CN102879486A - 一种筛选中药药效相关成分的方法及模型建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛选中药药效相关成分的方法及模型建立方法，步骤如下：以所研究中药为对象，制备若干组化学成分浓度不同的供试品溶液；选择部分化学成分进行HPLC分析，考察峰面积与浓度的线性关系；选择线性范围内的若干组供试品溶液，测定各自的HPLC指纹图谱和药效指标；在线性关系范围内，采用线性回归分析方法得到各成分的峰面积与药效指标之间的相互关系，根据各成分标准化回归系数和/或t检验结果的大小和正负确定药效相关成分对药效指标的作用，从而筛选出中药药效相关成分。本发明的方法简便、易行、可靠且通用性好，并能体现多成分对药效指标综合作用的特点，适于中药复杂体系的药效相关成分的筛选，为中药活性成分的发现和筛选提供技术数据支持。

Description

一种筛选中药药效相关成分的方法及模型建立方法

技术领域

本发明涉及一种筛选中药药效相关成分的方法及模型建立方法。 

背景技术

中药是中医临床预防及治疗疾病的重要物质基础，具有多成分、多靶点和多途径整体的特点。然而中药成分复杂，挖掘和阐释中药活性物质成分是研发安全有效、质量可控的现代中药的基础，是揭示中药科学内涵、指导临床合理用药的前提。 

长期以来，中药药效活性成分研究的主流模式主要是借鉴国外对天然产物活性成分研究的基本策略^[1-3]。这样的研究模式对一些中药药效活性成分的阐明起到了积极作用，如青蒿素的发现^[4]。然而传统方法需要将所有部分逐一提取、分离得到单体，再做药效活性筛选，不仅实验周期长，成本高，而且还会出现活性成分易丢失，纯度与活性背离的问题^[5]。日本科学家曾在过去数十年里试图从中草药中提取药效活性成分，但未获得成功^[6]。靶细胞提取或脂质体色谱固定相已用于药物成分的初步筛选^[7]，但筛选的成分是否为真正的活性成分还有待进一步探讨。近年来，针对体外抗氧化活性筛选模型，建立了高效液相色谱在线筛选方法^[8,9]，该方法直观、快速，但需要改装仪器和柱后反应通道，且药理学模型特殊（仅用于抗氧化活性成分的筛选），限制了该方法的广泛应用。上述中药药效活性成分的筛选方法也不能体现多成分对药效指标综合作用的特点。 

通过高效液相色谱指纹图谱与药效指标进行关联确定可能的药效相关成分亦有报道，这些方法均采用相对峰面积代替成分含量进行筛选^[10,11]。由于色谱指纹图谱的相对峰面积不能反映这些成分实际含量，因此筛选结果有待商榷。 

对于中药这种复杂体系，寻找简便、快速、准确且通用的中药药效相关成分的筛选方法一直是中药现代化的关键科学问题之一。 

随着计算机信息技术的迅猛发展，一些先进方法已应用于中医药研究领域，不仅加速了中药药效活性成分的发现和辨识，而且也减少了盲目性和偶然性，为中药活性成分的筛选提供了先进的技术手段。 

参考文献 

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发明内容

针对上述现有技术，为了解决现有筛选中药药效相关成分时间周期长，成本高，通用性较差且可靠性有待考察的问题，本发明提供了一种能够快速、简单、准确且通用性较好的筛选中药药效相关成分的方法，该法能够有效确定药效相关成分，并能体现多成分对药效指标综合作用的特点。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

一种筛选中药药效相关成分的方法，步骤如下： 

（1）以所研究中药为对象，制备若干组化学成分浓度不同的供试品溶液； 

（2）选择部分化学成分配制成不同浓度的溶液进行HPLC分析和/或将同一供试品溶液以不同浓度进行HPLC分析，测定其浓度和峰面积，并考察峰面积与对应成分浓度的线性关系； 

（3）选择在浓度与峰面积的线性范围内的若干组供试品溶液，并测定各自的HPLC指纹图谱和对应药效指标； 

（4）在与峰面积呈线性关系的浓度范围内，采用线性回归分析方法得到各成分的峰面积与药效指标之间的相互关系，根据各成分标准化回归系数和/或t检验结果的大小和正负确定药效相关成分对药效指标的作用，从而筛选出中药药效相关成分。 

所述步骤（1）中通过对所研究中药的产地和/或提取工艺的变化来获得化学成分浓度不同的供试品溶液。 

优选的，选择产地和/或提取工艺中不同因素和水平进行正交实验，得到若干组化学成分浓度不同的供试品溶液。 

所述步骤（2）中选择部分化学成分制成对照品溶液进行HPLC分析的方法是：选择部分化学成分配制成对照品混合溶液，并以该对照品混合液配制不同浓度的对照品溶液，然后进行HPLC分析，以各化学成分浓度为横坐标，以各成分对应的色谱峰面积为纵坐标，考察峰面积与对应成分浓度的线性关系，确定各成分浓度的线性范围。 

所述步骤（2）中将同一供试品溶液以不同浓度进行HPLC分析的方法是：将同一供试品溶液制成供试液，分别以不同的进样量进行HPLC分析，选择全部或部分共有峰，以色谱分析的进样量作为所选择的共有峰所代表的化学成分的浓度单位，并以该浓度单位作为横坐标，以该共有峰对应的色谱峰面积为纵坐标，考察峰面积与对应成分浓度的线性关系，确定各成分浓度的线性范围。 

