CN102028840B - 一种复方中成药的超高压液相检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种药材的中成药的超高压液相检测方法，包括：制备供试品溶液、对照品药材溶液，以乙腈∶水作为流动相，紫外检测器和/或质谱检测器，检测波长为201-320nm，进行UPLC的测定；结果检测是在供试品的色谱中，在与对照药材色谱相同保留时间的位置上，检视是否有相应的色谱峰；本发明的检测方法与薄层鉴别以及HPLC检测方法相比，成功地提高了色谱图的分辨率，缩短了分析周期，结果更精确稳定。

Description

一种复方中成药的超高压液相检测方法

技术领域

本发明提供了一种复方中成药的超高压液相检测方法，其为采用超高压液相来检测复方中成药(又称大处方)制剂中有效成分的方法，尤其指含有白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中的两种或两种以上成分的中成药中有效成分的超高压液相检测方法。

背景技术

中药复方是中医临床用药的主要形式和手段，方中各味药又含有多种化学成分，这些固有的化学成分是中药复方发挥药效作用的物质基础，但方中任一活性成分并不能全面反映中医用药所体现的整体疗效，这是中药复方与化学合成药品在制定质量标准过程中的根本区别，所以宏观的综合分析成为中药复方发展的必然趋势。中药复方作为中医药的精髓，已应用了上千年，从现代研究的角度，一个中药复方具有多成分、多作用、多靶点等特点。在“素问”至真要大论中记载：“主病之谓君，佐君之谓臣，应臣之谓使”。随着中药现代化、国际化的深入发展，迫切需要建立一种对中药和中药复方产品从原料到成品进行质量控制以及对其复杂成分检出的方法，指纹图谱应运而生。

“指纹”(finger printing)鉴定来源于法医学，每个人的指纹在微小的细节构造中各有不同。依据这些差异，通过“比对”方式，可以确定鉴别每个人的特征。随着现代生物技术的发展，出现了DNA指纹图谱。通过DNA指纹图谱分析，能对人、动物、植物等生物体进行鉴别鉴定。

植物药在质量控制方面使用指纹图谱(尤其是色谱指纹图谱)起源于20世纪70年代。当前的中药指纹图谱(fringerprinting)借用DNA指纹图谱发展而来，是一种综合的、可量化的色谱鉴定手段。最先发展起来的是中药化学成分色谱指纹图谱，而本领域一般所述的指纹图谱若无特别提示均指的是高效液相色谱(HPLC)指纹图谱。其是利用HPLC具有的很高的分离度，把复杂的化学成分进行分离而形成高低不同的峰组成一张色谱图，这些色谱峰的高度和峰面积分别代表了各种不同化学成分和其含量，和药效研究结果联系就会产生中药谱效学。但是针对由多种药味组成的、药材涉及面广、化学成分复杂的中成药，例如同仁乌鸡白凤丸，影响和干扰因素较多，目前普遍利用的HPLC技术建立指纹图谱所需要的总时间较长，而且分离度难以达到较理想的状况。

超高效液相色谱技术(UPLC)是近年来发展较快的新型液相色谱检测技术，借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。

与高效液相色谱技术相比较，超高效液相色谱技术在以下方面得到改善：

(1)提高色谱柱的性能，解决小颗粒填料的耐压问题、装填问题，包括颗粒度的分布以及色谱柱的结构。

(2)采用了高压溶剂输送单元，降低整个系统死体积，解决超高压下的耐压及渗漏问题。

(3)解决了给流动相、色谱柱迅速升温，降低由于温度梯度导致峰变形的问题。

(4)快速自动进样器，降低进样的交叉污染。

(5)高速检测器、系统控制及数据管理，优化流动池以解决高速检测及扩散问题，解决高速数据的采集、仪器的控制问题。

UPLC技术最主要的特点体现在色谱柱颗粒度的更新上。色谱柱技术涵盖了如下几方面的内容：首先是填料的合成，以得到高质量的填料颗粒，包括：耐高压、耐酸碱等等。其次是颗粒的筛选，选出颗粒度分布尽可能窄的填料。最后是装填技术，以保证既堵住颗粒不使其外流，又不至引起反压的大幅升高。

传统色谱柱填料的装填技术受两方面的影响，导致现有小颗粒填料色谱柱的性能及质量均不能达到要求。首先是其颗粒度分布较宽，例如5μm颗粒度填料中会有大量的4μm以下及6μm以上的颗粒，因此通常用2μm筛板在色谱柱的出口拦截填料，阻止其外漏。其次，如使用低于2μm的筛板，筛板的反压升高很快，甚至超过了填料所产生的反压。因此，目前大多数3.5μm、2.5μm或更低颗粒度的填料还是使用2μm的筛板，只在柱头装填一小段5μm的填料。

UPLC色谱柱所使用的1.7μm填料与传统色谱柱相比内部有更多交联结构，机械强度有显著提高。为了得到更好的耐压能力及传质作用，同时还优化其孔体积及孔径。UPLC使用的筛分技术使1.7μm填料分布很窄，同时运用新筛板，使色谱柱的性能有极大提高。与HPLC相比，UPLC具有超强分离能力和速度、超高灵敏度、简单方便的方法转换及良好的质谱入口。

超高效液相色谱UPLC具有超强分离能力和速度、超高灵敏度的特点，将此技术引入指纹图谱中，大大缩短分析周期，提高分离度，同时分离出更多有效成分色谱峰，达到事半功倍的效果。上述的超高压液相的特点显示了其在检测复杂成分时的独有的优势。

很多中成药是由多种药味组成的，如同仁乌鸡白凤丸由十九味药材组成，药材涉及面广，化学成分复杂，仅靠其几个药材或活性成分作为其质量控制指标，难以全面控制药品的内在质量状况，更不能对其真伪优劣做出判断。影响薄层鉴别的干扰因素较多，相应各药材阴性样品多有干扰。目前利用HPLC技术建立指纹图谱所需要总时间普遍较长，且分离度难达到较理想的状况。

研究并建立采用超高效液相色谱技术UPLC对同仁乌鸡白凤丸主要原料药材、中间体和成品质量进行生产过程控制的方法，有利于提高产品内在质量的均一性、稳定性并缩短生产和检验周期。本发明试图运用UPLC超高效液相技术建立同仁乌鸡白凤丸提取物指纹图谱将更加快速、高效、高灵敏度地指认各味有效成分，有利于基础物质研究。利用建立超高压液相的色谱指纹图谱来控制其质量比薄层鉴别、含量测定等常规标准更加全面客观。

发明内容

针对现有技术在中药成分检测方面存在的缺陷。发明人经过大量的实验，研究了一种中药制剂中同时鉴别处方多种药材的检测方法，结果证明，与传统的薄层色谱鉴别方法以及目前普遍应用的HPLC相比，本发明的方法避免现有薄层方法需要采用不同的前处理方法制备供试品溶液和对照药材溶液后，再采用不同的展开剂系统分别实验的缺点，与HPLC相比又大大缩短分析周期，提高分离度，同时分离出更多有效成分色谱峰，鉴定结果更客观准确。

本发明的贡献在于：发明人将超高压液相指纹图谱应用于大处方的中药制剂质量的整体分析与评价。以同仁乌鸡白凤丸为例，采用UPLC方法建立同仁乌鸡白凤丸制剂指纹图谱，以对照药材色谱作为对照进行处方药材的鉴定，为中药指纹图谱分析和大处方药材的质量控制提供新的思路。

本发明目的是提供一种含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种的中成药的超高压液相检测方法，通过该方法可得到准确的检测结果，避免其他杂质干扰，达到事半功倍效果，鉴定结果更客观难确。

本发明提供一种复方中成药的超高压液相检测方法，该复方中成药含有白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种药材或药材成分，该检测方法包括：

