CN110346495A - 黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法 - Google Patents
黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，提供了一种黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法，建立黄芪不同极性部位的UPLC指纹图谱，标定特征峰，利用谱效数学模型分析并辨识黄芪中化学成分的利水消肿活性部位。本发明较全面的反映了黄芪谱效之间的相关性，为其药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法，可以快速、准确地评价黄芪中具有利水消肿作用的化学成分及活性成分筛选，为黄芪的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及黄芪的药物分析方法，具体涉及黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法。本发明方法能够为黄芪的分类开发打下坚实基础。
背景技术
黄芪为多年生草本豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根。具有利水消肿、益气、托毒生肌和固表等功效，是典型的多效中药。黄芪其化学成分主要包括皂苷类、黄酮类与多糖类。有研究表明黄芪甲苷对高糖环境下氧化应激损伤的人肾小球系膜细胞、肾缺血再灌注损伤大鼠以及对肾纤维化大鼠均具有良好的保护作用。曹耀辰等对黄芪甲苷抗氧化、改善脑缺血及心肌缺血的肾保护作用进行综述研究。安方玉等研究表明黄芪多糖对镉致大鼠肾损伤具有保护作用。陆迅等也研究表明黄芪多糖可以在一定程度上抑制肾间质纤维化的形成保护肾脏。本课题组前期研究得出黄芪总黄酮对阿霉素肾病大鼠具有改善作用。
中药谱-效研究过程是先通过合适的化学分析手段最大程度表征中药的化学信息，建立标示化学成分群的特征峰的指纹图谱；收集体内外药效实验评价指标；采用合适的数据处理技术将“谱”与“效”联系起来，用于方剂物质基础研究。
发明内容
本发明提供了一种黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法，以黄芪不同极性部位的UPLC指纹图谱为基础，采用灰色关联度分析方法考察黄芪利水消肿药效活性的谱效关系。
本发明由如下技术方案实现的：一种黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法，建立黄芪不同极性部位的UPLC指纹图谱，标定特征峰，利用谱效数学模型分析并辨识黄芪中化学成分的利水消肿活性部位。
所述利水消肿活性部位为：紫檀烷、Calycosin-7-O-glc-6"-O-acetate、黄芪皂苷I、紫檀苷、Formononetin-7-O-glc-6"-O-acetate、红车轴草素-7-O-葡萄糖、异黄烷、异黄烷苷、黄芪皂苷 II、异黄芪皂苷 I、黄芪皂苷 III、黄芪甲苷、Kumatakenin、Dihydroxy-dimethoxy isoflavone、Dihydroxy-trimethoxy DHIF。
具体步骤如下：
（1）采用系统溶剂萃取法制备黄芪的不同极性组分；
（2）采用UPLC-Q-Exactive技术建立黄芪不同极性部位的指纹图谱；
（3）标定特征峰，提取特征峰数据；
（4）对不同极性部位进行24 h尿蛋白定量与生化指标的体内药效测定；
（5）将指纹图谱特征峰数据和药效活性数据经灰色关联度分析辨识黄芪中化学成分的药效活性成分。
黄芪系统萃取前进行预处理：黄芪粉碎，精密称取4份粗粉，每份200g，分别依次加入10倍和8倍量的蒸馏水回流提取，合并2次水煎液真空浓缩至1 mg/mL即可。
系统溶剂萃取法制备黄芪的不同极性组分的方法具体为：依次使用3倍量有机溶剂石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对黄芪浓缩液进行萃取，分别得到黄芪石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、剩余水四个不同极性部位；回收溶剂、真空干燥，即得不同极性组分的干燥部位。
