CN109100460A - 一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法 - Google Patents

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杨永寿
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Abstract

本发明属于中药指纹图谱分析技术领域，本发明公开了一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法包括步骤：B、构建ML‑HB指纹图谱，结合其指纹图谱中色谱峰面积值利用偏最小二乘法构建谱效关系回归方程，选出美洲大蠊抗肺纤维化活性部位ML‑HB的色谱峰中与药理活性正相关的共有峰。本发明建立了美洲大蠊抗肺纤维化活性部位ML‑HB的HPLC‑ELSD指纹图谱与其抑制HEL细胞增长的谱效关系，与单纯的化学成分指纹图谱相比较，能更好的反映化学指纹图谱中的信息与药理活性之间的关系，为ML‑HB的质量控制研究提供了新的思路。

Description

一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法
技术领域
本发明属于中药指纹图谱分析技术领域，具体涉及一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法。
背景技术
目前中药指纹图谱作为一种基于中药化学成分信息，综合的、可量化的鉴别手段，已成为国际公认的控制天然药物、中成药质量最有效的方法，能够很好地与中药特点相匹配，达到对中药质量的控制和分析的目的。但指纹图谱的研究和建立只是对中药成分的稳定性和可控性改进，与中药的功效没有直接的内在联系，只有将中药指纹图谱中化学成分的变化与中药药效结合起来，建立有实际意义的中药谱效关系，才能为中药的质量控制和药效评价标准提供规律性的科学依据。
美洲大蠊(Periplaneta americana L.)为昆虫纲，蜚蠊目，蜚蠊科，俗称蟑螂。其药用价值在《神农本草经》和《本草纲目》中均有记载。近年来大量研究证实了美洲大蠊具有多种药理作用，在抗氧化、创伤修复、抗肝损伤和抗纤维化等亦有大量的研究。然而，现有技术中并没有很好的分析其物质基础和药效之间的关系，从而不能够对美洲大蠊抗肺纤维化活性部位ML-HB进行较好的研究。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法。
本发明所采用的技术方案为：
一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法，包括步骤：B、构建ML-HB指纹图谱，结合其指纹图谱中色谱峰面积值利用偏最小二乘法构建谱效关系回归方程，选出美洲大蠊抗肺纤维化活性部位ML-HB的色谱峰中与药理活性正相关的共有峰。
进一步的，所述步骤B之前还包括步骤A：A、测定美洲大蠊的具有体外活性的抗肺纤维化活性部位：以IC50值作为观测指标，采用MTT比色法对美洲大蠊抗肺纤维化活性部位进行活性检测，选出对HEL细胞有抑制作用的美洲大蠊抗肺纤维化活性部位ML-HB的给药浓度。
进一步的，所述步骤A的具体步骤包括：
a1.样品制备：用乙醇提取出美洲大蠊的活性滤液后，用吸附树脂吸附、洗脱后分别得到5个洗脱部位的洗脱液，即ML-A1洗脱液、ML-A2洗脱液、ML-A3洗脱液、ML-A4洗脱液和ML-HB洗脱液；将ML-HB洗脱液冷冻干燥后得到ML-HB冻干粉；
a2.ML-HB对HEL细胞抑制作用的抑制作用测定：将ML-HB冻干粉配制成溶液后用其培养HEL细胞，计算ML-HB抑制HEL细胞增长的IC50值。
进一步的，所述步骤B的具体步骤包括：
b1.样品溶液的配制：用甲醇溶解不同质量的ML-HB冻干粉，过滤后，分别得到不同浓度的样品溶液；
b2.制作色谱图：将所有的样品溶液在色谱条件下用色谱仪进行测定，得到色谱图；
b3.色谱峰匹配：将色谱图中的各个色谱峰与中药色谱指纹图谱进行比对，找出各个共有峰；