(1).供试品溶液的制备，称取供试品，加入相当于供试品5-10倍量的甲醇，溶解，滤过，滤液回收溶剂并浓缩至干，残渣加与上述甲醇等量的水使溶解，放冷，通过大孔树脂吸附柱，以上述甲醇量的2-10倍的水洗脱，弃去水液，再用15-45％wt的与上述甲醇等量的乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用75-95％wt的为上述甲醇量的2-6倍的乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并移至量瓶，加甲醇至刻度，过微孔滤膜，取续滤液，制成供试品的溶液，所述供试品溶液的浓度为每ml相当于供试品0.1-10g；

(2).对照药材溶液的制备，取白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪和香附中至少两种对照药材，按供试品溶液的制备制成对照药材溶液；

(3).超高压液相的色谱条件，以水为流动相A，乙腈为流动相B，用不同重量比例的A与B混合，梯度洗脱；

(4).测定，吸取上述供试品和对照药材溶液各2μL，注入超高压液相色谱仪，测定；

(5).结果检测，在供试品的色谱中，在与对照药材的色谱相同保留时间的位置上，检视是否分别有相应的色谱峰。

本发明的检测方法采用样品先经过前处理再用超高效液相色谱的检测方法，改变了通常对液相色谱中含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种药材的样品处理方法，成功地消除了中成药制剂中待测成分以外的液相图谱中的杂峰，本发明改善了HPLC需要的时间普遍比较长、且分离度难以达到较理想的状况，使本发明采用超高压液相得到的检测结果更精确稳定。为了辅助对照药材的对照效果，在本发明的优选实施例中，所述的超高压液相检测方法还包括增加一个制备对照品溶液的步骤，对照品溶液的制备包括分别取芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rf、丹参酮IIA、黄芪甲苷、芒柄花素中至少两种与所述中成药中成分相对应的对照品，加甲醇，过微孔滤膜，取续滤液，得到对照品溶液；相应地，在测定步骤中增加吸取对照品溶液2μL注入UPLC并测定的步骤；以及在供试品色谱中，与对照品和对照药材的色谱相同保留时间的位置上，检视是否分别有相应的色谱峰。

在本发明所述的超高压液相检测方法中，所采用的检测器为紫外检测器和/或质谱检测器。当所述的对照药材选自白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归中至少一种时，检测方法采用紫外检测器，检测波长为201-320nm；所述的对照药材选自黄芪和/或香附时，检测方法采用质谱检测器。

相应地，对照药材选自白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归中至少一种时，相应的对照品选自芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rf、丹参酮IIA中与上述对照药材相对应的至少一种，该检测方法采用紫外检测器，检测波长为201-320nm；对照药材选自黄芪和/或香附，则相对应的对照品选自黄芪甲苷和/或芒柄花素，该检测方法采用质谱检测器。

综上所述，本发明提供一种复方中成药的超高压液相检测方法，其为一种含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种成分的复方中成药的超高压液相的检测方法，该检测方法优选包括：

(1).供试品溶液的制备：称取供试品，加入相当于供试品5-10倍量的甲醇，溶解，滤过，滤液回收溶剂并浓缩至干，残渣加与上述甲醇等量的水使溶解，放冷，通过大孔树脂吸附柱，以上述甲醇量的2-10倍的水洗脱，弃水液，再用15-45％wt的与上述甲醇等量的乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用75-95％wt的为上述甲醇量的2-6倍的乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并移至量瓶，加甲醇至刻度，过微孔滤膜，取续滤液，制成供试品的溶液；

(2).对照品溶液的制备：分别取芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rf、丹参酮IIA、黄芪甲苷、芒柄花素中至少两种与所述中成药中成分相对应的对照品，加甲醇，过微孔滤膜，取续滤液，得对照品的溶液；

上述“芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rf、丹参酮IIA、黄芪甲苷、芒柄花素中至少两种与所述中成药中成分相对应的对照品”是指针对本发明含有白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中两种或两种以上药材成分的中成药，选择与该中成药所含药材成分相对应的对照品。

上述的对照品取适量即可，所述的适量是指芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rf、丹参酮IIA、黄芪甲苷、芒柄花素对照品加入甲醇后，制得的对照品溶液的浓度在0.01-0.2mg/mL的范围内。例如：加甲醇制成的对照品的溶液中，每1mL分别含芍药苷0.06mg/mL、甘草苷0.02mg/mL、人参皂苷Rb₁0.2mg/mL、丹参酮IIA 0.016mg/mL、人参皂苷Rf 0.2mg/mL、黄芪甲苷0.2mg/mL、芒柄花素0.02mg/mL。

(3)对照药材溶液的制备：分别白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种对照药材(与所测定的中成药所含有的成分相对应)，按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液；

(4).超高压液相的色谱条件，以水为流动相A，以乙腈为流动相B，按照不同比例的A∶B洗脱；

本发明的检测方法采用紫外检测和/或质谱检测。其中紫外检测的波长选为201-320nm，优选201-290nm，更优选约203nm和280nm两个波长下检测；紫外检测器不能检测所有的成分，当检测波长在201-205nm，紫外检测器可以检测白芍、人参、甘草、青蒿，当检测波长在255-290nm，紫外检测器可以检测丹参、川芎、当归；而质谱检测器几乎可以检测所有成分，因此，在本发明中，所采用的质谱检测器除检测上述紫外检测的药材外，还可检测黄芪和香附。

(5).测定，吸取上述供试品溶液、对照品溶液和对照药材溶液各2μL，注入超高压液相色谱仪，测定；

(6).结果检测，在供试品的色谱中，在与对照品和对照药材色谱相同保留时间的位置上，检视是否分别有相应的色谱峰。

上述步骤(1)中过滤用的微孔滤膜优选为孔径小于0.45μm的微孔滤膜，例如0.1～0.45μm的微孔滤膜，更优选0.2～0.4μm，例如0.22μm、0.35μm。

上述一种含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种成分的复方中成药的超高压液相的检测方法，具体步骤包括：

1.供试品的溶液的制备：精密称取供试品(例如6g)，加入相当于供试品5-10倍量的甲醇(优选相对于6g供试品，甲醇量为约50mL)，溶解，优选超声处理(功率300W，频率50kHz)30分钟，滤过，滤液回收溶剂并浓缩至干，残渣加与上述甲醇等量的水使溶解，放冷，通过D101型大孔树脂吸附柱(装柱的树脂约60g，内径2cm，长12cm)，以大约是上述甲醇量的2-10倍的水(优选5-7倍于甲醇，例如甲醇量约50mL，则水大约300mL)洗脱，弃去水液，再用15-45％wt(优选30％wt)的与上述甲醇等量的乙醇(例如300mL)洗脱，弃去洗脱液，继用75-95％wt(优选80％wt)的约为上述甲醇量的2-6倍的(优选3-5倍于甲醇)乙醇(例如甲醇量约50mL，则该乙醇大约200mL)洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至量瓶中(例如供试品为6g，则优选量瓶为5mL，加甲醇至刻度，过微孔滤膜(优选0.2-0.3μm的微孔滤膜)，取续滤液，制成供试品溶液；

2.对照品溶液的制备：分别取芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rf、丹参酮IIA、黄芪甲苷、芒柄花素中至少两种对照品(与所测定的中成药所含有的成分相对应)，加甲醇制成对照品溶液，对照品溶液的浓度为0.01-0.2mg/mL，过微孔滤膜，取续滤液，得对照品的溶液；

3.对照药材溶液的制备：分别取白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种对照药材(与所测定的中成药所含有的成分相对应)，按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液；

4.色谱条件：色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，优选WatersACQUITY UPLC^TM BEH C₁₈柱，规格2.1mm×50mm，优选填充剂的粒径约为1.7μm；以水为流动相A，乙腈为流动相B，按照下表1的A∶B的不同比例进行梯度洗脱；即以水为流动相A，以乙腈为流动相B，按照由100％wtA依次减少A的量增加B的量直至100％wt的B的次序进行梯度洗脱；洗脱时间一般在60分钟即可，超过60分钟也可；紫外检测的检测波长201-320nm，优选201-290nm，更优选203-280nm，例如检测波长203nm(当中成药含有并需检测白芍、人参、甘草和/或青蒿时)，280nm(当中成药含有并需检测丹参、川芎和/或当归时)；也可同时采用质谱检测。