建立黄芪不同极性部位的指纹图谱的色谱条件为：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，流动相A为含0.1%甲酸的水，B为乙腈，体积流量0.3 μL/min；UV检测波长254 nm；柱温30℃；进样量3 μL；洗脱梯度为：0-10 min 99-92% B, 10-15 min, 92-80% B, 15-21min, 80-75% B, 21-24 min, 75-70% B, 24-27 min, 70-65% B, 27-30 min, 35-40% B,30-33 min, 60-30% B, 33-36 min, 70-99% B, 36-38 min, 99% B, 38-40 min, 99-1%B；质谱条件：采用HESI离子化方式，喷雾电压正极3.5 kV，负极2.5 kV，碰撞能量为12.5、25、37.5 eV；加热器温度 300℃，毛细管温度320℃，辅助气体积流量10 arb，鞘气体积流量35 arb；采集模式为正负离子切换，扫描模式采用Full Scan/dd-MS2，采集范围为m/z 100～1500；分辨率采用 MS Full Scan 35000 FWHM，MS/MS 17500 FWHM。
标定特征峰，提取特征峰数据的具体方法为：共有特征峰的保留时间tR 分别为：1.02 min, 17.23 min, 19.32 min, 21.37 min, 21.65 min, 23.33 min, 24.10 min,24.02 min, 24.99 min, 27.11 min, 27.08 min, 29.16 min, 29.84 min, 31.42 min,27.22 min, 30.52 min, 31.28 min, 32.75 min, 34.37 min, 25.18 min, 34.87 min。
步骤（4）中实验所用动物为SD大鼠，药效学评价指标为24 h尿蛋白定量与生化指标ALB、BUN、SCr、TG、TCHO和TP。
将步骤三所得特征峰数据和步骤四所得的药效学数据代入谱效数学模型进行分析，采用灰色关联度分析方法，评价各特征峰所代表的的化学成分对药效活性的贡献大小；
其中：所述灰色关联度分析方法包括如下步骤：
（1）参考序列与比较序列的选择：以黄芪不同极性部位4个药物的28个特征峰作为比较数列即子序列，构成28个子序列记为 [Xi(k)]，以阿霉素肾病大鼠药效学指标24 h尿蛋白含量、ALB、BUN、CK、SCr、TCHO、TG、TP作为母序列记为 [X0(k)]，根据母序列与子序列关联度的大小，来确定各成分含量对药效贡献的大小；
（2）关联系数计算：[Xi(k)]与[X0(k)]的关联系数εi(k)由下列公式计算：；k 为不同极性部位黄芪；Xi 为不同极性黄芪的特征峰；εi(k)为第k个不同极性部位黄芪的子序列Xi与母序列X0的关联系数；分别为母序列与子序列绝对差最大、最小值，记为△max、△min；为母序列与子序列的绝对差值，记为△i(k)；ρ 为分辨系数，ρ 取值区间为(0,1)，取 ρ = 0.5。
本发明通过黄芪中有效成分的指纹特征与利水消肿药效活性之间的相关性开展研究，在指纹图谱和药学效研究的基础上，获得黄芪UPLC指纹图谱28个特征峰数据与24 h尿蛋白定量与生化指标（ALB、BUN、SCr、TG、TCHO、TP），通过灰色关联度分析，考察了黄芪UPLC指纹图谱特征所代表的化学成分对利水消肿药效指标贡献的大小程度，明确黄芪中与药效关系较为密切的化学成分紫檀烷、Calycosin-7-O-glc-6"-O-acetate、黄芪皂苷 I、紫檀苷、Formononetin-7-O-glc-6"-O-acetate、红车轴草素-7-O-葡萄糖、异黄烷、异黄烷苷、黄芪皂苷 II、异黄芪皂苷 I、Kumatakenin、Dihydroxy-dimethoxy isoflavone、黄芪皂苷III、Dihydroxy-trimethoxy DHIF、黄芪甲苷，较全面的反映了黄芪谱效之间的相关性，为其药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法，可以快速、准确地评价黄芪中具有利水消肿作用的化学成分及活性成分筛选，为黄芪的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法。