它还包括取若干已知对照品进行HPLC分析，从而对所研究中药图谱对应色谱峰进行定性分析的步骤。 

所述步骤（2）中的部分成分并不限定成分数量，只是为了研究问题的方便。为了体现各种成分对药效指标的综合作用，成分数量应大于1。 

所述步骤（4）还包括根据各成分与药效指标建立的数学表达式体现各成分对药效指标的综合作用，所述数学表达式为：药效是各成分的浓度与其标准化回归系数的乘积之和。 

本发明的另一目的是提供一种筛选中药药效相关成分的模型建立方法，步骤如下：择取中药中多个化学成分，采用正交试验设计将各成分看作试验因素按不同浓度水平组合安排各次试验样品，然后在25℃室温下，采用高效液相色谱仪对正交试验设计的各次试验样品测定得到高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。对各次试验样品测定对应药效指标。采用线性回归分析方法建立HPLC指纹图谱各色谱峰面积与药效指标之间的相互关系。在浓度线性范围内，用峰面积代替成分含量与药效指标计算的标准化回归系数是一致的。根据各成分标准化回归系数的大小及统计检验结果确定药效相关成分；根据各成分标准化回归系数的正负确定药效相关成分对药效指标的正向或负向作用；根据各成分与药效指标建立的数学表达式体现多成分对药效指标的综合作用。 

具体而言，所述模型建立方法是以下步骤： 

（1）以所研究中药为对象，择取中药中所含多个（数量大于1个）已知的化学成分； 

（2）将这些化学成分配制成对照品混合溶液，然后进行HPLC分析，以各化学成分浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，考察色谱峰面积与对应成分浓度的线性关系，确定各成分浓度的线性范围。 

（3）将这些化学成分作为因素，在浓度线性范围内，采用正交试验设计将这些化学成分按不同浓度水平进行组合，得到各次试验样品。 

（4）在25℃室温下，采用高效液相色谱仪采集上述各次试验样品的原始高效液相色谱指纹图谱； 

（5）将上述所得的各次试验样品HPLC指纹图谱各色谱峰按照保留时间相近的原则进行色谱峰匹配； 

（6）将上述取得的各次试验样品进行药理学实验，测定相应的药效指标； 

（7）采用线性回归分析法将匹配后的各次试验样品HPLC指纹图谱色谱峰面积与对应药效指标进行关联建立数学模型（即采用线性回归分析建立数学模型），计算各个成分对应的标准化回归系数； 

（8）根据各成分标准化回归系数的大小及统计检验结果确定与药效相关的成分；根据各成分标准化回归系数的正、负确定药效相关成分对药效指标的正向或负向作用；根据各成分与药效指标建立的数学表达式体现各成分对药效指标的综合作用。 

（9）对上述确定药效相关成分进行实验验证。 

优选的，所述步骤（7）中，所述HPLC指纹图谱色谱峰面积是指在色谱峰面积与对应成分浓度线性关系良好（在浓度线性范围内）的条件下，基于色谱峰面积与药效指标计算的标准化回归系数和基于成分含量与药效指标计算的标准化回归系数是一致的。因此可以采用指纹图谱色谱峰面积代替成分含量与药效指标建立数学模型。 

优选的，所述步骤（7）中，所述数学模型中，用HPLC指纹图谱色谱峰面积代替成分含量与药效指标进行关联建立数学模型是通过数学证明得到的。 

本发明的方法简便、易行、可靠且通用性好，并能体现多成分对药效指标综合作用的特点，适于中药复杂体系的药效相关成分的筛选，为中药活性成分的发现和筛选提供技术数据支持。 

附图说明

图1-1为25℃的室温下，采用Agilent 1260型高效液相色谱仪取得的代表性黄芪药材5个成分对照品混合液原始高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。 

图1-2为正交试验设计（L₁₆（4⁵））16次试验样品的原始HPLC指纹图谱经中药指纹图谱相似度评价系统2004A（国家药典委员会）按保留时间数据进行匹配后得到的各次试验样品的HPLC指纹图谱。 

图1-3为DPPH溶液与黄芪药材中5种成分溶液在400nm～600nm范围内紫外吸收光谱。 

图1-4为黄芪甲苷及芒柄花素与DPPH自由基反应时间曲线。 

图2-1为黄芪药材与对照品HPLC图谱（1.毛蕊异黄酮苷2.毛蕊异黄酮3.芒柄花素）。 

图2-2为黄芪药材指纹图谱的共有峰图谱。 

图2-3为正交设计各次实验的HPLC指纹图谱。 

图2-4为黄芪样本的t₁/u₁图一。 

图2-5为色谱峰的标准化回归系数一。 

图2-6为PLSR模型的VIP图一。 

图2-7为黄芪样本的t₁/u₁图二。 

图2-8为色谱峰的标准化回归系数二。 

图2-9为PLSR模型的VIP图二。 

图2-10为黄芪药材部分色谱峰紫外光谱及一级质谱图（分别为图2-2中编号8、13、14、15、16、17、18所代表的色谱峰的紫外光谱和一级质谱图）。 

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。 

实施例1所用中药：黄芪药材；所用药效指标：清除DPPH自由基活性（DPPH自由基清除率）。虽然以中药黄芪和清除DPPH自由基活性药效指标为例，但本发明所述方法对所用中药及药效指标并无限制。 