表1UPLC流动相梯度

5.精密吸取供试品、对照品和对照药材溶液各2μL，注入色谱仪测定；

6.结果检测：在供试品的色谱中，在与对照品和对照药材色谱相同保留时间的位置上，检视是否分别有相应的色谱峰，且紫外光谱或质谱相一致。

若供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相同保留时间位置上，分别有相应的色谱峰，且紫外光谱或质谱相一致，则可以判断该供试品(样品)中含有对照品或对照药材相应的成分；进一步根据色谱峰的面积可以折算该供试品(样品)中含有对照品的成分的含量。

本发明所涉及的供试品是指含有白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种成分的中成药(制剂)，业内又称为大处方。

当上述的检测方法为检测含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪和香附的复方中成药的方法时，所述的对照品溶液的制备包括加甲醇制成每1mL分别含芍药苷0.06mg/mL、甘草苷0.02mg/mL、人参皂苷Rb10.2mg/mL、丹参酮IIA 0.016mg/mL、黄芪甲苷0.2mg/mL、芒柄花素0.02mg/mL，的溶液作为对照品溶液。

上述的超高压液相检测方法中，流动相的流速一般为0.1-0.8mL·min^-1；优选0.4mL·min^-1；超高压液相的色谱柱的柱温为30-40℃，优选约35℃。

在本发明的优选实施例中，所采用的超高压液相的进样量约2μL；色谱图的记录时间约为60分钟，也可超过60分钟。

以同仁乌鸡白凤丸(水蜜丸)为例(北京同仁堂公司提供)；该乌鸡白凤丸(水蜜丸)中成药中有效成分的检测方法包括：

1.供试品的溶液的制备：精密称取乌鸡白凤丸(例如6g)，加入相当于供试品5-10倍量的甲醇(优选50mL)，溶解，优选超声处理，滤过，滤液回收溶剂并浓缩至干，残渣加与上述甲醇等量的水使溶解，放冷，通过D101型大孔树脂吸附柱，以约为上述甲醇量的2-10倍的水洗脱，弃去水液，再用15-45％wt的大约与上述甲醇等量的乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用75-95％wt的约为上述甲醇量的2-6倍的乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至量瓶中(例如优选量瓶为10mL以下，更优选5ml的量瓶)，加甲醇至刻度，过微孔滤膜(0.25-0.5μm的微孔滤膜)，取续滤液，制成供试品溶液；

2.对照品的溶液的制备：分别取芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rf、丹参酮IIA、黄芪甲苷、芒柄花素对照品中至少两种，加甲醇制成对照品的溶液，该溶液中，芍药苷0.06mg/mL、甘草苷0.02mg/mL、人参皂苷Rb10.2mg/mL、丹参酮IIA 0.016mg/mL、人参皂苷Rf0.2mg/mL、黄芪甲苷0.2mg/mL、芒柄花素0.02mg/mL，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，得到对照品的溶液；

3.对照药材溶液的制备：分别取白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪和香附对照药材中至少两种(与所测定的中成药所含有的成分相对应)，按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液；

4.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Acquity UPLCBEH C18；以水为流动相A，以乙腈为流动相B，进行按照由100％wt的A依次减少A的量增加B的量直至100％wt的B的次序的梯度洗脱；梯度洗脱的时间为约60分钟；检测波长为201-320nm，优选203-290nm，例如检测波长约为203nm(当检测白芍、人参、甘草和青蒿时)，检测波长优选约280nm(当检测丹参、川芎和当归时)；同时采用质谱检测，用来检测黄芪和香附的成分；

5.测定：吸取上述溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定；

6.结果检测：在供试品的色谱中，在与对照品和对照药材色谱相同保留时间的位置上，检视是否分别有相应的色谱峰，且紫外光谱或质谱相一致。

若供试品色谱中，在与对照品和对照药材的色谱相同保留时间位置上，分别有相应的色谱峰，且紫外光谱或质谱相一致，则可以判断该供试品(样品)中含有对照品或对照药材的成分；进一步根据峰的面积可以折算该供试品(样品)中含有对照品成分的含量。

上述检测方法步骤1即供试品溶液的制备中，通过D101型大孔树脂吸附柱，以水洗脱，水液中含有供试品中含有的糖类成分，该糖类成分对HPLC的图谱峰造成干扰，所以本发明选择弃去水液，再用15-45％wt的乙醇洗脱，预试验显示，这部分洗脱下来的成分与80％wt乙醇洗脱的流分的指纹图谱重合，因此不可避免也将对检测结果造成干扰，因此本发明选择弃去15-45％wt的乙醇洗脱的洗脱液，继用75-95％wt的乙醇洗脱，多次预试验的结果显示，这部分洗脱液的色谱峰最多，因此本发明收集75-95％wt的乙醇洗脱的洗脱液。

以乌鸡白凤丸为例，该乌鸡白凤丸(水蜜丸)中成药中有效成分的检测方法基本同上，同样可以检测供试品的中成药即乌鸡白凤丸(水丸)中是否含有对照品的成分以及其在中成药中的成分含量。

本发明主要采用了中成药中有效成分的对照品(相当于纯品)用高效液相的方法制作超高压液相指纹图谱，再与含有效成分的中成药制剂的超高效液相图谱相比较，即可对比并精确计算出该中成药制剂中是否含有上述有效成分。

在本发明优选实施例中，以乌鸡白凤丸(水蜜丸)为例，该检测方法包括：

1.供试品的溶液的制备：取乌鸡白凤丸，研细，精密称取6g，加入甲醇50mL，超声处理(功率300W，频率50kHz)30分钟，放冷，滤过，滤液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水50mL使溶解，放冷，通过D101型大孔树脂(安徽三星树脂科技有限公司)吸附柱(填充物约60g，内径2cm，长12cm)，以水300mL洗脱，弃去水液，再用30％乙醇300mL洗脱，弃去洗脱液，继用80％乙醇200mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5mL量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，制成供试品的溶液；

2.对照品的溶液的制备：分别取对照品芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb₁、丹参酮IIA、黄芪甲苷、芒柄花素(由中国药品生物制品检定所提供)，加甲醇制成分别含芍药苷0.06mg/mL、甘草苷0.02mg/mL、人参皂苷Rb₁0.2mg/mL、丹参酮IIA 0.016mg/mL、黄芪甲苷0.2mg/mL、芒柄花素0.02mg/mL的溶液作为对照品的溶液；

甲醇、乙醇均为分析纯试剂；UPLC用乙腈(J.T.Baker公司)为色谱纯。水为纯净水，过孔径标示为0.22μm的微孔滤膜；

3.对照药材溶液的制备：分别取白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪和香附对照药材(与所测定的中成药所含有的成分相对应，由中国药品生物制品检定所提供)，按供试品溶液的制备方法制成对照药材溶液；

4.色谱条件：Waters Acquity UPLC^TM超高效液相色谱仪-二极管阵列检测器(PDA)，Waters Empower 2数据处理软件系统；以乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长201-205nm，优选203nm，该波长下检测白芍、人参、甘草、青蒿等成分，及波长255-290nm，优选270-285nm，该波长下检测丹参、川芎、当归等成分；质谱还可检测黄芪和香附。

表UPLC流动相梯度

5.测定：精密吸取上述溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定；

6.结果检测：供试品色谱中，在与对照品和对照药材的色谱相同保留时间位置上，分别有相应的色谱峰，且紫外光谱或质谱相一致。

本发明的采用超高压液相测定含有白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中的两种或两种以上药材成分的大处方的中药制剂中有效成分的方法，是发明人在大量的实验摸索和筛选数据的基础上建立的，所述的实验摸索和筛选数据的工作大致如下(以同仁乌鸡白凤丸(水蜜丸)为例)：