附图说明
图1为本发明的黄芪各极性部位UHPLC-Q-Exactive图谱正离子模式下总离子流图；
图2为本发明的黄芪各极性部位UHPLC-Q-Exactive图谱负离子模式下总离子流图；
图3为本发明的大鼠24 h尿蛋白定量分析。
具体实施方式
黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法，通过建立黄芪不同极性部位的UPLC指纹图谱，以及黄芪不同部位的利水消肿药效活性，利用谱效数学模型评价黄芪的利水消肿活性成分。紫檀烷、Calycosin-7-O-glc-6"-O-acetate、黄芪皂苷 I、紫檀苷、Formononetin-7-O-glc-6"-O-acetate、红车轴草素-7-O-葡萄糖、异黄烷、异黄烷苷、黄芪皂苷 II、异黄芪皂苷 I、黄芪皂苷 III、黄芪甲苷、Kumatakenin、Dihydroxy-dimethoxyisoflavone、Dihydroxy-trimethoxy DHIF所述活性成分为利水消肿药效组合物。
黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法，其步骤如下：
第一步、供试溶液的指标：取适量黄芪适当粉碎，精密称取4份粗粉，每份200g，置于圆底烧瓶中；分别向上述圆底烧瓶中加入10倍和8倍量的蒸馏水回流提取2 h，合并2次水煎液进行真空浓缩至1 mg/mL，备用；应用系统溶剂萃取方法，依次使用3倍量有机溶剂石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对黄芪浓缩液进行萃取，分别得到黄芪石油醚（A）、乙酸乙酯（B）、正丁醇（C）、剩余水（D）四个不同极性部位；经回收溶剂、真空干燥，制得干燥部位。
第二步、黄芪不同极性部位UPLC指纹图谱的建立：采用超高效液相色谱质谱联用法对步骤一所得的样品进行指纹图谱测定；色谱条件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱，流动相 A（水，含 0.1%甲酸）-B（乙腈），体积流量0.3 μL/min；UV检测波长254 nm；柱温30℃；进样量3 μL；洗脱梯度为：0-10 min, 99-92% B, 10-15 min, 92-80% B, 15-21min, 80-75% B, 21-24 min, 75-70% B, 24-27 min, 70-65% B, 27-30 min, 35-40% B,30-33 min, 60-30% B, 33-36 min, 70-99% B, 36-38 min, 99% B, 38-40 min, 99-1%B；质谱条件：采用HESI离子化方式，喷雾电压正极3.5 kV，负极2.5 kV，碰撞能量为12.5、25、37.5 eV。加热器温度 300℃，毛细管温度320℃，辅助气体积流量10 arb，鞘气体积流量35 arb。采集模式为正负离子切换，扫描模式采用Full Scan/dd-MS2，采集范围为m/z 100～1500。分辨率采用 MS Full Scan 35000 FWHM，MS/MS 17500 FWHM。
第三步、筛选特征峰，提取特征峰数据：得到特征峰匹配数据，22个特征峰的保留时间(tR )分别为：1.02 min, 17.23 min, 19.32 min, 21.37 min, 21.65 min, 23.33min, 24.10 min, 24.02 min, 24.99 min, 27.11 min, 27.08 min, 29.16 min, 29.84min, 31.42 min, 27.22 min, 30.52 min, 31.28 min, 32.75 min, 34.37 min, 25.18min, 34.87 min。