1.1对照品溶液的配制 

精密称取黄芪药材中所含的4种化学成分山奈酚、槲皮素、毛蕊异黄酮及芒柄花素的标准品各约5mg、5mg、2mg和2mg，加甲醇溶解并分别定容于10mL棕色容量瓶中，即得各个成分储备液；精密称取黄芪甲苷标准品约10mg，加甲醇溶解并定容于5mL棕色容量瓶中，即得其储备液。对照品溶液进样前用0.45μm微孔滤膜过滤。精密称取维生素C 10mg，加甲醇溶解并定容于10mL棕色容量瓶中，即得维生素C储备液，作为阳性对照；精密称取维生素E 25mg，加甲醇溶解并定容于10mL棕色容量瓶中，即得维生素E储备液（应立即在4℃温度下保存），作为阳性对照。 

1.2DPPH标准溶液的配制及DPPH自由基清除率的计算 

精密称取DPPH约5mg，用甲醇溶解并定容于50mL的棕色容量瓶当中，即得DPPH储备液。DPPH自由基清除率由式（1）计算得到： 

式（1）中[DPPH·]_t=40和[DPPH·]_t=0分别表示时间为40分钟和0分钟时的DPPH自由基的浓度。该浓度可以采用紫外分光光度法在515nm处通过吸光度A与DPPH自由基浓度的回归曲线（A=0.0273×[DPPH·]+0.0229，相关系数的平方R²=0.9997）计算得到。由图1-3可见，DPPH自由基在515nm处有吸收峰，而其它成分不干扰DPPH吸光度的测定。DPPH标准曲线的测定方法如下：将98.4μg·mL^-1DPPH甲醇溶液依次稀释，得到6个不同浓度的DPPH甲醇溶液(98.4μg·mL^-1，49.2μg·mL^-1，24.6μg·mL^-1，6.15μg·mL^-1，3.075μg·mL^-1，1.538μg·mL^-1)，在515nm处测定上述各个浓度下的吸光度值(纯甲醇作为空白)，以DPPH浓度（μg·mL^-1）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 

1.3色谱条件 

色谱柱：Phenomex Synergi Hydro-RP C₁₈（250mm×4.6mm，4μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0min，25%乙腈；20min，45%乙腈）；DAD设定波长范围190~400nm，色谱检测波长采用切换波长法（0min，254nm；15.8min，203nm；17min，254nm）；柱温25℃；流速1mL/min；进样量10μL，分析时间为28min。 

1.4线性范围 

精密量取5种黄芪对照品储备液，加甲醇制成含槲皮素62.8μg/mL、山奈酚56.5μg/mL、黄芪甲苷880.0μg/mL、芒柄花素27.5μg/mL、毛蕊异黄酮29.1μg/mL的混合溶液，作为混合对照品溶液。精密吸取混合对照品溶液0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL和2mL，置于2mL容量瓶中，加甲醇定容，精密吸取10μL，进行HPLC分析，如图1-1所示。以对照品浓度X（μg/mL）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，各对照品回归方程及线性范围如表1-1所示，5种成分在测定的浓度范围内，线性关系良好。 

表1-1  黄芪药材所含的5种成分的线性回归结果 

1.5各成分正交试验设计组合试验 

对5种成分采用5因素、4水平的正交试验设计（即L₁₆（4⁵））进行组合。正交试验设计各成分浓度水平如表1-2所示。按照表1-3将各成分溶液按不同浓度水平进行组合得到各次试验样品混合液。 

表1-2正交试验设计各因素水平（即各成分浓度水平） 

表1-3  L₁₆（4⁵）正交试验设计表 

符号*：表中数字表示各次试验样品混合液中各成分的浓度水平，该浓度水平与表1-2中所 示浓度水平对应。 

1.6各次试验样品的高效液相色谱指纹图谱的测定及匹配 

在25℃的室温下，采用高效液相色谱仪在实施例1“1.3”项所示色谱条件下取得表1-3所示各次试验样品的原始HPLC指纹图谱；将取得的原始HPLC指纹图谱色谱峰采用中药指纹图谱相似度评价系统2004A（国家药典委员），按保留时间相近原则进行匹配，匹配结果如附图1-2所示； 

1.7正交试验设计各次试验样品药效指标的测定： 

对正交试验设计各次试验样品的清除DPPH自由基活性进行测定，测定结果根据公式（1）计算清除率，结果详见表1-4。 

表1-4正交试验设计各次试验样品的清除DPPH自由基活性（以清除率表示） 

1.8基于指纹图谱色谱峰面积与药效指标建立数学模型 

将上述所得各次试验样品的HPLC指纹图谱色谱峰面积数据与对应药效指标数据（DPPH自由基清除率）采用线性回归分析进行关联建立数学模型（见表1-5），计算各成分对应的标准化回归系数，结果见表1-6。 

表1-5线性模型参数（色谱峰面积） 

表1-6HPLC指纹图谱色谱峰面积与清除率的多元线性回归分析 

**：P<0.01. 

1.9药效相关成分的确定 

根据表1-5所示结果可知，基于色谱峰面积建立的数学回归模型具有统计意义。根据表1-6所示的各成分标准化回归系数的大小及统计检验（即t检验）结果确定与药效指标相关的 成分（即清除DPPH自由基活性成分）是槲皮素和山萘酚，剩余三种成分的回归系数较小，不具有统计学意义（见表1-6中P值）；槲皮素和山萘酚两个成分的标准化回归系数的符号均为正，提示这两个成分对药效指标的作用为正向作用。根据表1-6所示的各成分标准化回归系数可得DPPH自由基清除率与各成分的关系如式2所示： 

