效间的负相关关系，因此有必要结合下面两种方法综合考虑已全面反映各个化学成分的生物活性， 确定哪些物质为有效成分、无效成分或有害成分。
表3-24复方血栓通差异样品药效因子5灰色关联分析结果
| 自变量 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 |
| 关联度 | 0.8302 | 0.6679 | 0.6669 | 0.7236 | 0.6471 | 0.7239 | 0.7222 |
| 自变量 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 | P13 | P14 |
| 关联度 | 0.6586 | 0.7868 | 0.7170 | 0.7227 | 0.6552 | 0.7309 | 0.6511 |
| 自变量 | P15 | P16 | P17 | P18 | P19 | P20 | P21 |
| 关联度 | 0.7460 | 0.6957 | 0.6101 | 0.7322 | 0.7009 | 0.6747 | 0.6701 |
b主成分分析
采用主成分FAC1_1、FAC2_1作为自变量对因变量药效因子5进行回归分析，经逐步回归法Stepwise可得回归方程如下：
Y5=1+0.436XFAC2_1
此外本研究还尝试采用强迫引入法Enter、强迫剔除法Remove、向后引入法Backward及向前剔除法Forward等方法分别建立回归方程。结果显示，强迫引入法、强迫剔除法和向后引入法所建立的方程，自变量FAC1_1对因变量药效因子5影响不显著（P＞0.05），模型稳定性差，故排除由这几种方法分析所得到的回归方程，向前剔除法所建立的回归方程，与逐步回归法所得的结果一致。
将因子得分函数带入上述方程后可得(原自变量的参数值见表3-25)
Y5=1+0.0457P1+0.0125P2-0.0418P3+0.0318P4+0.0133P5+0.0299P6+0.0284P7+0.0130P8+0.0464P9+0.0269P10+0.0288P11+0.0139P12-0.0047P13+0.0128P14+0.0464P15+0.0464P16-0.0466P17+0.0470P18+0.0109P19+0.0089P20+0.0137P21
各自变量的系数可视为权重系数，在一定程度上反映了各个自变量所对应的化学成分的相对重要性。如P18、P16、P9、P15、P1、P4、P6、P11、P7、P10 的系数为正且绝对值相对较大，表明其所对应的化学成分对药效因子5的贡献较大，其中前5个成分归属于黄芪药材，后5个成分归属于三七药材，P3、P17的系数为负且绝对值相对较大，表明其所对应的化学成分可能对药效因子5起到负作用，两者归属于玄参药材。另外其他自变量的系数绝对值相对较小，说明其对应的化学成分对药效因子5的影响较小。主成分分析结果与灰关联分析结果基本一致，均表明黄芪药材对药效因子5具有较大贡献，三七药材则起到一定的协同起效作用。
表3-25复方血栓通差异样品药效因子5主成分分析结果
| 自变量 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 |
| 系数/10-2 | 4.5714 | 1.2548 | -4.1761 | 3.1841 | 1.3270 | 2.9918 | 2.8360 |
| 自变量 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 | P13 | P14 |
| 系数/10-2 | 1.2974 | 4.6382 | 2.6910 | 2.8802 | 1.3876 | -0.4653 | 1.2754 |
| 自变量 | P15 | P16 | P17 | P18 | P19 | P20 | P21 |
| 系数/10-2 | 4.6373 | 4.6437 | -4.6583 | 4.6972 | 1.0864 | 0.8928 | 1.3743 |
cRR-RBF神经网络结合分析
取岭参数K最小值为0.02，最大值为1，增量为0.02，绘制岭迹图如图25，其中横坐标为岭参数K，纵坐标为自变量标准回归系数。
根据岭迹图，剔除掉标准化岭回归系数比较稳定且绝对值很小的自变量及随着K的增加回归系数不稳定、震动趋于零的自变量，最终筛选的有效、稳定的自变量为P1、P19、P20、P21，重新进行岭回归得到岭迹图26。
通过岭迹图观察可知当K≥0.18时，岭迹曲线趋于稳定，因此取K=0.18，得到所选自变量的参数如表3-26：
表3-26K=0.18时各自变量标准回归系数
| 自变量 | P1 | P19 | P20 | P21 |
| K=0.18 | 0.62 | 0.14 | 0.33 | 0.16 |