分析检测方法的建立和影响因素的考察。

1色谱柱的选择：

试用了Waters ACQUITY UPLC^TM BEH C₁₈柱(2.1mm×50mm，1.7μm)及Waters ACQUITY UPLC^TM RP₁₈柱(2.1mm×50mm，1.7μm)。后者分离所得色谱峰数少，且分离效果不佳，而Waters ACQUITY UPLC^TMBEH C₁₈柱(2.1mm×50mm，1.7μm)分离效果好。故选择WatersACQUITY UPLC^TM BEH C₁₈柱(2.1mm×50mm，1.7μm)。

2检测波长的选择：上述色谱条件下，在200～400nm范围内对供试品溶液进行光谱扫描，根据样品3D色谱图，以选取能给出最多色谱峰信息的检测波长。而经试验发现单一波长下难于保留该复方的色谱指纹图谱所有主要指纹峰。在203nm和280nm处色谱峰信息多、较为集中，基线比较平稳，且此两个波长下图谱保留了其他波长的主要指纹峰。故最优选取203nm及280nm波长作为检测波长，也根据中成药的种类、批次不同，以及实验条件的差异，也可以选择201-320nm的波长作为检测波长。

3方法学考察：

3.1精密度实验：取同仁乌鸡白凤丸(水蜜丸，批号4030220)，按上述方法相关项下方法制备供试品的溶液，连续进样6次，测得各共有峰相对保留时间稳定，以及各共有峰相对峰面积的RSD小于3％。符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中精密度试验的有关规定。

3.2重复性试验：取同一批号(4030220)同仁乌鸡白凤丸(水蜜丸)6份，精密称定，按“2”项下方法制备供试品溶液，分别进样，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积。

各共有峰相对保留时间稳定，各共有峰相对峰面积的RSD小于3％，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中重复性试验的有关规定。

3.3稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0，4，8，12，16，20，24h进样，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积。供试品在24h内稳定。

依次收集比较了不同比例乙醇(10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)过大孔树脂柱洗脱液，分离各极性部位，考察发现30％乙醇洗脱液与80％乙醇洗脱液为两临界点，制剂中主要色谱峰集中于30％-80％部位。以上为质量浓度百分比，即％wt。

同时，本发明还进行了分析方法中以下影响因素的考察。

样品提取条件的选择：实验分别考察了不同种类的提取溶剂如甲醇，乙醇、水；不同比例的提取溶剂如30％wt甲醇、50％wt甲醇、70％wt甲醇；不同的提取方法如超声，热回流，索氏提取。结果表明，不同比例甲醇溶剂提取的色谱图中甲醇提取法所得色谱峰较多。同时考察了正丁醇萃取和甲醇提取的供试品溶液，在上述色谱条件下测定指纹图谱，两种方法的色谱图无本质的区别。故本实验采用甲醇提取法，确保同仁乌鸡白凤丸中的多种成分能够体现在指纹图谱中。同仁乌鸡白凤丸由19味药材组成，是一个复杂的复方制剂，甲醇提取物色谱图峰多但分离不佳，根据同仁乌鸡白凤丸成品中各主要有效成分极性各不相同，故考察了由高极性至低极性过大孔树脂柱，收集不同比例乙醇洗脱物分离各极性部位及由低极性至高极性采用不同溶剂(氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇)索氏提取，收集不同部位提取物两种分离方法。不同部位索氏提取物所得色谱图中色谱峰重叠严重，且基线不平，色谱峰不能得到很好分离。采用过大孔树脂柱法所得色谱峰多且分离良好。在考察了不同比例乙醇洗脱物的色谱峰特征后，最终确定了乙醇洗脱液比例。

大孔树脂类型的选择：采用D-101型大孔树脂与AB-8型大孔树脂分离样品。后者分离皂苷类化学成分效果不佳，供试品皂苷类有效成分较多，故选择D-101型大孔树脂。

流动相及洗脱方式的优化：同仁乌鸡白凤丸所含成分较多，性质差异较大，采用等度洗脱的方式很难在短时间内将其有效成分洗脱和分离，因而采用梯度洗脱程序来分离同仁乌鸡白凤丸中的成分。在流动相系统的选择中，根据原料药材有效成分类别及所占比例，大都为乙腈-水、乙腈-酸系统。于是分别考察了乙腈-水、乙腈-0.5％冰醋酸、乙腈-0.1％冰醋酸、乙腈-0.1％甲酸梯度洗脱色谱系统。结果表明，在乙腈-酸系统中，色谱峰基线噪音干扰严重；在乙腈-水系统中，色谱峰得到较好的分离，基线平稳。故采用乙腈-水系统作为流动相。

测定方法的考察：吸取供试品溶液2μL，注入UPLC色谱仪，另吸取甲醇溶剂2μL作为空白溶液注入UPLC，结果表明在203nm下有溶剂峰但不干扰色谱峰归属，280nm下无溶剂峰干扰。

由于篇幅所限，其他对照药材的指纹图谱暂欠奉。本发明中除了特殊标注和说明外，其他溶剂的浓度(包括百分比浓度％)均为质量浓度(％wt)。

本发明所检测的中成药为含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中至少两种的复方中成药制剂，优选为含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪和香附的中成药制剂，包括乌鸡白凤丸和/或在乌鸡白凤丸基础上的改剂型的中药制剂，该改剂型的中药制剂包括含有乌鸡白凤丸的中药组方的制剂。例如本发明所检测的中成药包括乌鸡白凤丸的水蜜丸、乌鸡白凤丸的水丸、乌鸡白凤胶囊和/或乌鸡白凤口服液。

在此基础上对同仁乌鸡白凤丸指纹图谱中的主要色谱峰进行LC-MS-MS研究，其目的是通过质谱证明被检测到的色谱峰确实是与对照药材和对照品的色谱峰在结构上是一致的，因保留时间相同的峰未必是同种结构化合物，需LC-MS-MS来进一步确认该峰代表的化合物的结构，且质谱检测器检测范围较紫外光谱更加宽泛，可检测出没有紫外吸收的化合物。另外，结合质谱检测器，还可鉴别同仁乌鸡白凤丸为例的组合无处方中同时含有的黄芪和香附药材。

通过对10批同仁乌鸡白凤丸(水蜜丸)样品UPLC指纹图谱的研究表明，建立同仁乌鸡白凤丸(水蜜丸)UPLC指纹图谱方法是可行的。该方法稳定、重现性好，可作为同仁乌鸡白凤丸质量控制的标准之一。在此基础上对同仁乌鸡白凤丸指纹图谱中的主要色谱峰进行LC-MS-MS研究。

1实验部分

1.1仪器与试药：除对照品增加黄芪甲苷、芒柄花素，对照药材增加黄芪和香附外，其余同上。

1.2色谱条件：同上。

1.3质谱条件：离子源：ESI，离子阱检测器；检测模式：正、负离子检测；毛细管电压：3.5kv；喷雾气：35psi；干燥气(N₂)流速：12.0L·min^-1；干燥气温度：350℃；采用全离子扫描方式，扫描范围：100～1800m/z。

1.4供试品溶液制备：同上。

1.5对照品溶液制备：分别取芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rf、丹参酮IIA、黄芪甲苷、芒柄花素对照品适量，加甲醇制成对照品溶液，过0.25μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

1.6对照药材溶液的制备：同上。

1.7测定法：分别吸取对照品溶液和供试品溶液各2μL，注入超高效液相色谱仪，记录60min色谱图，即得。

2方法与结果

2.1主要色谱峰的结构确证

2.1.1主要色谱峰的紫外吸收光谱鉴别

为明确203nm及280nm波长下同仁乌鸡白凤丸指纹图谱上待鉴定成分色谱峰的药材归属，将成品指纹图谱与对照品溶液和药材阴性样品对照，比较谱峰的保留时间以及DAD光谱图，确认了其中含有4个对照品色谱峰。再通过成品指纹图谱与药材提取液和药材阴性样品对照，比较谱峰的保留时间以及DAD光谱图，确认了制剂中含有8味药材共16个特征色谱峰。结果见同仁乌鸡白凤丸(水蜜丸)UPLC指纹图谱(203nm)和(280nm)的谱图。