DPPH自由基清除率（%）_标准化=0.629×槲皮素+0.712×山萘酚-0.109×黄芪甲苷+0.069×芒柄花素-0.057×毛蕊异黄酮                                                （2） 

式（2）体现了各成分对药效指标的综合作用。 

对实施例1建立的数学模型进行验证 

实验验证方法1为：将上述所得各次试验样品的各成分浓度数据与对应药效指标数据（DPPH自由基清除率）采用线性回归分析进行关联建立数学模型（见表1-7），计算各成分对应的标准化回归系数，结果见表1-8。 

表1-7线性模型参数（成分浓度） 

表1-8各成分浓度与清除率的多元线性回归分析 

**：P<0.01. 

根据表1-7所列结果可知，基于成分浓度建立的数学回归模型具有统计意义。比较表1-6和表1-8所示结果，各成分的标准化回归系数基本一致。同样，槲皮素和山萘酚两种成分的回归系数较大，是清除DPPH自由基的药效相关成分。只要HPLC指纹图谱色谱峰面积和对应成分浓度的线性关系良好，可以采用HPLC指纹图谱色谱峰面积代替成分浓度与药效指标进行关联建立数学模型，确定药效相关成分。 

实验验证方法2为：将黄芪中5种成分单独配成溶液与DPPH自由基作用，考察每个成分清除DPPH自由基的活性。5种成分清除DPPH自由基能力的大小可由EC₅₀值来评价，其计算是在式（1）基础上，当DPPH自由基清除率为50%时对应的各成分浓度，具体结果见表1-9： 

表1-9各成分与阳性对照品对DPPH的清除作用 

EC₅₀值越小，说明DPPH自由基清除率为50%时，所用成分的浓度就越小，表明该成分清除DPPH自由基的能力就越强。由于黄芪甲苷和芒柄花素与DPPH自由基反应溶液的吸光度几乎不随时间发生变化（见附图1-4），说明这两种成分对DPPH自由基几乎没有清除作用，因此没有测定这两种成分的EC₅₀值。由表9可见，各成分对DPPH自由基清除活性的作用顺序为：维生素C>槲皮素>山奈酚>维生素E>毛蕊异黄酮>芒柄花素≈黄芪甲苷。 

通过各成分清除DPPH自由基活性结果可见，槲皮素和山萘酚对DPPH自由基有较强的清除活性，进一步验证本发明所述的筛选中药药效相关成分方法是可靠的。 

理论验证（数学证明如下）： 

假设某一指纹图谱色谱峰面积与对应成分的浓度存在线性关系（理性情况下，线性相关系数r=1为完全相关），其数学表达式可以用式（3）表示： 

A＝kc+b                （3） 

式（3）中k为斜率，b为截距。A为峰面积，c为成分的浓度。k与高效液相色谱检测器对该成分的响应值有关。不同成分的k值不同。在药效相关成分筛选过程中，由于色谱指纹图谱中包含多个成分，因此将上式写成多元线性回归形式： 

A＝CK+B                （4） 

式（4）中，A，C，K和B分别为峰面积矩阵，浓度矩阵，斜率矩阵和截距矩阵。这些矩阵的表示如式（5）～式（8）： 

$B=\left[\begin{array}{cccccc}{b}_1& b_2& .& .& .& b_p\\ b_1& b_2& .& .& .& b_p\\ .& .& & .& & .\\ .& .& & .& & .\\ .& .& & .& & .\\ b_1& b_2& .& .& .& b_p\end{array}\right]---\left(8\right)$

上述式（5）～式（8）表示的矩阵中，n表示矩阵的行数，等于测定的试验样品数；p表示矩阵的列数，即为色谱指纹图谱中的色谱峰数。K矩阵为对角矩阵，其对角线上为各色谱峰面积与对应成分浓度之间的比例系数（即斜率）。在B矩阵中，各行向量的元素都相同，对应于各色谱峰面积与其相应浓度线性关系中的截距。 

在筛选药效相关成分过程中，需要将指纹图谱的各色谱峰面积或对应成分浓度与药效指标数据进行多元回归分析建模，如式（9）。 

Y＝Aβ+ε或Y＝Cβ+ε                    （9） 

式（9）中Y为n×1维药效指标数据向量（假设只有一个药效指标。若有p个药效指标，Y应为n×p维矩阵）。β为回归系数矩阵。ε是n×1维随机误差向量（若有p个药效指标，ε应为n×p维矩阵）。 

通过回归分析得到各色谱峰或各成分浓度的标准化回归系数（即对色谱峰面积或成分含量及药效数据进行标准化后再进行回归分析得到的回归系数），然后进行比较。 

数据的标准化公式如式（10）表示： 

$a_{\mathrm{ij}}^s=\frac{a_{\mathrm{ij}}-\stackrel{\&OverBar;}{a_j}}{s_j^a}$ 或 $c_{\mathrm{ij}}^s=\frac{c_{\mathrm{ij}}-\stackrel{\&OverBar;}{c_j}}{s_j^c}---\left(10\right)$

式（10）中， $\stackrel{\&OverBar;}{a_j}=\frac{1}{n}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{a}_{\mathrm{ij}},$ $s_j^a=\sqrt{\frac{1}{n-1}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{(a_{\mathrm{ij}}-\stackrel{\&OverBar;}{a_j})}^2}$ 与 $\stackrel{\&OverBar;}{c_j}=\frac{1}{n}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{c}_{\mathrm{ij}},$ $s_j^c=\sqrt{\frac{1}{n-1}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{(c_{\mathrm{ij}}-\stackrel{\&OverBar;}{c_j})}^2},$ 分别为色谱峰面积矩阵中第j列均值和标准偏差，浓度矩阵中第j列均值及相应标准偏差。 