第四步、对不同极性部位进行药效学实验：通过体外阿霉素诱导SD大鼠肾病实验考察黄芪不同极性部位对24 h尿蛋白定量与生化指标（ALB、BUN、SCr、TG、TCHO、TP）的影响。
第五步、谱效相关性分析：将步骤三所得特征峰数据和步骤四所得的药效学数据代入谱效数学模型进行分析，采用灰色关联度分析方法，评价各特征峰所代表的的化学成分对药效活性的贡献大小。
根据本发明的方法，其中步骤5中，所述灰色关联度分析方法步骤包括如下步骤：
（1）参考序列与比较序列的选择
本文以黄芪不同极性部位4个药物的28个特征峰作为比较数列 (子序列)，构成28个子序列记为 [Xi(k)]，以阿霉素肾病大鼠药效学指标（24 h尿蛋白含量、ALB、BUN、CK、SCr、TCHO、TG、TP）作为母序列记为 [X0(k)]，根据母序列与子序列关联度的大小，来确定各成分含量对药效贡献的大小。
（2）关联系数计算
[Xi(k)]与[X0(k)]的关联系数εi(k)由下列公式计算：
k 为不同极性部位黄芪；
Xi 为不同极性黄芪的特征峰；
εi(k)为第k个不同极性部位黄芪的子序列Xi与母序列X0的关联系数；
分别为母序列与子序列绝对差最大、最小值，记为△max、△min；
为母序列与子序列的绝对差值，记为△i(k)；
ρ 为分辨系数，在计算中为了提高关联系数之间的差异显著性，削弱最大△i(k)太大而引起的失真，ρ 取值区间为(0,1)，本实验取 ρ = 0.5。
本发明采用的实验材料和仪器的相关信息如下：
Dionex UltiMate 3000 UHPLC-Q Exactive Orbitrap质谱联用仪，IKA 旋蒸仪 600digital 旋转蒸发仪（德国，上海巴玖实业有限公司），SE402F型电子天平（上海，奥豪斯仪器有限公司），Tecan Infinite® 200 Pro多功能酶标仪（瑞士，北京世贸远东科学仪器有限公司），各血清生化指标ALB、BUN、CK、SCr、TCHO、TG和TP试剂盒均由中国辐射防护研究院安全评价中心提供。
乙腈、甲醇均买自赛默飞世尔科技有限公司，BCA蛋白测定试剂盒购自江苏碧云天生物技术公司。
SPF级雄性SD大鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK(京) 2017-0007；动物饲养室保持温度（23±1.5)℃，相对湿度(45±15)%。
药物提取与分离：取适量黄芪适当粉碎，精密称取4份粗粉，每份200g，置于圆底烧瓶中；分别向上述圆底烧瓶中加入10倍和8倍量的蒸馏水回流提取，合并2次水煎液进行真空浓缩至1 mg/mL，备用；应用系统溶剂萃取方法，依次使用3倍量有机溶剂石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对黄芪浓缩液进行萃取，分别得到黄芪石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、剩余水四个不同极性部位；经回收溶剂、真空干燥，制得干燥部位。
黄芪不同极性部位的UPLC分析与质谱分析：
色谱条件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱，流动相 A（水，含 0.1%甲酸）-B（乙腈），体积流量0.3 μL/min；UV检测波长254 nm；柱温30℃；进样量3 μL；洗脱梯度为：0-10min 99-92% B, 10-15 min, 92-80% B, 15-21 min, 80-75% B, 21-24 min, 75-70% B,24-27 min, 70-65% B, 27-30 min, 35-40% B, 30-33 min, 60-30% B, 33-36 min, 70-99% B, 36-38 min, 99% B, 38-40 min, 99-1% B；质谱条件：采用HESI离子化方式，喷雾电压正极3.5 kV，负极2.5 kV，碰撞能量为12.5、25、37.5 eV。加热器温度300℃，毛细管温度320℃，辅助气体积流量10 arb，鞘气体积流量35 arb。采集模式为正负离子切换，扫描模式采用Full Scan/dd-MS2，采集范围为m/z 100～1500。分辨率采用 MS Full Scan 35000FWHM，MS/MS 17500 FWHM