2.1.2主要色谱峰的LC-MS-MS定性分析

本实验采用LC-ESI-MS/MS联用方法对同仁乌鸡白凤丸中的化学成分进行分析。根据与紫外光谱相同洗脱方法下提取相同保留时间对照品溶液、药材提取液及成品溶液分子离子峰，结合紫外光谱及二级和三级质谱所得的碎片峰，以及参考文献，最终通过LC-MS-MS确认复方中9味植物药材共22个特征色谱峰，并推测出其可能结构。

结果：色谱峰1的一级质谱显示分子离子峰[M-1]^-为479.5Da，主要碎片峰m/z357.1[[M-1]^-Glu]^-，m/z449.1[[M-1]-CH₂O]^-。以[M-1]^-479.5为母离子的二级质谱，显示m/z357.1离子，为由[M-1]^-丢失一个葡萄糖基分子(162Da)的碎片离子。以[M-1]^-479.5为母离子的二级质谱，显示m/z449.1离子，为由[M-1]^-丢失一个甲氧基分子(30Da)的碎片离子。

药材溶液与制剂样品溶液中色谱峰1的一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间完全一致。结合参考文献，发现色谱峰1裂解特征与白芍药材中芍药内酯苷的结构相符。可推断出色谱峰1可能为芍药内酯苷。

结合对照品溶液、白芍药材溶液、缺味阴性溶液及制剂溶液的紫外光谱初步判断色谱峰3为芍药苷，为进一步证实判断，将芍药苷对照品溶液与制剂溶液做LC-MS-MS。在正离子模式中一级质谱显示[M+Na]⁺为503Da，主要碎片峰m/z341[[M+Na]-Glu]⁺，m/z381[[M+Na]-C₇H₆O₂]⁺。以[M+Na]⁺503为母离子的二级质谱，显示m/z341离子，为由[M+Na]⁺丢失一个葡萄糖基分子(162Da)的碎片离子。以[M+Na]⁺503为母离子的二级质谱，显示m/z381离子，为由[M+Na]⁺丢失一个苯甲酰基分子(122Da)的碎片离子。可推断出色谱峰3为芍药苷。

色谱峰8的一级质谱显示分子离子峰[M+H₂O+H]⁺为602.2Da，主要碎片峰m/z584[M+H]⁺，m/z567.1[M-OH+H]⁺，[M+H₂O+H]⁺602.2为母离子的二级质谱，显示m/z584离子，为由[M+H₂O+H]⁺丢失一分子水(18Da)的碎片离子；m/z567.1离子，为由[M+H]⁺丢失一分子水(18Da)的碎片离子。色谱峰8的一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间完全一致。色谱峰8裂解特征与白芍药材中苯甲酰芍药苷的结构相符。可推断出色谱峰8可能为苯甲酰芍药苷。

色谱峰2的正离子模式一级质谱显示分子离子峰[M+1]⁺为193，二级质谱显示m/z178离子，为由[M+1]⁺母离子丢失一分子-CH₃的碎片离子。青蒿药材溶液与制剂样品溶液中色谱峰2的正离子检测一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间均完全一致。可推断制剂中色谱峰2是归属于青蒿药材的特征色谱峰。

结合对照品溶液、甘草药材溶液、缺味阴性溶液及制剂溶液的紫外光谱初步判断色谱峰4为甘草苷，为进一步证实判断，将甘草苷对照品溶液与制剂溶液做LC-MS-MS确证。在负离子模式中色谱峰4的一级质谱显示分子离子峰[M-H]^-为417Da，主要碎片峰m/z255[[M-Glu-H]]^-，m/z135。以[M-H]^-417为母离子的二级质谱，显示m/z255离子，为由[M-H]^-丢失一个葡萄糖基分子(162Da)的碎片离子。m/z135为碎片离子峰m/z255[[M-Glu-H]]^-C-O重排裂解后的碎片离子。色谱峰4与甘草苷对照品的一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间完全一致。可推断出色谱峰4为甘草苷。

色谱峰5的负离子模式一级质谱显示主要分子离子峰为m/z549，二级质谱中主要碎片离子为m/z417，m/z255。碎片离子m/z417提示m/z549母离子丢失了一分子五碳糖基(132Da)，碎片离子m/z255提示m/z549母离子丢失一分子五碳糖基(132Da)后，继而丢失一分子葡萄糖基(162Da)。甘草药材溶液与制剂样品溶液中色谱峰5的负离子检测一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间均完全一致。可推断制剂中色谱峰5是归属于甘草药材的特征色谱峰。

由色谱峰6的负离子检测一级质谱图可知，色谱峰6的分子量为286。负离子检测中，一级质谱显示主要分子离子峰[M-1]^-为m/z285，二级质谱显示m/z270，提示是[M-1]^-丢失一分子-CH₃(15Da)的碎片离子。甘草药材溶液与制剂样品溶液中色谱峰6的负离子检测一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间均完全一致。可推断制剂中色谱峰6是归属于甘草药材的特征色谱峰。

由色谱峰7的负离子检测一级质谱图可知，色谱峰7的分子量为270。负离子检测中，一级质谱显示主要分子离子峰[M-1]^-为m/z269，二级质谱显示m/z237，提示是[M-1]^-丢失一分子32Da的碎片离子。甘草药材溶液与制剂样品溶液中色谱峰7的负离子检测一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间均完全一致。可推断制剂中色谱峰7是归属于甘草药材的特征色谱峰。

由色谱峰10的正离子检测一级质谱图可知，色谱峰10分子量为322.2。正离子检测中，一级质谱显示主要分子离子峰[M+1]⁺为m/z323.2，二级质谱显示m/z267离子，为由[M+1]⁺母离子丢失异戊烷基(55Da)的碎片离子。甘草药材溶液与制剂样品溶液中色谱峰10的正离子检测一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间均完全一致。推断色谱峰10可能是具有异戊烯基侧链的甘草黄酮类化合物，是归属于甘草药材的特征色谱峰。

由色谱峰11正离子检测一级质谱图可知色谱峰11的分子量为338.2。正离子检测中一级质谱显示主要分子离子峰[M+1]⁺为m/z339.2，二级质谱显示m/z283离子，为由[M+1]⁺母离子丢失一分子异戊烯基(55Da)的碎片离子。甘草药材溶液与制剂样品溶液中色谱峰11的正离子检测一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间均完全一致。由正离子检测一级二级质谱特征裂解碎片信息(丢失一分子异戊烯基团)可知该化合物可能为甘草黄酮类化合物。结合参考文献，甘草查尔酮分子量为338.2。可推断制剂中色谱峰11可能为甘草查尔酮。

色谱峰13的一级质谱显示分子离子峰[M+Na]⁺为247，[M+2Na]⁺为471，[M+H-H₂O]⁺为207。二级质谱显示m/z189离子，为由[M+H-H₂O]⁺母离子丢失一分子-H₂O的碎片离子；m/z179离子，为由[M+H-H₂O]⁺母离子侧链断裂脱烯，丢失一分子-C₂H₄的碎片离子；m/z165离子，为由[M+H-H₂O]⁺母离子侧链断裂脱烯，丢失一分子-C₃H₆的碎片离子。川芎、当归药材溶液与制剂样品溶液中色谱峰13正离子检测一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间均一致。由保留时间、碎片离子及断裂特征可知，色谱峰13可能为洋川芎内酯I。