经过标准化后，式（9）可改写为式（11）： 

A^s和C^s分别为标准化后的峰面积矩阵和浓度矩阵。根据式（11），只要我们能够证明A^s=C^s即可。也就是说在成分浓度和相应色谱峰面积之间存在良好的线性关系，标准化后的峰面积与标准化后的浓度是相等的，这样基于式（11）得到的回归系数 

对式（4）进行标准化处理，可以看成两个步骤：①对数据矩阵进行中心化处理；②然后再除以对应列的方差。 

首先用如下矩阵形式表示数据矩阵的中心化处理： 

HA＝HCK+HB             （12） 

式（12）中H矩阵表示如下： 

H＝I_n-1/n11'           （13） 

称为中心化矩阵。HA相当于对A矩阵进行了中心化处理。I_n为单位矩阵。1表示n维的列向量。由于HB=0，所以式（12）转化为式（13）： 

HA＝(HC)K                （13） 

其次，在式（13）的两边分别乘以标准偏差矩阵（S）的逆矩阵（S^-1），如式（14）所示： 

HAS^-1＝HCKS^-1            （14） 

其中矩阵S^-1为对角矩阵，表示如下： 

式（15）中S^-1对角线上的各元素 实际上也就是式（10）中 由于峰面积与对应浓度线性关系良好，则 $s_j^a=\sqrt{\frac{1}{n-1}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{(a_{\mathrm{ij}}-\stackrel{\&OverBar;}{a_j})}^2}=\sqrt{\frac{k_j^2}{n-1}\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\&Sigma;}}}{(c_{\mathrm{ij}}-\stackrel{\&OverBar;}{c_j})}^2}=k_j{s}_j^c,$ 所以S=S^cK，进而S^-1=(S^cK)^-1。代入式（14）得： 

A^s＝HAS^-1＝HCKS^-1＝HCK(S^cK)^-1＝HCKK^-1(S^c)^-1＝HC(S^c)^-1＝C^s    （16） 

式（16）的左边相当于对峰面积矩阵进行了标准化处理，右边相当于对成分浓度矩阵进行了标准化处理。因此我们有A^s=C^s，证毕。如果C＝AK+B，上述证明依然成立。 

实施例2黄芪药材的HPLC指纹图谱与抗氧化作用的相关分析 

自由基是具有孤对电子的化学基团，性质十分活泼，目前研究认为，衰老、某些慢性疾病、心血管疾病等均与其存在着密切关系。黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge．的干燥根，具有补气固表、排脓脱毒、敛疮生肌的功效，是一味常用的中药材。黄芪主要成分包括黄酮类、皂苷类、多糖类等，现代药理研究证明，黄芪可能具有抗氧化的活性。清除自由基活性的测定方法有多种，包括烃过氧自由基清除法、DPPH自由基清除法、羟基自由基清除法、ABTS自由基离子清除法、超氧阴离子自由基清除法等。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）是一种比较稳定的自由基，其在可见光区有特 征吸收峰，当有自由基清除剂存在的时候会褪色，褪色程度与物质的清除自由基能力呈量效关系，通过测定吸光度值的变化即可评价物质的抗氧化能力。DPPH分光光度法操作简单、稳定性好、灵敏可靠，在测定物质抗氧化能力的研究中具有广泛应用。 

在进行偏最小二乘回归（PLSR）分析的研究时，若因变量的数据是来自于统计实验设计，可以更好的建立和解释模型。因此，本实施例对黄芪药材样本和其提取条件采用正交实验设计，分别测定各次实验的HPLC图谱和清除DPPH自由基的能力，采用PLSR法进行“谱”和“效”的相关分析，挖掘与抗氧化活性显著相关的特征峰，并利用紫外光谱（UV）和质谱（MS）为重要特征峰进行定性分析，为黄芪药材药效相关成分的确定和质量控制及评价提供了参考依据。 

1仪器与试药 

1.1药材来源黄芪药材均为蒙古黄芪，分别购自内蒙古包头，吉林吉安和山西广灵，药材均由山东大学药学院生药教研室陈永林教授鉴定。 

1.2仪器与试剂 

仪器：Agilent 1260型高效液相色谱仪，包括G1311B四元泵，G1316A柱温箱，G1367E自动进样器，G4212B DAD检测器（美国Agilent公司）；液相-质谱联用仪，包括Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）和API 4000三重串联四级杆质谱仪（美国AB公司）；KQ5200型数控超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；AG135型分析天平（梅特勒—托利多仪器上海有限公司）；D11951型超纯水系统（美国ThermoFisher公司）。 

试剂：DPPH试剂（美国Sigma公司）；维生素C（≥99.7%，国药集团化学试剂有限公司），维生素E（≥97%，美国sigma公司）；乙腈为色谱纯（安徽时联特种溶剂股份有限公司）；甲醇为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水。 

对照品：毛蕊异黄酮（批号：1328-110106），芒柄花素（批号：1054-090402），毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（批号：1166-101013），均购买自中国固体制剂制造技术国家工程研究中心。 