不同极性部位指纹图谱建立：按上述条件建立不同极性部位的UHPLC-MS色谱图；结果见图1和表1；并通过质谱确定不同极性部位各峰对应的化合物，结果见表1，相对定量分析见表2和表3。
表1 黄芪不同极性部位鉴定的化合物
表2 正离子模式下黄芪不同极性部位所含化合物峰面积
表3 负离子模式下黄芪不同极性部位所含化合物峰面积
生化指标与24 h尿蛋白定量分析：
生化指标测定：80只SD大鼠适应一周后，随机分为7组，具体分组及处理方法见表4。大鼠适应期一周，模型组与A、B、C、D、H给药组大鼠分两次尾静脉注射阿霉素标准品进行造模，分别于第1天和第8天尾静脉注射阿霉素标准品3.5 mg/kg和1.0 mg/kg，复制阿霉素肾病大鼠模型，正常对照组大鼠尾静脉注射等量生理盐水。
表4 动物分组及处理
注：A、B、C、D分别代表石油醚部位黄芪、乙酸乙酯部位黄芪、正丁醇部位黄芪、剩余水部位黄芪
按大鼠体表面积计算给药，最终A、B、C、D各复方药与全方灌胃大鼠剂量为4.2 g/kg/d生药量，于造模第15天开始给药干预35天。尿液样本于实验第0、14、28、42、49天收集，将大鼠放置代谢笼中，收集24 h尿液并记录尿液体积。在实验第50天大鼠禁食12 h后，腹主动脉取血，离心获得血清样本。
各血清生化指标血清肌酐（Serum creatinine，SCr），白蛋白（albumin，ALB），尿素氮（Urea nitrogen，BUN），肌酸激酶（creatine kinase，CK）,甘油三酯（triglyceride，TG），总胆固醇（total cholesterol，TCHO）和总蛋白（total protein，TP）试剂盒均由中国辐射防护研究院安全评价中心提供，结果见表5，M组BUN、CK、SCr、TCHO、TG、TP的含量相对于K组均升高；而ALB指标水平降低，且ALB、BUN、CK、SCr、TCHO、TG指标具有显著性差异，进一步表明阿霉素大鼠模型成立。各给药组干预阿霉素肾病大鼠后，均有不同程度的回调，根据生化指标判断各给药组干预后的药效由大到小的趋势为：H ＞ C ＞ A~D ＞ B。
表5 不同受试药物对模型大鼠血清生化指标的影响
注：与空白组对比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；“▲”代表与模型组相比给药组有明显回调现象
24 h尿蛋白定量分析：尿液样本采用双辛丁酸（BCA）法进行24 h尿蛋白定量测定，应用酶标仪于562 nm测定大鼠尿液的吸光度，依据蛋白标准曲线计算尿蛋白浓度。24 h尿蛋白排泄量以尿蛋白浓度乘以24 h尿液体积计算。
结果见图2，实验第14天，与空白对照组相比，M组与各给药组大鼠24 h尿蛋白定量显著升高，表明阿霉素大鼠模型复制成功。随着给药时间，模型组大鼠尿蛋白含量持续升高，各给药组干预阿霉素肾病大鼠后，尿蛋白含量增加幅度缓慢。根据24 h尿蛋白定量判断各给药组干预后的药效由大到小的趋势为：H ＞ C ＞B ＞ D ＞ A。
黄芪不同极性部位不同组分各峰与24 h尿蛋白定量与生化指标的灰色关联分析：对黄芪不同极性部位的受试药物体外化学指纹图谱标准化结果见表6；对药效指标包括生化指标（ALB、BUN、SCr、TCHO、TG、TP）与24 h尿蛋白定量指标进行均值标准化，药效指标标准化结果见表7。
表6 各受试药物体外化学指纹图谱标准化结果
表7 药效指标标准化结果
首先，根据表6与7的无量纲化值计算药效指标与特征峰峰面积的绝对差值。其次，根据关联系数公式计算出各特征峰对各药效评价指标的关联系数。最后，由关联系数计算出关联度值，其中关联度>0.80时，说明指纹图谱中该特征峰所代表的化学成分与药效作用具有一定关联，该特征峰可能起主要贡献作用。各指标的具体灰色关联度，见表8。
表8 28个特征峰与药效指标的关联度分析表
关联序是将关联度按照从大到小顺序排列，直接反映各化合物对各药效指标的贡献大小，见表9。
表9 28个特征峰与药效指标的关联序分析表