上述自变量的标准回归系数大小显示了其对应化学成分的相对重要性，由表3-26比较可知，四个自变量的系数均为正，其中P1的系数相对较大，表明其所对应的化学成分对药效因子5具有较强的贡献，它归属于黄芪药材。P20、P21、P19的系数相对较小，对药效同样具有一定的增强作用，其中P20、P21归属于丹参药材，P19归属于三七药材。
运用上述选取的自变量构建9样本有效训练的RBF神经网络，计算各个自变量与因变量药效因子5之间的键结值及自变量标准化重要性，见图27及图28。
自变量与因变量间的键结值表征了两者间相关的正负强弱，而自变量标准化重要性的大小则表征了其与因变量相关的可靠程度，即所计算的键结值的可信度。由图26及图27可知，P1的键结值为正且绝对值显著高于其余自变量，其标准化重要性为100%，表明其所对应的化学成分对药效因子5具有很强的正作用，与岭回归分析结果一致，它归属于黄芪药材。
与岭回归分析结果稍有不同，P19的键结值为正且较大，表明其对药效因子5可能起到较强的贡献，它归属于三七药材；P20、P21的键结值与标准化重要性均很小，对药效因子5影响较小。
d小结
药效因子5表征了大鼠体内外源性凝血系统的正常与否，宏观体现为大鼠血浆凝血酶原时间即PT。通过灰色关联分析、主成分分析、RR-RBF神经网络结合分析相互结合，基本能够反映复方血栓通差异样品指纹图谱与药效因子5之间的关系。
P1、P9、P15、P16、P18对药效因子5为正作用且贡献较大，其中P1贡献最强，它们均归属以黄芪药材，为主要活性成分。P4、P6、P11、P7、P10、P19对药效因子5也有一定的正作用，其中P4、P19较强，它们均归属于三七药材。 玄参药材中P3、P17可能对药效因子5起到负作用。
综上所述，药效因子1～5分别表征了大鼠血液系统功能正常的5个方面，依次是红细胞聚集性、血小板聚集性、内源性凝血系统、红细胞变形性及血浆蛋白、外源性凝血系统。三七药材中P19、P11、P10、P6、P4为主要生物活性成分，其中P19对红细胞聚集性贡献为21个化学成分中最强，且对内源性凝血系统具有较强的药效作用，P11对红细胞变形性及血浆蛋白贡献最强，P10、P6、P4对红细胞聚集性及变形性的改善上同样起到了十分重要的作用。玄参药材中P3、P17为主要活性成分，其中P3对血小板聚集贡献为21个化学成分中最强。黄芪药材中P1、P18、P16为主要活性成分，其中P1其所代表的化学成分对大鼠外源性凝血系统贡献显著大于其余化学成分，单独对药效的贡献为21个化学成分中最强，另外P1对血小板聚集也具有一定的正作用。丹参中P13、P20、P21为主要活性成分，其中P13对内源性凝血系统贡献为21个化学成分中最强。综上可知针对大鼠瘀血改善起到显著影响的化学成分包括三七药材中的P11、P19、P10，黄芪药材中的P1，玄参药材中P3，丹参药材中的P13、P20、P21。
结合复方血栓通指纹图谱共有峰的归属定性结果，其中生物活性成分群分别为P1为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（5号峰），P3为安格洛苷C（8号峰），P10为人参皂苷Rb1（26号峰），P11为人参皂苷Rd（29号峰），P13为原儿茶醛（3号峰），P19为人参炔三醇（39号峰），P20为丹参酮Ⅰ（38号峰），P21为丹参酮ⅡA（42号峰）。在明确复方血栓通制剂生物活性成分群的基础上，结合优化后HPLC指纹图谱构建方法建立复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱，用于控制药品生产中的质量均一性、安全性及有效性，所述图谱的图形如说明书附图中的图29所示。
本发明中复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法简单实用、准 确可靠，在更为全面地反映复方血栓通制剂化学物质基础的同时系统阐明了其生物活性物质基础，适用于复方血栓通胶囊以及其他剂型，并为其他中药复方制剂研究提供了研究思路与范例。
综上所述，尽管本发明通过具体实施方式对本发明进行了详细描述，但本领域一般技术人员应该明白的是，上述实施例仅仅是对本发明的优选实施例的描述，而非对本发明保护范围的限制，本领域一般技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化，均在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于包括如下步骤:
(1)配制复方血栓通制剂供试品溶液，精密吸取10μl复方血栓通制剂供试品溶液，注入双泵双梯度高效液相色谱仪，得到复方血栓通制剂HPLC标准指纹图谱；
（2）配制混合对照品溶液，精密吸取10μl混合对照品溶液，注入双泵双梯度高效液相色谱仪，得到对照品HPLC指纹图谱；
（3）利用对照品对照法，采用RRLC/MS/MS技术手段指证指纹图谱中21个化学成分；