2实验方法 

2.1溶液的制备 

2.1.1供试品溶液的制备取黄芪药材细粉（过65目筛，60℃下干燥至恒重）1.0g，置于具塞锥形瓶中，加入一定比例的甲醇若干体积，在一定的温度下超声处理一段时间（具体实验条件按正交表2-1和表2-2进行），滤过，减压浓缩，用适量的甲醇定容至5mL容量瓶中，摇匀，置于4℃下保存，测定前用0.22μm微孔滤膜过滤。 

对产地（A）、提取时间（B）、提取温度（C）、甲醇比例（D）、固液比（E）5因素进行L₁₈（3⁷）正交实验。因素水平见表2-1，实验安排表见表2-2。 

表2-1因素水平表 

表2-2  L₁₈（3⁷）正交实验安排表 

2.1.2对照品溶液的制备分别精密称取毛蕊异黄酮苷，毛蕊异黄酮苷各约2mg，用甲醇溶解并定容于5mL棕色容量瓶中，芒柄花素对照品约2mg，用甲醇溶解并定容于10mL棕色容量瓶中，摇匀，过0.45μm滤膜，备用。精密称取维生素C 10mg，加甲醇溶解并分别定容于10mL棕色容量瓶中，即得维生素C储备液；精密称取维生素E 25mg，加甲醇溶解并分别定容于10mL棕色容量瓶中，即得维生素E储备液（应立即放在4℃下存储）。 

2.1.3DPPH标准溶液的配制精密称取DPPH约5mg，用甲醇溶解并定容于50mL的棕色容量瓶当中，即得DPPH储备液。 

2.2实验条件 

2.2.1HPLC色谱条件色谱柱：Phenomex Synergi Hydro-RP C18（250mm×4.6mm,4μm）；流动相：乙腈(A)-水(B)，进行梯度洗脱，梯度条件见表2-3；流速：0.8mL/min；进样量：20μL；DAD设定波长范围190nm～400nm，检测波长：230nm。 

表2-3  HPLC梯度条件 

2.2.2质谱条件 

离子源：电喷雾离子化源（ESI），正离子检测；气帘气（CUR）：20psi；雾化气（GS1）：45psi；辅助气（GS2）：45psi；ESI源电压：4200V；温度：450℃；解簇电压（DP）：60V；入口电压（EP）：10V；全离子扫描模式，扫描范围m/z 200~1000，所有气体均为N₂。 

2.3方法学考察 

2.3.1精密度考察取同一黄芪样品制备的供试品溶液，连续测定5次，计算图谱中的23个共有峰（以图2-2中8号色谱峰为参照峰S）相对保留时间的RSD为0.0040～1.8%，相对峰面积的RSD为0.83～2.9%，表明仪器的精密度良好。 

2.3.2重现性考察取同一的黄芪样品5份，分别制备供试品溶液并进行HPLC测定。计算23个共有峰（以图2-2中8号色谱峰为参照峰S）的相对保留时间的RSD为0.056～1.3%，相对峰面积的RSD为0.81～2.9%，表明实验方法重现性良好。 

2.3.3稳定性考察取同一黄芪样品制备的供试品溶液，分别在0，2，4，8，12h检测图谱，计算色谱图中23个共有峰（以图2-2中8号色谱峰为参照峰S）的相对保留时间RSD为0.039～0.99%，相对峰面积的RSD分别为1.1～2.9%，表明样品在12h内稳定。 

2.3.4线性范围分别精密吸取毛蕊异黄酮对照品储备液0.5mL，毛蕊异黄酮苷对照品储备液2.0mL，芒柄花素对照品溶液1mL，置同一5mL容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液；分别精密吸取混合对照品溶液0.05、0.25、0.5、0.75、1、1.5ml，置2mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，精密吸取20μL，进行HPLC分析，记录色谱图（图2-1）。以标准品浓度X（μg·mL^-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为： 

毛蕊异黄酮：Y=102.9302X+25.4703  r=0.9995（0.99-29.9μg·mL^-1） 

毛蕊异黄酮苷：Y=80.6482X+58.5374 r=0.9997（3.78-113.40μg·mL^-1） 

芒柄花素：Y=112.9327X+2.0754     r=1.0000（0.92-27.6μg·mL^-1） 

由r可见，当毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素在以上浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。 

2.3.5回收率实验精密称取已知毛蕊异黄酮（245.16μg·g^-1）、毛蕊异黄酮苷（1052.42μg·g^-1）、芒柄花素（60.40μg·g^-1）含量的吉林黄芪药材6份，每份约0.5g，置于锥形瓶中，精密加入对照品混合溶液2mL（毛蕊异黄酮c=62.47μg·mL^-1、毛蕊异黄酮苷c=265.20μg·mL^-1、芒柄花素c=14.95μg·mL^-1），按“2.1.1”下方法制备供试品溶液并进行HPLC测定，结果毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷和芒柄花素的平均回收率分别为101.95%（RSD=0.93%）、102.81%（RSD=0.86）和100.64%（RSD=1.44）。 

2.4指纹图谱共有峰线性关系的考察取同一黄芪样品制备的供试液，分别进样2μL，10μL，20μL，30μL，40μL，以各共有峰的峰面积为纵坐标（y），以进样量为横坐标（x）绘制标准曲线，结果如表2-4所示。 

表2-4  23个共有峰的线性关系结果 

结果表明，各共有峰在进样量为2uL-40μL的范围内线性关系良好，2、6、7、10、12、15、16、20、21号峰（见图2-2）的R²在0.99以上，其它各峰的R²均在0.999以上。 