有27个特征峰的关联度大于0.8，可见防己黄芪汤干预阿霉素肾病大鼠的效果是其有效物质成分群共同作用的结果，本发明选择关联序前15与药效指标关联较大的化学成分进行分析。对药效各个指标统一分析，其中关联度最高的前15个化合物为16 > 5 > 19 > 6 >10 > 3 > 17 > 7 > 18 > 21 > 9 > 20 > 14 > 11 > 12，即紫檀烷、Calycosin-7-O-glc-6"-O-acetate、黄芪皂苷 I、紫檀苷、Formononetin-7-O-glc-6"-O-acetate、红车轴草素-7-O-葡萄糖、异黄烷、异黄烷苷、黄芪皂苷 II、异黄芪皂苷 I、Kumatakenin、Dihydroxy-dimethoxy isoflavone、黄芪皂苷 III、Dihydroxy-trimethoxy DHIF、黄芪甲苷。
综上所述，本发明提出的黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法，本发明通过黄芪中有效成分的指纹特征与利水消肿药效活性之间的相关性开展研究，在指纹图谱和药学效研究的基础上，获得黄芪UPLC指纹图谱28个特征峰数据与24 h尿蛋白定量与生化指标（ALB、BUN、SCr、TG、TCHO、TP），通过灰色关联度分析，考察了黄芪UPLC指纹图谱特征所代表的化学成分对利水消肿药效指标贡献的大小程度，明确黄芪中与药效关系较为密切的化学成分紫檀烷、Calycosin-7-O-glc-6"-O-acetate、黄芪皂苷 I、紫檀苷、Formononetin-7-O-glc-6"-O-acetate、红车轴草素-7-O-葡萄糖、异黄烷、异黄烷苷、黄芪皂苷 II、异黄芪皂苷 I、Kumatakenin、Dihydroxy-dimethoxy isoflavone、黄芪皂苷 III、Dihydroxy-trimethoxy DHIF、黄芪甲苷，较全面的反映了黄芪谱效之间的相关性，为其药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法，可以快速、准确地评价黄芪中具有利水消肿作用的化学成分及活性成分筛选，为黄芪的药效物质基础研究及质量控制提供科学有效的方法。
Claims (9)
1.一种黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法，其特征在于：建立黄芪不同极性部位的UPLC指纹图谱，标定特征峰，利用谱效数学模型分析并辨识黄芪中化学成分的利水消肿活性部位。
2.根据权利要求1所述的一种黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法，其特征在于：所述利水消肿活性部位为：紫檀烷、Calycosin-7-O-glc-6"-O-acetate、黄芪皂苷 I、紫檀苷、Formononetin-7-O-glc-6"-O-acetate、红车轴草素-7-O-葡萄糖、异黄烷、异黄烷苷、黄芪皂苷 II、异黄芪皂苷 I、黄芪皂苷 III、黄芪甲苷、Kumatakenin、Dihydroxy-dimethoxy isoflavone、Dihydroxy-trimethoxy DHIF。
3.根据权利要求1所述的一种黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）采用系统溶剂萃取法制备黄芪的不同极性组分；
（2）采用UPLC-Q-Exactive技术建立黄芪不同极性部位的指纹图谱；
（3）标定特征峰，提取特征峰数据；
（4）对不同极性部位进行24 h尿蛋白定量与生化指标的体内药效测定；
（5）将指纹图谱特征峰数据和药效活性数据经灰色关联度分析辨识黄芪中化学成分的药效活性成分。
4.根据权利要求2所述的一种黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法，其特征在于：黄芪系统萃取前进行预处理：黄芪粉碎，精密称取4份粗粉，每份200g，分别依次加入10倍和8倍量的蒸馏水回流提取，合并2次水煎液真空浓缩至1 mg/mL即可。