b4.计算所述各个共有峰的峰面积值，将峰面积值作为自变量，IC50值作为因变量，利用偏最小二乘法构建谱效关系回归方程，根据回归系数的正负，分别选出正相关和负相关的共有峰。
进一步的，还包括步骤b5.根据正相关的共有峰构建ML-HB的HPLC-ELSD指纹图谱。
进一步的，不同浓度的样品溶液的给药浓度分别为50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml和90μg/ml。
进一步的，所述色谱条件为：采用C18色谱柱，流动相A为含TFA的质量体积浓度为0.05％的水，流动相C为含TFA的质量体积浓度为0.05％的乙腈，采用梯度洗脱方式，流速0.9ml/min，柱温35℃；检测器为ELSD检测器；Evap 60℃，Neb 45℃，Gas 1.4，进样量10μl。
进一步的，所述步骤b3将色谱图中的各个色谱峰采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，进行色谱峰比对，找出各个共有峰。
本发明的有益效果为：本发明通过运用偏最小二乘法将ML-HB的药效学信息与HPLC-ELSD指纹图谱中的化学信息进行相关性研究，得到HPLC-ELSD图中X1、X6、X8、X9、X12号峰为正相关峰，根据该正相关封得出了如下结论，ML-HB抑制HEL细胞增长不单单取决于其中一个物质的作用，而是其内部“化学组分群”共同作用的结果。另外，本发明建立了美洲大蠊抗肺纤维化活性部位ML-HB的HPLC-ELSD指纹图谱与其抑制HEL细胞增长的谱效关系，与单纯的化学成分指纹图谱相比较，能更好的反映化学指纹图谱中的信息与药理活性之间的关系，为ML-HB的质量控制研究提供了新的思路。
附图说明
图1是10批样品HPLC-ELSD叠加图。
图2是10批样品共有模式对照图谱R。
图2中1-12分别对应X1-X12号峰。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。
如图1-2所示的，一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法，包括步骤：B、构建ML-HB指纹图谱，结合其指纹图谱中色谱峰面积值利用偏最小二乘法构建谱效关系回归方程，选出美洲大蠊抗肺纤维化活性部位ML-HB的色谱峰中与药理活性正相关的共有峰。
进一步的，所述步骤B之前还包括步骤A：A、测定美洲大蠊的具有体外活性的抗肺纤维化活性部位：以IC50值作为观测指标，采用MTT比色法对美洲大蠊抗肺纤维化活性部位进行活性检测，选出对HEL细胞有抑制作用的美洲大蠊抗肺纤维化活性部位ML-HB的给药浓度。
进一步的，所述步骤A的具体步骤包括：
a1.样品制备：用乙醇提取出美洲大蠊的活性滤液后，用吸附树脂吸附、洗脱后分别得到5个洗脱部位的洗脱液，即ML-A1洗脱液、ML-A2洗脱液、ML-A3洗脱液、ML-A4洗脱液和ML-HB洗脱液；将ML-HB洗脱液冷冻干燥后得到ML-HB冻干粉；
a2.ML-HB对HEL细胞抑制作用的抑制作用测定：将ML-HB冻干粉配制成溶液后用其培养HEL细胞，计算ML-HB抑制HEL细胞增长的IC50值。
进一步的，所述步骤B的具体步骤包括：
b1.样品溶液的配制：用甲醇溶解不同质量的ML-HB冻干粉，过滤后，分别得到不同浓度的样品溶液；
b2.制作色谱图：将所有的样品溶液在色谱条件下用色谱仪进行测定，得到色谱图；
b3.色谱峰匹配：将色谱图中的各个色谱峰与中药色谱指纹图谱进行比对，找出各个共有峰；
b4.计算所述各个共有峰的峰面积值，将峰面积值作为自变量，IC50值作为因变量，利用偏最小二乘法构建谱效关系回归方程，根据回归系数的正负，分别选出正相关和负相关的共有峰。
进一步的，还包括步骤b5.根据正相关的共有峰构建ML-HB的HPLC-ELSD指纹图谱。
进一步的，不同浓度的样品溶液的给药浓度分别为50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml和90μg/ml。
进一步的，所述色谱条件为：所述色谱条件为：采用C18色谱柱，流动相A为含0.05％TFA(w/t)的水，流动相C为含0.05％TFA(w/t)的乙腈，采用梯度洗脱方式，流速0.9ml/min，柱温35℃；检测器为ELSD检测器；Evap 60℃，Neb 45℃，Gas 1.4，进样量10μl。