（4）分析21个化学成分与生物活性差异关联性，阐明生物活性成分群，建立复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱，具体方法为筛选临床常用血液流变及凝血功能药效学检测指标；利用配方约束下均匀设计原则对组方中四味药材进行重新组合构建复方血栓通制剂差异样品；构建差异样品指纹图谱，获得色谱峰信息；进行差异样品大鼠急性血瘀模型药效学实验，获得其生物活性信息；运用因子分析方法简化差异样品生物活性数据并解释其临床意义，运用多种关联分析方法综合分析差异样品中21个已知成分色谱峰差异与生物活性差异关联性，阐明生物活性成分群，建立复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱；其中，利用冰浴结合皮下注射肾上腺素复制大鼠急性血瘀模型进行药效学实验，考察复方血栓通制剂临床等效剂量即380mg/kg/d、中剂量即760mg/kg/d、高剂量即1520mg/kg/d下给药对血液流变及凝血功能药效学指标的影响，筛选出11个药效学检测指标，分别为切变率分别为5s-1、30s-1、50s-1、150s-1、200s-1的全血黏度、红细胞聚集指数、红细胞电泳指数、APTT、PT、血小板最大聚集率、血浆粘度，用于复方血栓通差异样品药效学实验，获得差异样品生物活性信息；运用因子分析方法中主成分提取法从11个所筛选药效学指标中提取出5个公因子即药效因子1～5，解释原数据信息的97.998%且互不重叠，并通过方差极大旋转法明确药效因子1～5分别表征了大鼠体内红细胞聚集性、血小板聚集性、内源性凝血系统、红细胞变形性及血浆蛋白、外源性凝血系统，利用汤姆逊回归法计算差异样品各药效因子得分表征其生物活性，上述方法运用SPSS18.0中分析项下数据降维中的因子分析模块实现。
2.如权利要求1所述的复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）的复方血栓通制剂供试品溶液的配制方法为精密称取复方血栓通制剂0.1g～10.0g，用50%～100%甲醇提取1～3次，每次10～60分钟，每次10～100ml，滤过，合并滤液，蒸干，加50%甲醇配成供试品溶液。
3.如权利要求1所述的复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）的混合对照品溶液的配制方法为精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、丹参酮ⅡA、丹酚酸B对照品适量，加50%甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg1500μg、人参皂苷Rb1500μg、三七皂苷R1100μg、丹参酮ⅡA20μg、丹酚酸B40μg的混合对照品溶液。
4.如权利要求1所述的复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于：所述HPLC色谱条件采用长度为150mm、十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱温25℃；以乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱，0～50分钟，乙腈由15%变至34%，50～95min，乙腈由34%变至75%,流速为1.0ml/min；以紫外检测器检测，检测波长为203nm，270nm。
5.如权利要求1所述的复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于：用指纹图谱相似度评价软件分析得到复方血栓通制剂HPLC标准指纹图谱，有42个共有峰，其中，归属于三七的特征峰为2号峰、4号峰、10号峰、13号峰、14号峰、24号峰、25号峰、26号峰、29号峰、30号峰、32号峰、33号峰、36号峰、38号峰、41号峰，共15个峰；归属于丹参的特征峰为1号峰、3号峰、7号峰、9号峰、11号峰、15号峰、16号峰、18号峰、23号峰、31号峰、34号峰、35号峰、37号峰、39号峰、40号峰、42号峰，共16个峰；归属于黄芪的特征峰为5号峰、12号峰、17号峰、19号峰、27号峰、28号峰，共6个峰；归属于玄参的特征峰为6号峰、8号峰、22号峰，共3个峰；归属于黄芪、丹参、玄参三味药材浸膏的特征峰为20号峰，共1个峰；归属于三七药材浸膏的特征峰为21号峰，共1个峰。