色谱峰14一级质谱显示分子离子峰[M+Na]⁺为247，[M+H-H₂O]⁺为207。二级质谱显示m/z189离子，为由[M+H-H₂O]⁺母离子丢失一分子-H₂O的碎片离子；m/z179离子，为由[M+H-H₂O]⁺母离子母离子侧链断裂脱烯，丢失一分子-C₂H₄的碎片离子。川芎、当归药材与制剂样品溶液中色谱峰14的正离子检测一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间均完全一致。由保留时间、碎片离子及断裂特征可知，色谱峰14可能为洋川芎内酯H。

色谱峰15的一级质谱显示分子离子峰[M+Na]⁺为213，[M+H]⁺为191。二级质谱显示m/z173离子，为由[M+H]⁺母离子丢失一分子-H₂O的碎片离子；m/z163离子，为由[M+H]⁺母离子母离子侧链断裂脱烯，丢失一分子-C₂H₄的碎片离子。川芎、当归药材溶液与制剂样品溶液中色谱峰15的正离子检测一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间均完全一致。由保留时间、碎片离子及断裂特征可知，该色谱峰15可能为3-丁基苯酞。

色谱峰19的一级质谱显示分子离子峰[M+H₂O+H]⁺为398.1，[M+H]⁺为381，[M/2+H]⁺为191。二级质谱显示m/z381离子，为由[M+H₂O+H]⁺母离子丢失一分子-H₂O的碎片离子；m/z191离子，为由[M+H]⁺母离子母离子侧链断裂脱烯，丢失一分子苯酞的碎片离子。川芎、当归药材溶液与制剂样品溶液中色谱峰19的正离子检测一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间均完全一致。由保留时间、碎片离子及断裂特征可知，该色谱峰19可能为苯酞二聚体。

色谱峰20在203nm紫外光谱中无明显吸收，在负离子模式质谱中有较强信号。在负离子模式中一级质谱显示[M-H]^-为799.6Da，主要碎片峰m/z637.4。以[M-H]^-799.6为母离子的二级质谱显示m/z637.4离子，为由[M-H]^-丢失一个葡萄糖基分子(162Da)的碎片离子。此化合物裂解规律与人参皂苷类化合物裂解规律一致，初步判断色谱峰20为人参皂苷R_f，为进一步证实，将人参皂苷R_f对照品溶液做LC-MS-MS确证。色谱峰20与人参皂苷R_f对照品的一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间完全一致。推断出色谱峰20为人参皂苷R_f。

结合对照品溶液、人参药材溶液、缺味阴性溶液及制剂溶液的紫外光谱初步判断色谱峰9为人参皂苷Rb₁，为进一步证实判断，将人参皂苷Rb₁对照品溶液与制剂样品溶液做LC-MS-MS确证。在负离子模式中一级质谱显示[M-H]^-为1107.7Da，主要碎片峰m/z945[[M-H]-Glu]^-，m/z783[[M-H]-2Glu]^-，m/z621[[M-H]-3Glu]^-，m/z459[[M-H]-4Glu]^-。以[M-H]^-1107.7为母离子的二级质谱，显示m/z945离子，为由[M-H]^-丢失一个葡萄糖基分子(162Da)的碎片离子，m/z783离子为由[M-H]^-丢失两个葡萄糖基分子(162Da)的碎片离子，m/z621离子为由[M-H]^-丢失三个葡萄糖基分子(162Da)的碎片离子，m/z459离子为由[M-H]^-丢失四个葡萄糖基分子(162Da)的碎片离子。色谱峰9与人参皂苷Rb₁对照品的一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间完全一致。可推断出色谱峰9为人参皂苷Rb₁。

结合香附药材溶液、缺味阴性溶液及制剂溶液的紫外光谱初步判断色谱峰12为香附药材特征色谱峰，为进一步证实判断，将香附药材溶液与制剂样品溶液做LC-MS-MS确证。色谱峰12的正离子模式一级质谱显示分子离子峰为m/z401.，m/z319.3。二级质谱显示m/z341.2离子，为由m/z401.2母离子丢失一分子60Da的碎片离子。香附药材溶液与制剂样品溶液中色谱峰12的正离子检测一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间均完全一致。可推断制剂中色谱峰12是归属于香附药材的特征色谱峰。

色谱峰16的一级质谱显示分子离子峰[M+H]⁺为279.3，[M+Na]⁺为301.1。二级质谱显示m/z261.0离子，为由[M+H]⁺母离子丢失一分子-H₂O的碎片离子；m/z205.1离子，为由[M+H]⁺母离子丢失一分子-H₂O(18Da)、两分子-CO(28Da)的碎片离子。丹参药材溶液与制剂样品溶液中色谱峰16的正离子检测一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间均完全一致。结合碎片离子信息、裂解规律及紫外光谱，推断该色谱峰16可能为二氢丹参酮或次甲基丹参醌。

色谱峰17的一级质谱显示分子离子峰[M+H]⁺为297.2，[M+Na]⁺为319.2。二级质谱显示m/z279.4离子，为由[M+H]⁺母离子丢失一分子-H₂O的碎片离子；m/z251.2离子，为由[M+H]⁺母离子丢失一分子-H₂O及一分子-CO的碎片离子。丹参药材溶液与制剂样品溶液中色谱峰17的正离子检测一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间均完全一致。结合碎片离子信息、裂解规律及紫外光谱，推断该色谱峰17可能为隐丹参酮。

结合对照品溶液、丹参药材溶液、缺味阴性溶液及制剂溶液的紫外光谱初步判断色谱峰18为丹参酮IIA。为进一步证实判断，将丹参酮IIA对照品溶液与制剂样品溶液做LC-MS-MS确证。在正离子模式中一级质谱显示[M+H]⁺为295.4Da，主要碎片峰m/z277，m/z249.3。以[M+H]⁺295.4为母离子的二级质谱，显示m/z277离子，为由[M+H]⁺丢失一分子水(18Da)的碎片离子；m/z249.3离子为由[M+H]⁺丢失-H2O(18Da)及-CO(28Da)的碎片离子。色谱峰18与丹参酮IIA对照品的一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间完全一致。可推断出色谱峰18为丹参酮IIA。

色谱峰21在203nm紫外光谱中无明显吸收，而在质谱中有较强的信号。在正离子模式中一级质谱显示[M+H]⁺为269.3。以[M+H]⁺269.3为母离子的二级质谱，显示m/z254离子，为由[M+H]⁺丢失一个-CH₃(15Da)碎片离子。结合各对照品溶液质谱发现，21号色谱峰与芒柄花素对照品的一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间完全一致。推断出色谱峰21为黄芪药材中芒柄花素。

色谱峰22在203nm紫外光谱中无明显吸收，而在质谱中有较强的信号。在负离子模式中一级质谱显示[M+CH₃COO^-]^-为843.5Da。以[M-H]^-843.5为母离子的二级质谱，显示m/z783.5、m/z621.5、m/z489.5离子。m/z783.5为由[M+CH₃COO^-]^-丢失一个-CH₃COO基团及一个-H的碎片离子；m/z621.5为由[M-H]^-丢失一个-Glu(162Da)；m/z489.5为由[M-H-Glu]^-丢失一个鼠李糖(132Da)。此化合物裂解碎片特征与黄芪皂苷类化合物类似，初步判断色谱峰22可能为黄芪甲苷，为进一步证实判断，将黄芪甲苷对照品溶液做LC-MS-MS确证。色谱峰22与黄芪甲肝对照品的一级二级质谱主要裂解碎片、保留时间完全一致。可推断出色谱峰22为黄芪甲苷。

以同仁乌鸡白凤丸为例，其含有19味药材中含5味动物药，14味植物药。其中一些药材如(乌鸡、鹿角、牡蛎、桑螵蛸、芡实等)无紫外吸收；一些药材(如银柴胡、山药、天冬等)因处方中所占比例极小，无明显紫外吸收色谱峰；一些药材(如地黄等)指标性成分具有热不稳定性，而在制剂加工过程中，不可避免地，原料药材要经烘箱干燥、粉碎、加炼蜜等过程，使其在制剂中已无明显特征色谱峰。