其中，w/t，表示质量体积浓度，TFA为三氟乙酸。
进一步的，所述步骤b3将色谱图中的各个色谱峰采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，进行色谱峰比对，找出各个共有峰。
实施例
1实验材料和仪器
1.1细胞株
人胚胎肺成纤维细胞HEL(购于中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库)。
1.2实验仪器
Agilent1260型高效液相色谱仪(包括G1311D四元泵、G1313D自动进样器、G1316D柱温箱、ELSD检测器，美国安捷伦公司)；电子分析天平(AL204-IC型，梅特勒-托利多仪器有限公司)；多功能酶标仪(SN255939型，BIO-Tek公司)；CO2恒温培养箱(3111型，美国Thermo公司)；恒温水浴锅(HWS12型，上海一恒科学仪器有限公司)；立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-50SII型，上海博讯实业有限公司)；普通冰箱(BCD-521WDPW型，青岛海尔股份有限公司)；双人单面净化工作台(SW-CJ-2F-D型，苏州净化设备有限公司)；双重纯水蒸馏器(30-ZD型，上海亚荣生化仪器厂)；台式高速离心机(80-2型，金坛市科析仪器有限公司)；超声波清洗器(SK3200LH型，上海科导超声仪器有限公司)；分析天平(AL240-IC型，梅特勒-托利多仪器有限公司)；Waters Symmetry C18(250×4.60mm，5μm)；MINITAB数据处理软件。
1.3实验试剂
DMEM粉剂培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Millipore公司)；MTT(Thermo公司)；DMSO(北京Solarbio公司)；乙腈为色谱纯；水为超纯水，其余试剂为分析纯；D101大孔树脂(廊坊淼阳化工有限公司)。
1.4实验药材
美洲大蠊(Periplaneta americana)药材由云南省大理州弥渡县美蠊养殖基地提供，共10批(批号：20140109、20140120、20140225、20140415、20140603、20150220、20150507、20151002、20161107、20170910；-20℃冰箱贮存)，经大理大学杨自忠教授(云南省昆虫生物医药研发重点实验室)鉴定为昆虫纲蜚蠊科昆虫美洲大蠊Periplanetaamericana L.。
2实验方法与结果
2.1抗肺纤维化活性部位的体外活性测定
2.1.1样品的制备
称取美洲大蠊药材适量，粉碎，用5倍量50％乙醇于60℃恒温水浴锅中回流提取3次，提取时间分别为2h、1h、1h，趁热过滤，合并滤液，于60℃下减压浓缩，回收溶剂，石油醚脱脂，取下层液离心沉降，取上清液减压浓缩至一定浓度，经D-101型大孔树脂吸附过夜，用不同浓度的洗脱剂进行梯度洗脱，共得5个洗脱部位，分别命名为ML-A1、ML-A2、ML-A3、ML-A4、ML-HB(抗肺纤维化活性部位)，冷冻干燥，得冻干粉，称重。
2.1.2样品溶液的配制
称取ML-HB冻干粉适量，用含1％FBS的DMEM培养基溶解配成浓度为250μg/ml的溶液，用0.22μm的无菌微孔滤头过滤，加含1％FBS的DMEM培养基依次稀释成浓度为90、80、70、60、50μg/ml的样品溶液，现配现用。
2.1.3HEL细胞的培养
细胞复苏后培养于含10％FBS的DMEM培养基中，置37℃、5％CO2的培养箱中培养，每2天换液一次，待细胞长至90％左右即可传代(一般2-3天)。
2.1.4给药方案
选取对数生长期的HEL细胞，调整细胞浓度至4×104个/ml，接种于96孔板，每孔100μl，置37℃、5％CO2培养箱中培养12h后弃上清液，更换非完全培养基，饥饿处理6小时。分别加入不同浓度的ML-HB样品溶液，每个浓度设5个复孔，同时设置空白对照组和正常组。分别继续培养24h、48h和72h，取出培养板，弃去上清液，加入MTT溶液20μl/孔，培养4h后，加150μl/孔的DMSO溶液，待紫色结晶溶解后，于波长490nm处检测各孔OD值，并计算ML-HB抑制HEL细胞增长的IC50值。