2.5DPPH法测定正交设计各次实验的抗氧化活性 

2.5.1DPPH标准曲线的测定方法同实施例1中项“1.2DPPH标准溶液的配制及DPPH自由基清除率的计算”方法测定。 

2.5.2样品测定精密吸取实施例2“2.1溶液的制备”项下制备的各次实验样品溶液与对照品溶液，按实施例1“1.2DPPH标准溶液的配制及DPPH自由基清除率的计算”方法测定抗氧化活性。 

2.6数据处理采用中药指纹图谱相似度评价系统2004A（国家药典委员会）、SIMCA-P 11.5（Umetrics公司）及SPSS15.0（美国SPSS公司）。 

3结果与讨论 

3.1正交设计各次实验的HPLC指纹图谱的建立和相似度评价 

采用药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件对黄芪药材18次正交实验的高效液相色谱指纹图谱数据进行了分析处理，以实验10的指纹图谱为参照谱，经过多点校正，自动匹配，采用均值法生成了对照指纹图谱，确定了23个共有峰（如图2-2所示），18次正交实验的HPLC指纹图谱见图2-3，各次实验样品的指纹图谱与对照谱图的相似度数据见表2-5。 

表2-5正交实验设计各次实验的相似度评价结果 

^a：相似度计算以对照图谱为参考 

由表2-5可见，各次实验的指纹图谱相对于对照图谱有一定差异，其中第1，5和13组实验相似度值小于0.700，差异较大。这表明通过正交实验设计各个因素水平相互组合后，各次实验得到的物质成分及浓度有一定差异。 

3.2黄芪正交设计各次实验的抗氧化活性结果 

3.2.1DPPH标准曲线 

根据DPPH标准曲线的测定方法（见实施例1中项1.2，DPPH甲醇溶液的具体浓度根据实验样品适当调整），得线性回归方程Y=0.0269X+0.0082（r＝1.0000），线性范围为1.61~103.2μg·mL^-1。 

3.2.2黄芪正交设计各次实验抗氧化活性的测定结果 

根据正交实验设计，测定各次实验清除DPPH自由基的活性，结果见表2-6。 

表2-6黄芪正交设计各次实验对DPPH自由基的清除作用 

3.3正交设计各因素对黄芪抗氧化作用的影响 

以抗氧化实验的结果EC₅₀值为评价正交实验的指标，对18次实验进行方差分析，见表2-7。 

表2-7方差分析表 

^a：R Squared=0.981(Adjusted R Squared=0.953)；^b：df表示自由度 

由方差分析的结果，在α=0.05水平上，校正模型的P=0.000，所用的模型有显著性意义。各因素中，产地（P=0.000）、提取时间（P=0.010）、提取温度（P=0.002）与提取溶剂比例（P=0.000）对EC₅₀的影响均具有显著性意义，各因素影响次序为产地>提取溶剂>提取温度>提取时间>固液比。 

3.4黄芪正交设计组合与清除DPPH自由基作用的相关分析 

各色谱峰之间存在着多重相关性，而且变量数（色谱峰数）大于样本数，因此采用偏最小二乘回归法（PLSR）建立谱效关系模型。首先采用EC₅₀值作为药效指标（Y）与色谱峰面积（X）进行PLSR分析。将数据导入SIMCA-P软件，经过计算，系统选取了一个有意义的成分，它可以解释71.9%的Y变量（R²=0.719，Q²=0.67）。由于只有一个PLS成分，只能观察到t₁/u₁得分散点图（图2-4），由图2-4可以看出，所有的样本基本上都处于对角线附近，没有异常值。由标准化的回归系数图（图2-5）和VIP图（图2-6）可以看出，大部分的色谱峰都与EC₅₀呈负相关，即它们含量增加，EC₅₀值降低，清除DPPH自由基的能力将会增加。其中，14、15、11、19、6、10、12、8、5、18、21、9号峰对样品清除DPPH自由基的能力起主要作用，仅有17，23号峰起抑制作用（2，7，16，22号峰的置信区间过零点，无显著性意义，见图2-5）。由以上可知，黄芪中多数化学成分具有清除DPPH自由基的能力。 

其次，尝试采用清除率作为药效指标（Y）与色谱峰面积（X）进行PLSR分析。SIMCA-P 系统选取了一个有意义的成分（R²=0.854，Q²=0.832）。图2-7，2-8，2-9分别为t₁/u₁得分散点图、标准化的回归系数图和VIP图。由三张图可以看出，大部分的色谱峰都与清除率呈正相关，其中，15、14、19、11、10、6、9、12、5、21、18号峰对样品清除DPPH自由基的能力起正相作用，仅有17，23号峰起抑制作用，分析结果基本上与采用EC₅₀作为药效指标的结果一致。这说明，在数据合理的情况下，也可以采用清除率代替EC₅₀进行谱效关系的研究。 

3.5定性分析 

通过采集部分特征峰的紫外光谱及一级质谱图（见图2-10），结合文献报道，初步对与黄芪抗氧化活性相关的部分特征峰进行定性分析。 

峰8在质谱中给出了m/z447的[M+H]⁺和m/z469的[M+Na]⁺，推测其分子量为446，在正离子模式下，m/z447的[M+H]⁺裂解成碎片m/z285的[M+H-glc]⁺。将该化合物的紫外光谱与对照品比较，鉴定为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。同理，峰16鉴别为毛蕊异黄酮，m/z591为[2M+Na]⁺。 