通过LC-MS-MS方法可确认制剂指纹图谱9味药材共22个色谱峰的归属。结合文献推断各色谱峰化合物结构。通过其他方法做进一步确证在此暂欠奉。

本发明的突出的实质性特点在于，采用了样品先经过前处理后，再用超高效液相色谱的检测方法，改变了通常对液相色谱中含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎和/或当归药材的样品处理方法，成功地消除了大处方制剂中待测成分以外的液相图谱中的杂峰，结合质谱检测器，还可鉴别处方中同时含有的紫外不能检测的药材例如黄芪和香附，本发明的创新性技术尤其在于成功开发了对含多味中药的中成药制剂进行一次检测，即可对比得到检测结果的技术，并且使检测结果更精确稳定。

附图说明

图1：同仁乌鸡白凤丸(水蜜丸)的UPLC指纹图谱(检测波长203nm)。

图2：同仁乌鸡白凤丸(水蜜丸)的UPLC指纹图谱(检测波长280nm)。

其中，图1和图2标注了共19个峰，该19个峰及其与作基准的17号峰共同组成同仁乌鸡白凤丸(水蜜丸)的UPLC指纹图谱。

具体实施方式

以下结合附图和实施例详细说明本发明，但不限定本发明的实施范围。

实施例一.同仁乌鸡白凤丸(大蜜丸，同仁堂制药)的质量检测方法

仪器与试药：Waters Acquity UPLC^TM超高效液相色谱仪-二极管阵列检测器(PDA)，Waters Empower 2数据处理软件系统。

BüCHI旋转蒸发仪(Rotavapor R-114；Waterbath B-480)；狮鼎SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；KQ-250DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。D-101型大孔树脂(安徽三星树脂科技有限公司)。

甲醇、乙醇均为分析纯试剂；UPLC用乙腈(J.T.Baker公司)为色谱纯。水为纯净水，过Millipore 0.22μm滤膜。

芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rf、丹参酮IIA、黄芪甲苷、芒柄花素对照品，以及白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归对照药材由中国药品生物制品检定所提供。

UPLC色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC^TM BEH C₁₈柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；流动相见下表；流速：0.4mL·min^-1；检测波长：203nm，280nm；柱温：35℃；进样量：2μL。色谱图记录时间为60分钟。

表UPLC流动相梯度

供试品的溶液的制备：取同仁乌鸡白凤丸研细，精密称取6g，加入甲醇50mL，超声处理30分钟(功率300W，频率50kHz)，放冷，滤过，滤液回收溶剂浓缩至干，残渣加水50mL溶解，通过预处理好的D101型大孔树脂吸附柱(内径2cm，长12cm)，以水300mL洗脱，弃水液，再用30％乙醇300mL洗脱，弃洗脱液，继用80％乙醇200mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5mL量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

对照品的溶液的制备：分别取芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rf、丹参酮IIA对照品适量，加甲醇制成对照品溶液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

对照药材溶液的制备：取白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、对照药材适量，照供试品溶液制备方法，制备对照药材溶液。

供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相同保留时间位置上，分别有相应的色谱峰，且紫外光谱相一致。

超高压液相指纹图谱的绘制：同仁乌鸡白凤丸的UPLC指纹图谱(检测波长203nm)见图1；同仁乌鸡白凤丸的UPLC指纹图谱(检测波长280nm)见图2。

其中，图1和图2上标注了标号为1～19的共19个峰，该19个峰共同组成了同仁乌鸡白凤丸(水蜜丸)的UPLC指纹图谱。

实施例二.乌鸡白凤丸(水丸，汇仁制药)中有效成分的检测方法

1.供试品的溶液的制备：精密称取乌鸡白凤丸(水丸6g)，加入相当于供试品约8倍量的甲醇，溶解，优选超声处理20-40分钟，滤过，滤液回收溶剂浓缩至干，残渣加约50mL水使溶解，通过D101型大孔树脂吸附柱(装柱的树脂约60g，内径2cm，长12cm)，以约300mL的水洗脱，弃去水液，再用25-35％wt的50mL的乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用80％wt的200mL乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，过微孔滤膜(优选0.45μm的微孔滤膜)，取续滤液，制成供试品溶液；

2.对照品溶液、对照药材溶液的制备、色谱条件和测定步骤均同实施例一；

3.结果检测：在供试品的色谱中，在与对照药材色谱相同保留时间的位置上，检视是否分别有相应的色谱峰，且紫外光谱相一致。

指纹图谱的绘制：同仁乌鸡白凤丸的UPLC指纹图谱见图1和图2。图1和图2上标注19个峰，其与17号峰的相对保留时间共同组成乌鸡白凤丸(水蜜丸)UPLC指纹图谱，同样可作为乌鸡白凤丸(水丸)的对照用的指纹图谱。

供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相同保留时间位置上，分别有相应的色谱峰，且紫外光谱相一致，则可以判断该供试品(样品)中含有白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归对照成分。

实施例三.其他含有白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪、香附中的两种或两种以上药材成分的中药制剂中有效成分的检测方法

1.供试品溶液的制备：精密称取供试品6g(供试品含白芍、人参、丹参)，加入相当于供试品约8倍量的甲醇，溶解，滤过，滤液回收溶剂浓缩至干，残渣加约50mL水使溶解，通过D101型大孔树脂吸附柱(装柱的树脂约60g)，以约300mL水洗脱，弃去水液，用25-35％wt的50mL乙醇洗脱，弃去洗脱液，用75％wt约200mL乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并移至5mL量瓶中加甲醇至刻度，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，制成供试品溶液；

2.对照品的溶液的制备，以及对照药材溶液的制备：同实施例一；

3.色谱条件和测定参照实施例一；梯度洗脱60min；检测波长203、280nm；

质谱条件：离子源：ESI，离子阱检测器；检测模式：正、负离子检测；毛细管电压：3.5kv；喷雾气：35psi；干燥气(N₂)流速：12.0L·min^-1；干燥气温度：350℃；采用全离子扫描方式，扫描范围：100～1800m/z。

4.结果检测：在供试品的色谱中，在与对照品色谱相同保留时间的位置上，检视是否分别有相应的色谱峰，且紫外光谱相一致。

供试品色谱中，在与对照品色谱相同保留时间位置上，分别有相应的色谱峰，且紫外光谱相一致，则判断该供试品(样品)中含白芍、人参、丹参成分。

若对照药材和对照品溶液增加青蒿、甘草、川芎、当归等对照药材或药材成分，可从图谱看出供试品不含有青蒿、甘草、川芎、当归药材或药材成分。质谱检测判断该供试品中含有黄芪和香附。

实施例四.乌鸡白凤口服液(江西川奇)的有效成分的检测方法

1、仪器与试药：参照实施例一。

2、供试溶液品的制备：取样品20Ml，过预处理的D101型大孔树脂吸附柱(内径2cm，长12cm)，以水300mL洗脱，弃水液，用30％wt乙醇300mL洗脱，弃洗脱液，用80％wt乙醇200mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并移至5mL量瓶，加甲醇至刻度摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

3、对照品溶液的制备：分别取芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rf、丹参酮IIA、黄芪甲苷、芒柄花素对照品适量，加甲醇制成对照品溶液，过0.25μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

4、对照药材溶液的制备参照实施例一。

5、UPLC色谱条件均参照实施例一。

6、结果检测：供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相同保留时间位置上，分别有相应的色谱峰，且紫外光谱相一致，则可以判断该供试品(样品)中含有白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归对照成分；质谱检测判断该供试品中含有黄芪和香附。