2.1.5实验结果
由表1可知，在实验剂量下，10批美洲大蠊抗肺纤维化活性部位ML-HB对HEL细胞均有较好抑制作用，其24、48和72h的IC50分别在44.46～52.86μg/ml、44.90～51.49μg/ml和41.90～50.11μg/ml之间。
表1美洲大蠊洗脱物ML-HB对HEL的影响(x±s，n＝5)
2.2抗肺纤维化活性部位的HPLC-ELSD指纹图谱研究
2.2.1样品溶液的配制
精密称取ML-HB冻干粉约10mg于10ml量瓶中，加适量甲醇超声溶解，定容至刻度，混匀，经0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液适量，备用。
2.2.2色谱条件
采用Waters Symmetry C18(250×4.60mm,5μm)色谱柱，流动相A为水(含0.05％TFA)，流动相C为乙腈(含0.05％TFA)，采用梯度洗脱方式，洗脱条件见表2，流速0.9ml/min，柱温35℃，ELSD检测器，Evap 60℃，Neb 45℃，Gas 1.4，进样量10μl。
表2梯度洗脱条件
2.2.3方法学考察
①精密度考察精称“20140109”批次冻干粉1份，按本章“2.2.1”项配制，按本章“2.2.2”项条件连续进样6次测定，计算各共有峰保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)，由实验结果得到各共有峰的保留时间和峰面积RSD值均小于3％，表明仪器精密度良好；②重复性考察精称“20140109”批次冻干粉6份，按本章“2.2.1”项配制，按本章“2.2.2”项条件进样测定，计算各共有峰保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)，由实验结果得到各共有峰的保留时间和峰面积RSD值均小于3％，表明重复性良好；③稳定性考察精称“20140109”批次冻干粉1份，按本章“2.2.1”项配制，按本章“2.2.2”项条件分别在0、2、4、6、8、10、12h进样测定，计算各共有色谱峰保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)，由实验结果得到各共有峰的保留时间和峰面积RSD值均小于3％，表明该样品在12h内稳定。
2.2.4共有模式对照图谱的生成
将10批ML-HB样品，依“2.2.1”项制备供试液，按“2.2.2”色谱条件进样测定，记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，进行色谱峰自动匹配，通过比较10批样品图谱，共确定了12个共有峰。10批样品共有峰的保留时间与峰面积结果见表3、4，10批样品共有峰的保留时间RSD值在0.16％～0.46％范围内，表明指纹图谱建立的方法可靠、重现性良好。10批样品的峰面积的RSD在23.21％～46.85％之间变化，说明不同批号的样品成分含量存在差异。10批样品HPLC-ELSD叠加图，见图1，共有模式对照图谱R，见图2。
表3 10批样品保留时间结果
表4 10批样品峰面积结果
2.2.5相似度评价
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件对10批样品进行相似度分析，结果见表5。10批样品与共有模式对照图谱R比较，相似度全部在0.960以上，相似度良好，初步判断样品的质量相似。
表5 10批样品指纹图谱相似度计算结果
2.3抗肺纤维化活性部位谱效关系的建立
以HPLC-ELSD指纹图谱中12个共有峰的峰面积作为自变量(X)，依次编号为X1、X2、X3…X12，10批ML-HB抑制HEL细胞增长的IC50值作为因变量(Y)，将数据分别代入MINITAB统计软件的偏最小二乘回归分析中，建立ML-HB谱效关系回归方程，得到如下方程：