5.根据权利要求2所述的一种黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法，其特征在于：系统溶剂萃取法制备黄芪的不同极性组分的方法具体为：依次使用3倍量有机溶剂石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对黄芪浓缩液进行萃取，分别得到黄芪石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、剩余水四个不同极性部位；回收溶剂、真空干燥，即得不同极性组分的干燥部位。
6.根据权利要求2所述的一种黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法，其特征在于：建立黄芪不同极性部位的指纹图谱的色谱条件为：Waters ACQUITY UPLCHSS T3 色谱柱，流动相A为含0.1%甲酸的水，B为乙腈，体积流量0.3 μL/min；UV检测波长254 nm；柱温30℃；进样量3 μL；洗脱梯度为：0-10 min 99-92% B, 10-15 min, 92-80% B,15-21 min, 80-75% B, 21-24 min, 75-70% B, 24-27 min, 70-65% B, 27-30 min, 35-40% B, 30-33 min, 60-30% B, 33-36 min, 70-99% B, 36-38 min, 99% B, 38-40 min,99-1% B；质谱条件：采用HESI离子化方式，喷雾电压正极3.5 kV，负极2.5 kV，碰撞能量为12.5、25、37.5 eV；加热器温度 300℃，毛细管温度320℃，辅助气体积流量10 arb，鞘气体积流量35 arb；采集模式为正负离子切换，扫描模式采用Full Scan/dd-MS2，采集范围为m/z 100～1500；分辨率采用 MS Full Scan 35000 FWHM，MS/MS 17500 FWHM。
7.根据权利要求2所述的一种黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法，其特征在于：标定特征峰，提取特征峰数据的具体方法为：共有特征峰的保留时间tR 分别为：1.02 min, 17.23 min, 19.32 min, 21.37 min, 21.65 min, 23.33 min, 24.10min, 24.02 min, 24.99 min, 27.11 min, 27.08 min, 29.16 min, 29.84 min, 31.42min, 27.22 min, 30.52 min, 31.28 min, 32.75 min, 34.37 min, 25.18 min, 34.87min。
8.根据权利要求2所述的一种黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法，其特征在于：步骤（4）中实验所用动物为SD大鼠，药效学评价指标为24 h尿蛋白定量与生化指标ALB、BUN、SCr、TG、TCHO和TP。
9.根据权利要求2所述的一种黄芪不同极性部位利水消肿药效活性成分的分析辨识方法，其特征在于：将步骤三所得特征峰数据和步骤四所得的药效学数据代入谱效数学模型进行分析，采用灰色关联度分析方法，评价各特征峰所代表的的化学成分对药效活性的贡献大小；
其中：所述灰色关联度分析方法包括如下步骤：
（1）参考序列与比较序列的选择：以黄芪不同极性部位4个药物的28个特征峰作为比较数列即子序列，构成28个子序列记为 [Xi(k)]，以阿霉素肾病大鼠药效学指标24 h尿蛋白含量、ALB、BUN、CK、SCr、TCHO、TG、TP作为母序列记为 [X0(k)]，根据母序列与子序列关联度的大小，来确定各成分含量对药效贡献的大小；
（2）关联系数计算：[Xi(k)]与[X0(k)]的关联系数εi(k)由下列公式计算：；k 为不同极性部位黄芪；Xi 为不同极性黄芪的特征峰；εi(k)为第k个不同极性部位黄芪的子序列Xi与母序列X0的关联系数；分别为母序列与子序列绝对差最大、最小值，记为△max、△min； 为母序列与子序列的绝对差值，记为△i(k)；ρ 为分辨系数，ρ 取值区间为(0,1)，取 ρ = 0.5。
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