峰13在质谱中给出了m/z431的[M+H]⁺和m/z453的[M+Na]⁺，推测其分子量为430，在正离子模式下，m/z431的[M+H]⁺裂解成碎片m/z269的[M+H-glc]⁺。对比文献中报道的芒柄花苷的紫外光谱，鉴定为芒柄花苷。同理，峰17鉴别为芒柄花素，m/z559为[2M+Na]⁺。 

峰14在质谱中给出了m/z463的[M+H]⁺、m/z485的[M+Na]⁺和m/z480的[M+NH₄]⁺，推测其分子量为462，在正离子模式下，m/z463的[M+H]⁺裂解成碎片m/z301的[M+H-glc]⁺。对比文献中报道的黄芪黄酮类成分的紫外光谱，鉴定为9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷。同理，峰18鉴别为3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷。 

峰15在质谱中给出了m/z487的[M+Na]⁺和m/z482的[M+NH₄]⁺，推测其分子量为464，在正离子模式下，m/z487的[M+H]⁺裂解成碎片m/z303的[M+H-glc]⁺。对比文献中报道的黄芪黄酮类成分的紫外光谱，鉴定为2’-羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-葡萄糖苷。 

各色谱峰鉴别结果见表2-8。 

表2-8黄芪HPLC色谱峰化学成分分析 

4结论 

本实施例考察了不同提取条件对黄芪提取液清除自由基活性的影响。采用偏最小二乘回归对黄芪药材指纹图谱与抗氧化活性相互关系进行了研究，挖掘了与抗氧化活性显著相关的特征峰，结果表明：多数成分对清除自由基活性起正向作用。利用HPLC-DAD-MS联用技术对部分色谱峰对应成分进行了定性分析，这些成分是毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、2’-羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素和3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷。本实施例为黄芪药材的药效相关成分的确定及质量控制和评价提供了参考依据。 

上面所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和保护范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域中普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围。 

Claims (8)

1.一种筛选中药药效相关成分的方法，其特征是，步骤如下：

（1）以所研究中药为对象，制备若干组化学成分浓度不同的供试品溶液；

（2）选择部分化学成分配制成不同浓度的溶液进行HPLC分析和/或将同一供试品溶液以不同浓度进行HPLC分析，测定其浓度和峰面积，并考察峰面积与对应成分浓度的线性关系；

（3）选择在浓度与峰面积的线性范围内的若干组供试品溶液，并测定各自的HPLC指纹图谱和对应药效指标；

（4）在与峰面积呈线性关系的浓度范围内，采用线性回归分析方法得到各成分的峰面积与药效指标之间的相互关系，根据各成分标准化回归系数和/或t检验结果的大小和正负确定药效相关成分对药效指标的作用，从而筛选出中药药效相关成分。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（1）中通过对所研究中药的产地和/或提取工艺的变化来获得化学成分浓度不同的供试品溶液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征是，选择产地和/或提取工艺中不同因素和水平进行正交实验，得到若干组化学成分浓度不同的供试品溶液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（2）中选择部分化学成分制成对照品溶液进行HPLC分析的方法是：选择部分化学成分配制成对照品混合溶液，并以该对照品混合液配制不同浓度的对照品溶液，然后进行HPLC分析，以各化学成分浓度为横坐标，以各成分对应的色谱峰面积为纵坐标，考察峰面积与对应成分浓度的线性关系，确定各成分浓度的线性范围。

5.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（2）中将同一供试品溶液以不同浓度进行HPLC分析的方法是：将同一供试品溶液制成供试液，分别以不同的进样量进行HPLC分析，选择全部或部分共有峰，以色谱分析的进样量作为所选择的共有峰所代表的化学成分的浓度单位，并以该浓度单位作为横坐标，以该共有峰对应的色谱峰面积为纵坐标，考察峰面积与对应成分浓度的线性关系，确定各成分浓度的线性范围。

6.如权利要求1所述的方法，其特征是，它还包括取若干已知对照品进行HPLC分析，从而对所研究中药图谱对应色谱峰进行定性分析的步骤。

7.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（4）还包括根据各成分与药效指标建立的数学表达式体现各成分对药效指标的综合作用，所述数学表达式为：药效是各成分的浓度与其标准化回归系数的乘积之和。

8.一种筛选中药药效相关成分的模型建立方法，其特征是，步骤如下：所述方法是通过以下步骤建立的：

（1）以所研究中药为对象，择取中药中所含多个已知的化学成分；

（2）将这些化学成分配制成对照品混合溶液，然后进行HPLC分析，以各化学成分浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，考察色谱峰面积与对应成分浓度的线性关系，确定各成分浓度的线性范围；

（3）将这些化学成分作为因素，在浓度线性范围内，采用正交试验设计将这些化学成分按不同浓度水平进行组合，得到各次试验样品；

（4）在25℃室温下，采用高效液相色谱仪采集上述各次试验样品的原始高效液相色谱指纹图谱；

（5）将上述所得的各次试验样品HPLC指纹图谱各色谱峰按照保留时间相近的原则进行色谱峰匹配；

（6）将上述取得的各次试验样品进行药理学实验，测定相应的药效指标；

（7）采用线性回归分析法将匹配后的各次试验样品HPLC指纹图谱色谱峰面积与对应药效指标进行建立线性回归数学模型，计算各个成分对应的标准化回归系数；

（8）根据各成分标准化回归系数的大小及统计检验结果确定与药效相关的成分；根据各成分标准化回归系数的正、负确定药效相关成分对药效指标的正向或负向作用；根据各成分浓度与其标准化回归系数的乘积之和体现各成分对药效指标的综合作用；

（9）对上述确定药效相关成分进行实验验证。

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