(1)Y24h＝1.39703X1-0.83868X2-0.15109X3-0.57682X4-0.15644X5+0.29961X6-0.08128X7+0.06406X8+0.38966X9+0.11435X10+0.10692X11+0.11957X12(R2＝0.939)
(2)Y48h＝1.71184X1-0.91175X2-0.32951X3-0.73443X4-0.38165X5+0.42395X6-0.45951X7+0.24473X8+0.59717X9-0.04101X10-0.06536X11+0.27444X12(R2＝0.977)
(3)Y72h＝1.36169X1-0.24476X2-0.57495X3-0.22872X4-0.78222X5+0.18227X6-0.37596X7+0.58801X8+0.21298X9-0.17168X10-0.04619X11+0.12828X12(R2＝0.982)
由12个共有峰的峰面积(自变量，X)与10批样品对应的IC50值(因变量，Y)所建立的回归方程可知，方程中的回归系数有正有负，即存在正相关和负相关。当响应为24h的IC50时，其中正相关的峰有X1、X6、X8、X9、X10、X11、X12，负相关的峰有X2、X3、X4、X5、X7。当响应48h的IC50时，其中正相关的峰有X1、X6、X8、X9、X12，负相关的峰有X2、X3、X4、X5、X7、X10、X11。当响应72h的IC50时，其中正相关的峰有X1、X6、X8、X9、X12，负相关的峰有X2、X3、X4、X5、X7、X10、X11，综合三个方程得到，X1、X6、X8、X9、X12峰对美洲大蠊抗肺纤维化活性部位ML-HB抑制HEL细胞增长贡献较大。
3结论
在对ML-HB进行抗肺纤维化活性检测时，给药浓度配制成1000μg/ml、250μg/ml、62.5μg/ml、16.5μg/ml和3.9μg/ml，分别作用于HEL细胞，结果表明，在给药剂量为1000μg/ml和250μg/ml时，对HEL细胞的抑制率均达到100％，给药剂量为3.9μg/ml时，对HEL细胞几乎无抑制，所以在30～150μg/ml范围内对给药剂量进行调整，将药物浓度按递减30μg/ml，配制成150μg/ml、120μg/ml、90μg/ml、60μg/ml、30μg/ml，但药物浓度为150～120μg/ml时抑制率均达100％，30μg/ml时抑制率较小，抑制率梯度变化仍较大，继续调整给药浓度，得到最佳给药浓度分别为90μg/ml、80μg/ml、70μg/ml、60μg/ml、50μg/ml。
通过对美洲大蠊抗肺纤维化活性部位ML-HB的体外活性检测，发现其在24、48和72h时其对HEL细胞均有较好抑制作用；进而对10批不同批次的ML-HB进行HPLC-ELSD测定，并对检测器、流动相、洗脱梯度以及柱温等色谱条件进行了优化，完成了相应的方法学考察，构建了ML-HB的HPLC-ELSD指纹图谱。
中药成分非常复杂，其功效通常是多种物质共同作用的结果，中药指纹图谱仅仅是对中药整体的化学物质组成的质量控制，而建立在中药指纹图谱基础之上的中药指纹图谱谱效关系研究，可以更好的将中药的药效与指纹图谱中的化学信息相结合，找到发挥药效的“有效组分群”，将“有效组分群”所代表的化学成分的变化与药效联系起来，进而对中药的质量进行全面准确的评价。
偏最小二乘法(PLS)是一种新型的统计分析方法，其综合了多元回归分析、主成分分析、典型相关分析，在自变量存在严重多重相关、样本个数少于变量个数的情况下进行回归建模，能够将回归建模和主成分分析有机地结合在一起，能有效地对复杂系统进行机理分析，因此，该法比较适合中药特征图谱高维小样本的数据处理。本文采用10批样品构建ML-HB指纹图谱，在得到的共有模式对照图谱中，确定了12个共有峰，由于样本量(10个)少于其自变量个数(12个)，故本实验采用偏最小二乘法建立ML-HB的谱效关系模型。