6.如权利要求1所述的复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于：利用对照品对照法指证3号峰为原儿茶醛、5号峰为毛蕊异黄酮苷、9号峰为迷迭香酸、10号峰为三七皂苷R1、12号峰为芒柄花苷、13号峰为人参皂苷Rg1、14号峰为人参皂苷Re、15号峰为丹酚酸B、22号峰为哈巴俄苷、26号峰为人参皂苷Rb1、27号峰为芒柄花素、37号峰为隐丹参酮、38号峰为丹参酮Ⅰ、42号峰为丹参酮ⅡA；利用RRLC/MS/MS技术手段，通过质谱中分子离子峰、碎片离子峰以及HPLC-DAD紫外吸收曲线的比较、保留时间匹配信息的比较指证3号峰为原儿茶醛、5号峰为毛蕊异黄酮苷、7号峰为紫草酸、8号峰为安格洛苷C、9号峰为迷迭香酸、10号峰为三七皂苷R1、11号峰为丹酚酸A、12号峰为芒柄花苷、13号峰为人参皂苷Rg1、14号峰为人参皂苷Re、15号峰为丹酚酸B、16号峰为9,10-二甲基氧紫檀烷-3-O-β-D-葡萄吡喃糖苷、19号峰为毛蕊异黄酮、22号峰为哈巴俄苷、26号峰为人参皂苷Rb1、27号峰为芒柄花素、29号峰为人参皂苷Rd、37号峰为隐丹参酮、38号峰为丹参酮Ⅰ、39号峰为人参炔三醇、42号峰为丹参酮ⅡA。
7.根据权利要求书1所述复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于：以复方血栓通制剂组方中四味药材质量百分含量为四个因素，进行四因素九水平配方约束下均匀设计构建差异样品1～9号，其中三七百分含量依次为64%、61.5%、59%、56.5%、54%、51.5%、49%、46.5%、44%，黄芪百分含量依次为9%、22.5%、36%、4.5%、18%、31.5%、0%、13.5%、27%，丹参百分含量依次为0%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%，玄参百分含量依次为27%、13.5%、0%、31.5%、18%、4.5%、36%、22.5%、9%，在该构建方案指导下，按照《中华人民共和国药典》2010年版复方血栓通胶囊标准生产工艺进行制备得到各差异样品浸膏用于药效学实验。
8.根据权利要求书1所述复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于：以复方血栓通制剂HPLC指纹图谱中所指证的21个色谱峰峰面积为自变量，若在203nm、270nm波长下均能检测到则选择峰面积较大者,以差异样品药效因子1～5因子得分为因变量，运用灰色关联分析、主成分分析、偏最小二乘法、径向基函数神经网络四种方法对两者间关联性进行综合分析。
9.根据权利要求书1所述复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法，其特征在于：通过谱效关联分析，明确复方血栓通制剂HPLC标准指纹图谱中42个共有峰中的生物活性成分群为3号峰、5号峰、8号峰、26号峰、29号峰、38号峰、39号峰、42号峰，其中所述3号峰为原儿茶醛、5号峰为毛蕊异黄酮苷、8号峰为安格洛苷C、26号峰为人参皂苷Rb1、29号峰为人参皂苷Rd、38号峰为丹参酮Ⅰ、39号峰为人参炔三醇、42号峰为丹参酮ⅡA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310003184.2A CN103257188B (zh) | 2013-01-05 | 2013-01-05 | 一种复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310003184.2A CN103257188B (zh) | 2013-01-05 | 2013-01-05 | 一种复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103257188A CN103257188A (zh) | 2013-08-21 |
| CN103257188B true CN103257188B (zh) | 2014-04-02 |
Family
ID=48961229
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310003184.2A Active CN103257188B (zh) | 2013-01-05 | 2013-01-05 | 一种复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103257188B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2620014C1 (ru) * | 2016-07-14 | 2017-05-22 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Московский научно-исследовательский институт глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ моделирования ишемии глаза |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104297360B (zh) * | 2014-07-28 | 2015-10-21 | 广东众生药业股份有限公司 | 一种复方血栓通制剂指纹图谱的检测方法 |