实施例五.中成药对照例的结果对比

中成药对照例是在原中成药的配方基础上删除了一个或者几个有效成分得到的成品。本实施例是在乌鸡白凤丸的配方基础上中删除了白芍和人参。

1.仪器与试剂、2.色谱分析条件均参照实施例一。

3.供试品(对照例)溶液的制备、4.对照药材溶液的制备均同实施例一；

5.测定：精密吸取对照品溶液与供试品(对照例)溶液各10ul注入色谱仪；

6.对比图谱：结果可以看出，供试品(对照例)中不含白芍和人参，其他成分例如丹参、青蒿、甘草、川芎和当归则存在于供试品(对照例)中。

结果证明与对照例的实际组成一致。

实施例六.乌鸡白凤胶囊(北京同仁堂)中有效成分的检测方法

1.供试品溶液的制备：精密称取乌鸡白凤胶囊的内容物6g，加入相当于供试品重量约8倍量的甲醇，溶解，优选超声处理20-40分钟，滤过，滤液回收溶剂浓缩至干，残渣加约50mL水使溶解，通过D101型大孔树脂吸附柱(装柱的树脂约60g，柱的内径2cm，长12cm)，以约300mL的水洗脱，弃去水液，再用25-35％wt的50mL的乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用75-85％wt(优选80％wt)的约200mL的乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，并转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即可制成供试品溶液；

2.对照药材溶液的制备、色谱条件、洗脱液和测定方法均同实施例一；梯度洗脱60min；检测波长203nm、290nm；

3.结果检测：在供试品的色谱中，在与对照药材色谱相同保留时间的位置上，检视是否分别有相应的色谱峰，且紫外光谱相一致。

供试品色谱中，在与对照药材色谱相同保留时间位置上，分别有相应的色谱峰，且紫外光谱相一致，则可以判断该供试品(样品)中含有白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归对照药材或者药材成分。

实施例七.乌鸡白凤胶囊(北京同仁堂)中有效成分的检测方法

1.供试品溶液的制备：同实施例六；

2.对照品溶液的制备：分别取芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rf、丹参酮IIA、黄芪甲苷、芒柄花素对照品，加甲醇制成对照品的溶液，该溶液中，芍药苷0.06mg/mL、甘草苷0.02mg/mL、人参皂苷Rb₁0.2mg/mL、丹参酮IIA 0.016mg/mL，人参皂苷Rf0.2mg/mL、黄芪甲苷0.2mg/mL、芒柄花素0.02mg/mL，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，得到对照品的溶液；

3.对照药材溶液的制备：取白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、香附和黄芪对照药材适量，照供试品溶液制备方法，制备对照药材溶液。

4.色谱条件：为超高效液相色谱条件，同实施例一。

质谱条件：离子源：ESI，离子阱检测器；检测模式：正、负离子检测；毛细管电压：3.5kv；喷雾气：35psi；干燥气(N₂)流速：12.0L·min^-1；干燥气温度：350℃；采用全离子扫描方式，扫描范围：100～1800m/z。

5.测定：分别吸取对照品溶液和供试品溶液各2μL，注入超高效液相色谱仪，记录60min色谱图，即得；

6.结果检测：在供试品的色谱中，在与对照品及对照药材色谱相同保留时间的位置上，检视是否分别有相应的色谱峰，且二级质谱图相一致。

供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相同保留时间位置上，分别有相应的色谱峰，且二级质谱图相一致，则可以判断该供试品(样品)中含有白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、香附和黄芪对照药材或药材成分。

Claims (10)

1.一种复方中成药的超高压液相检测方法，该复方中成药含有白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪和香附九种药材或药材成分，该检测方法包括：

(1).供试品溶液的制备，称取供试品，加入相当于供试品5-10倍量的甲醇，溶解，滤过，滤液回收溶剂并浓缩至干，残渣加与上述甲醇等量的水使溶解，放冷，通过大孔树脂吸附柱，以上述甲醇量的2-10倍的水洗脱，弃去水液，再用15-45％wt的与上述甲醇等量的乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用75-95％wt的为上述甲醇量的2-6倍的乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并移至量瓶，加甲醇至刻度，过微孔滤膜，取续滤液，制成供试品的溶液，所述供试品溶液的浓度为每ml相当于供试品0.1-10g；

(2).对照药材溶液的制备，分别取白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪和香附对照药材，按供试品溶液的制备的方法制成对照药材溶液；

(3).超高压液相的色谱条件，以水为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱；

(4).测定，吸取上述供试品和对照药材溶液各2μl，注入超高压液相色谱仪，测定；

(5).结果检测，在供试品的色谱中，在与对照药材的色谱相同保留时间的位置上，检视是否分别有相应的色谱峰。

2.如权利要求1所述的超高压液相检测方法，其中，所述的检测方法还包括增加对照品溶液的制备的步骤；该对照品溶液的制备包括分别取芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rf、丹参酮IIA、黄芪甲苷和芒柄花素对照品，加甲醇，过微孔滤膜，取续滤液，得到对照品溶液；在所述的步骤(4)中增加吸取对照品溶液2μl注入超高压液相色谱仪并测定的步骤；以及，所述步骤(5)为在供试品的色谱中，在与对照品和对照药材的色谱相同保留时间的位置上，检视是否分别有相应的色谱峰。

3.如权利要求1所述的超高压液相检测方法，其中，所述的步骤(2)中对照药材为白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎和当归时，该检测方法采用紫外检测器，检测波长为201-320nm；所述的步骤(2)中对照药材为黄芪和香附时，该检测方法采用质谱检测器。

4.如权利要求2所述的超高压液相检测方法，其中，对照药材为白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归时，对照品为芍药苷、甘草苷、人参皂苷Rb₁、人参皂苷Rf，丹参酮IIA，该检测方法采用紫外检测器，检测波长为201-320nm；对照药材为黄芪和香附时，对照品为黄芪甲苷和芒柄花素，该检测方法采用质谱检测器。

5.如权利要求1所述的超高压液相检测方法，其中，步骤(3)所述的流动相为以水为流动相A，以乙腈为流动相B，按照由100％wt的A依次减少A的量增加B的量直至100％wt的B的次序进行梯度洗脱。

6.如权利要求1所述的超高压液相检测方法，其中，该检测方法中所采用的微孔滤膜为孔径小于0.45μm的微孔滤膜。

7.如权利要求2所述的超高压液相检测方法，其为含白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪和香附的复方中成药的超高压液相检测方法，其包括制备对照品溶液，为用甲醇制成每1mL分别含芍药苷0.06mg/mL、甘草苷0.02mg/mL、人参皂苷Rb₁0.2mg/mL、丹参酮IIA 0.016mg/mL、黄芪甲苷Rb₁0.2mg/mL、芒柄花素0.02mg/mL的溶液作为对照品溶液；按照所述的供试品溶液的制备方法制备白芍、人参、丹参、青蒿、甘草、川芎、当归、黄芪和香附的对照药材溶液，将对照品溶液和对照药材溶液进行所述步骤(3)和(4)的检测，得到对照品和对照药材的指纹图谱，然后在所述步骤(5)中，在供试品的色谱中，在与对照药材和对照品色谱相同保留时间的位置上，检视是否分别有相应的色谱峰。

8.如权利要求7所述的超高压液相检测方法，其中，所述的超高压液相色谱仪是以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱的填充剂；以水为流动相A，以乙腈为流动相B。

9.如权利要求8所述的超高压液相检测方法，其中，该检测方法采用紫外检测器和/或质谱检测器；所述的紫外检测器的检测波长在201-205nm下检测白芍、人参、甘草、青蒿，检测波长在255-290nm检测丹参、川芎、当归。

10.如权利要求1-9任一项所述的超高压液相检测方法，其中，所检测的复方中成药包括乌鸡白凤丸和/或含有乌鸡白凤丸的中药组方的中药制剂；所述的含有乌鸡白凤丸的中药组方的中药制剂包括乌鸡白凤丸的水蜜丸、乌鸡白凤丸的水丸、乌鸡白凤胶囊和/或乌鸡白凤口服液。

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