本研究通过运用偏最小二乘法将ML-HB的药效学信息与HPLC-ELSD指纹图谱中的化学信息进行相关性研究，得到HPLC-ELSD图中X1、X6、X8、X9、X12号峰为正相关峰，所以ML-HB抑制HEL细胞增长不单单取决于其中一个物质的作用，而是其内部“化学组分群”共同作用的结果。本研究建立了美洲大蠊抗肺纤维化活性部位ML-HB的HPLC-ELSD指纹图谱与其抑制HEL细胞增长的谱效关系，与单纯的化学成分指纹图谱相比较，能更好的反映化学指纹图谱中的信息与药理活性之间的关系，为ML-HB的质量控制研究提供了新的思路。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

Claims (8)

1.一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法，其特征在于：包括步骤：B、构建ML-HB指纹图谱，结合其指纹图谱中色谱峰面积值利用偏最小二乘法构建谱效关系回归方程，选出美洲大蠊抗肺纤维化活性部位ML-HB的色谱峰中与药理活性正相关的共有峰。
2.根据权利要求1所述的一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法，其特征在于：所述步骤B之前还包括步骤A：A、测定美洲大蠊的具有体外活性的抗肺纤维化活性部位：以IC50值作为观测指标，采用MTT比色法对美洲大蠊抗肺纤维化活性部位进行活性检测，选出对HEL细胞有抑制作用的美洲大蠊抗肺纤维化活性部位ML-HB的给药浓度。
3.根据权利要求2所述的一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法，其特征在于：所述步骤A的具体步骤包括：
a1.样品制备：用乙醇提取出美洲大蠊的活性滤液后，用吸附树脂吸附、洗脱后分别得到5个洗脱部位的洗脱液，即ML-A1洗脱液、ML-A2洗脱液、ML-A3洗脱液、ML-A4洗脱液和ML-HB洗脱液；将ML-HB洗脱液冷冻干燥后得到ML-HB冻干粉；
a2.ML-HB对HEL细胞抑制作用的抑制作用测定：将ML-HB冻干粉配制成溶液后用其培养HEL细胞，计算ML-HB抑制HEL细胞增长的IC50值。
4.根据权利要求3所述的一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法，其特征在于：所述步骤B的具体步骤包括：
b1.样品溶液的配制：用甲醇溶解不同质量的ML-HB冻干粉，过滤后，分别得到不同浓度的样品溶液；
b2.制作色谱图：将所有的样品溶液在色谱条件下用色谱仪进行测定，得到色谱图；
b3.色谱峰匹配：将色谱图中的各个色谱峰与中药色谱指纹图谱进行比对，找出各个共有峰；
b4.计算所述各个共有峰的峰面积值，将峰面积值作为自变量，IC50值作为因变量，利用偏最小二乘法构建谱效关系回归方程，根据回归系数的正负，分别选出正相关和负相关的共有峰。
5.根据权利要求4所述的一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法，其特征在于：还包括步骤b5.根据正相关的共有峰构建ML-HB的HPLC-ELSD指纹图谱。
6.根据权利要求4所述的一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法，其特征在于：不同浓度的样品溶液的给药浓度分别为50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml和90μg/ml。
7.根据权利要求4所述的一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法，其特征在于：所述色谱条件为：采用C18色谱柱，流动相A为含TFA的质量体积浓度为0.05％的水，流动相C为含TFA的质量体积浓度为0.05％的乙腈，采用梯度洗脱方式，流速0.9ml/min，柱温35℃；检测器为ELSD检测器；Evap 60℃，Neb 45℃，Gas 1.4，进样量10μl。
8.根据权利要求4所述的一种美洲大蠊抗肺纤维化的活性部位的药效分析检测方法，其特征在于：所述步骤b3将色谱图中的各个色谱峰采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，进行色谱峰比对，找出各个共有峰。
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