| CN104147032B (zh) * | 2014-07-29 | 2016-07-27 | 广东众生药业股份有限公司 | 一种用于防治缺血性中风相关疾病的药物组合物及其制备方法和用途 |
| CN105606831A (zh) * | 2016-01-29 | 2016-05-25 | 河南中医学院 | 一种基于血液凝集活性的血栓通冻干粉针质量检测方法 |
| CN105699563A (zh) * | 2016-04-25 | 2016-06-22 | 广西壮族自治区梧州食品药品检验所 | 双波长高效液相色谱检测血栓通的方法 |
| CN106290643B (zh) * | 2016-08-17 | 2019-01-04 | 辽宁中医药大学 | 一种中药荆芥抗肺癌活性成分的质量控制方法 |
| CN107742058A (zh) * | 2017-09-11 | 2018-02-27 | 中山大学 | 一种研究复方血栓通制剂各药材组分药效关系的方法 |
| CN107764911A (zh) * | 2017-09-11 | 2018-03-06 | 中山大学 | 复方中药具有化学成分含量差异的样品构建方法 |
| CN107764926A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-03-06 | 哈尔滨珍宝制药有限公司 | 一种三七总皂苷提取物的指纹图谱及其建立方法 |
| CN107748219B (zh) * | 2017-11-23 | 2020-09-29 | 山东沃华医药科技股份有限公司 | 一种脑血疏制剂指纹图谱的测定方法 |
| CN108195989B (zh) * | 2018-02-01 | 2021-04-20 | 山西省医药与生命科学研究院 | 一种基于抗血栓谱效关系的黄刺玫化学成分评价方法 |
| CN109100460A (zh) * | 2018-10-18 | 2018-12-28 | 大理大学 | 一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法 |
| CN109541068A (zh) * | 2018-12-14 | 2019-03-29 | 吉林省德商药业股份有限公司 | 一种复幼合剂成分检测方法 |
| CN109589331B (zh) * | 2019-02-19 | 2021-02-19 | 刘晓双 | 一种抑制术后静脉血栓形成的外用药物及其用途 |
| CN110441422A (zh) * | 2019-08-05 | 2019-11-12 | 中南民族大学 | 参类药材中抗凝药效成分的确定方法 |
| CN110376312B (zh) * | 2019-08-20 | 2022-03-04 | 陕西中医药大学 | 中药质量等级检测方法 |
| CN110907581B (zh) * | 2019-12-23 | 2022-07-01 | 广州医药研究总院有限公司 | 复方丹参制剂七种成分血浆或组织浓度的质谱检测方法 |
| CN111429978B (zh) * | 2020-03-20 | 2022-12-16 | 广东药科大学 | 一种快速发现中药复方有效组分的方法和应用 |
| CN112697549A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-04-23 | 重庆医科大学 | 一种木芙蓉叶黄酮成分鉴定方法 |
| CN117330678B (zh) * | 2023-12-01 | 2024-02-09 | 内蒙古亿利制药有限公司 | 蓉蛾益肾口服液的质量检测方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1670529A (zh) * | 2005-03-28 | 2005-09-21 | 广东众生药业股份有限公司 | 复方血栓通制剂hplc指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱 |
-
2013
- 2013-01-05 CN CN201310003184.2A patent/CN103257188B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1670529A (zh) * | 2005-03-28 | 2005-09-21 | 广东众生药业股份有限公司 | 复方血栓通制剂hplc指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 孙琴 等.板蓝根中红细胞凝集效应组分的谱效关系研究.《中草药》.2012,第43卷(第1期),摘要部分. |
| 板蓝根中红细胞凝集效应组分的谱效关系研究;孙琴 等;《中草药》;20120131;第43卷(第1期);摘要部分 * |
| 梁洁萍,刘忠政,彭维,苏薇薇.复方血栓通胶囊HPLC指纹图谱质量控制方法研究.《中药材》.2012,第35卷(第11期),摘要部分. * |
| 药典委员会.复方血栓通胶囊.《中华人民共和国药典—2010年第一部》.医药科技出版社,2010,909-910. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2620014C1 (ru) * | 2016-07-14 | 2017-05-22 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Московский научно-исследовательский институт глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ моделирования ишемии глаза |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103257188A (zh) | 2013-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103257188B (zh) | 一种复方血栓通制剂生物活性色谱指纹图谱的构建方法 | |
| CN106501434B (zh) | 一种双和汤标准汤的hplc指纹图谱测定方法 | |
| CN102539553B (zh) | 一种强肝药物的指纹图谱的建立方法 | |
| CN101007072B (zh) | 一种中药血必净注射液的质量检测方法 | |
| Zhang et al. | Screening and identification of α‐glucosidase inhibitors from Shenqi Jiangtang Granule by ultrafiltration liquid chromatography and mass spectrometry | |
| CN103884811A (zh) | 一种生物色谱比较筛选系统及其应用 | |
| CN111681715A (zh) | 一种覆盆子质量标志物及其制备方法 | |
| CN113791152B (zh) | 一种hplc法测定痫愈胶囊中多种有效成分含量的方法 | |
| CN103645251B (zh) | 一种复方阿胶制剂的指纹图谱检测方法 | |
| CN105510488B (zh) | 一种止痛贴剂的指纹图谱及其质量检测方法 | |
| CN102539599B (zh) | 一种强肝药物的检测方法 | |
| CN111103369B (zh) | 一种复方中药特征图谱构建及含量测定方法 | |
| CN101672834A (zh) | 一种治疗糖尿病视网膜病变的中药制剂的质量检测方法 | |
| CN106290643A (zh) | 一种中药荆芥抗肺癌活性成分的质量控制方法 | |
| CN102068553B (zh) | 一种治疗气滞血瘀所致乳癖制剂的hplc指纹图谱的构建方法 | |
| CN113759056B (zh) | 一种半边莲及其制剂的特征图谱及其构建方法 | |
| CN101837076A (zh) | 一种中药组合物制剂及制备方法和质量检测方法 | |
| CN108226325A (zh) | 葶苈生脉口服液组合物指纹图谱的建立方法 | |
| CN103239506A (zh) | 通脉口服液原料药提取物 | |
| CN107894466B (zh) | 一种金桑芪抗毒制剂hplc指纹图谱的测定方法及金桑芪抗毒制剂质量控制方法 | |
| CN113155994A (zh) | 一种建立筋骨草的药物制剂的指纹图谱的方法 | |
| CN106018647B (zh) | 一种建立葵花盘hplc标准指纹图谱的方法 | |
| CN103263467A (zh) | 强力脑心康药物及制备方法和含量测定 | |
| CN115754094B (zh) | 一种癃闭舒制剂指纹图谱及其建立方法和应用 | |
| CN105044301B (zh) | 一种三七活血化瘀活性的检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |