CN115452971A - 一种基于uplc-q-tof-ms技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于UPLC‑Q‑TOF‑MS技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定，属于药物分析领域，采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用技术(UPLC‑Q‑TOF‑MS)对圣愈汤基准样品中的化学成分进行表征，可以对圣愈汤中的成分进行更全面的有效分析鉴定，能够快速分析及准确鉴定出多个化合物，且灵敏度高，分离度好。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药化学成分的分析方法，尤其是一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定，属于药物分析领域。
背景技术
圣愈汤是一种中药，主治诸恶疮血出过多、心烦不安、不得睡眠等，用法为水煎服。圣愈汤出自金代李东垣《兰室密藏》，被收录于《古代经典名方目录(第一批)》中。方中人参、黄芪补气，生地黄、熟地黄、当归身、川芎补血活血，全方补行结合，补而不滞，行而不伤，配伍成方，共奏补气养血之效。圣愈汤为国家中医药管理局发布的第一批中药经典名方，是未来经典名方研究的重点方剂之一，经典名方研究指导原则规定经典名方的现代开发是遵古创新的研究思路，在不改变原方组成的情况下进行现代标准煎液和制剂的研究。
随着中药及复方制剂的质量控制技术的提升，指标成分的含量测定已不能体现中药及复方制剂的质量优劣。特征图谱/指纹图谱是现代分析技术中展现中药及复方制剂的整体质量的有效方法，2020版《中国药典》部分中药品种也增加了特征图谱的检测。
现有技术中有公开对圣愈汤中部分有效成分的含量进行检测分析，如专利CN114487137A中公开了一种圣愈汤标准煎液的特征图谱、特征图谱构建方法和鉴别方法，可以有效鉴定出圣愈汤中含有中药材生地黄、熟地黄、川芎、当归、黄芪。但是圣愈汤中还含有很多未知且复杂的成分尚未公开，不为公众所知。因此，目前公开的圣愈汤检测方法不能够全面地对圣愈汤的化学成分进行有效的分析及鉴定。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定，可以对圣愈汤中的化学成分进行全面的有效分析及鉴定，该方法能够快速分析及准确鉴定出多个复杂化合物，灵敏度高，分离度好。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定，采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)对圣愈汤基准样品中的化学成分进行表征。
进一步地，包括以下UPLC色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLCTM HSS T3色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm)，流动相A为0.1％甲酸乙腈，流动相B为0.1％甲酸水，柱温为40℃，进样室温度为4℃，进样量为2μl，流速为0.4ml/min，梯度洗脱。
进一步地，梯度洗脱程序为0-5min，1％-10％A；5-11min，10％-28％A；11-18min，28％-48％A；18-20min，48％-70％A；20-22min，70％-100％A；22-24min，100％-100％A；24-24.5min，100％-1％A；24.5-27min，1％-1％A。
进一步地，包括以下Q-TOF-MS质谱条件：电喷雾电离源(ESI)，正、负离子检测模式(ESI+、ESI-)，扫描模式为全扫描；MS参数：质量范围m/z50-1500Da，扫描时间0.2s，雾化气和锥孔气为氮气，毛细管电压2.8kv，锥孔采样电压40v，锥孔气流量50L/h，离子源温度110℃，碰撞能15-45eV，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气流量800L/h；准确质量校正采用亮氨酸脑啡肽([M+H]+556.2771，[M-H]-554.2615)溶液，质量浓度为1μg/L，流速5μL/min，校正频率为5s。
进一步地，包括以下步骤：
S1.圣愈汤基准样品的制备：取圣愈汤各组分物质，加水，浸泡，煎煮，滤过；待滤液冷却后将其转至冻干瓶中，冷冻干燥，得圣愈汤基准样品；
S2.供试品溶液的制备：取圣愈汤基准样品，置于瓶中，加入甲醇溶解，超声处理，然后进行离心处理，取上清液，即得供试品溶液；
S3.对照品溶液的制备：精密称取梓醇、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、异阿魏酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、黄芪甲苷、藁本内酯、川芎嗪、汉黄芩素、地黄苷D、刺芒柄花素、各对照品0.2g，加甲醇使溶解并定容10ml，摇匀，得浓度均为20μg/ml的混合对照品溶液；
S4.将供试品溶液和对照品溶液分别采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)进行检测，得到供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图；
S5.收集有关圣愈汤各单味药的化学成分信息，建立全方化学成分信息库，将信息库的数据集导入UNIFI 1.8软件中，与所采集的质谱数据进行自动匹配，选择误差在±5ppm以内的化合物；
S6.通过对照品色谱图比对、裂解规律分析并结合相关文献报道，进一步对化合物结构进行鉴定。
进一步地，步骤S1中，圣愈汤基准样品的制备具体操作为：取当归、黄芪各6.0g，生地黄、熟地黄、人参、川芎各3.6g，加水1200mL，浸泡60min，武火加热至沸腾后，转为文火保持微沸，35min后煎煮至600mL，药液趁热用120目尼龙滤布滤过，待滤液冷却后将其转至冻干瓶中，置于冷冻干燥机内预冻再冷冻干燥，冷冻干燥结束得圣愈汤基准样品。
进一步地，预冻的温度为-80℃，时间为12h；冷冻干燥的温度为-45℃，压力为29Pa，时间为24h。
进一步地，步骤S2中，供试品溶液的制备具体操作为：取圣愈汤基准样品0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入50％甲醇10mL溶解，密塞，称定重量，超声处理后放冷至室温，称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，转移至离心管中，然后进行离心处理，然后静置，取上清液，即得供试品溶液。
进一步地，步骤S2中，超声处理的功率为250W，频率为50kHz，超声时间为60min；离心时间为10min。
进一步地，在圣愈汤中共鉴定出147个化合物，其中黄酮类14个，苯丙素类22个，有机酸类15个，核苷类8个，糖类6个，氨基酸类5个，内酯类18个，萜类11个，生物碱类4个，皂苷类27个，其他类17个。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
本发明的方法可以对圣愈汤中的化学成分进行全面的有效分析及鉴定，能够快速分析及准确鉴定出多种化合物，灵敏度高，分离度好。
其中，本发明采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)进行测定分析，能够检测出圣愈汤中更多的化合物的色谱图，用时短，灵敏度高，基线分离，分离度好；若采用高效液相色谱法或其他方法进行测定分析，只能检测出圣愈汤中小部分的化合物，灵敏度低，且部分基线未分离，分离度差。
本发明通过限定UPLC色谱条件中的梯度洗脱程序，更好的将圣愈汤中存在的化合物分离，使其能检测出更多的化合物，获得相应化合物的色谱图，基线分离，分离度好；若采用其他色谱条件的梯度洗脱程序，不能够很好的分离圣愈汤中的化合物，检测得出的化合物色谱图，部分基线未分离，分离度差。本发明还通过限定UPLC色谱条件中的流动相A和流动相B浓度，使圣愈汤中化合物充分溶解，从而检测得出化合物色谱图，基线分离，分离度好；若降低或提高流动相A和流动相B浓度中的一种或两种，会降低对圣愈汤中某些化合物的溶解，使检测得出的化合物色谱图，部分基线未分离，分离度差。
最后，本发明通过限定Q-TOF-MS质谱条件，在MS参数条件下，采集正、负离子模式下圣愈汤基准样品的一级、二级质谱数据，结合对照品的检测数据及相关文献报道，对圣愈汤基准样品的化学成分进行分析，能够准确鉴定化合物的结构；若采用其他质谱条件，采集得到的圣愈汤基准样品质谱数据不同，进行化学成分分析时，会得到错误或存在偏差的化合物结构。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明圣愈汤基准样品在不同离子模式下的UPLC-Q-TOF-MS色谱图及鉴定的成分峰；
图2是本发明混合标准品在不同离子模式下的UPLC-Q-TOF-MS色谱图及鉴定的成分峰；
图3是本发明橙皮苷可能的裂解途径；
图4是本发明连翘酯苷A可能的裂解途径；
图5是本发明柠檬酸可能的裂解途径；
图6是本发明鸟苷可能的裂解途径；
图7是本发明棉子糖可能的裂解途径；
图8是本发明洋川芎内酯A可能的裂解途径；
图9是本发明竹节人参皂苷IVa可能的裂解途径；
图10是本发明单密力特苷可能的裂解途径。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：
一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定，包括：采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)对圣愈汤基准样品中的化学成分进行表征。
检测条件如下：
UPLC色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLCTM HSS T3色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm)，流动相A为0.1％甲酸乙腈，流动相B为0.1％甲酸水，柱温为40℃，进样室温度为4℃，进样量为2μl，流速为0.4ml/min，梯度洗脱。梯度洗脱程序为0-5min，1％-10％A；5-11min，10％-28％A；11-18min，28％-48％A；18-20min，48％-70％A；20-22min，70％-100％A；22-24min，100％-100％A；24-24.5min，100％-1％A；24.5-27min，1％-1％A。
Q-TOF-MS质谱条件：电喷雾电离源(ESI)，正、负离子检测模式(ESI+、ESI-)，扫描模式为全扫描；MS参数：质量范围m/z 50-1500Da，扫描时间0.2s，雾化气和锥孔气为氮气，毛细管电压2.8kv，锥孔采样电压40v，锥孔气流量50L/h，离子源温度110℃，碰撞能15-45eV，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气流量800L/h；准确质量校正采用亮氨酸脑啡肽([M+H]+556.2771，[M-H]-554.2615)溶液，质量浓度为1μg/L，流速5μL/min，校正频率为5s。
操作步骤如下：
S1.圣愈汤基准样品的制备：取圣愈汤各组分物质，加水，浸泡，煎煮，滤过；待滤液冷却后将其转至冻干瓶中，冷冻干燥，得棕褐色蜂窝鳞片状粉末，即为圣愈汤基准样品；
S2.供试品溶液的制备：取圣愈汤基准样品，置于瓶中，加入甲醇溶解，超声处理，然后进行离心处理，取上清液，即得供试品溶液；
S3.对照品溶液的制备：精密称取梓醇、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、异阿魏酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、黄芪甲苷、藁本内酯、川芎嗪、汉黄芩素、地黄苷D、刺芒柄花素，各对照品0.2g，加甲醇使溶解并定容10ml，摇匀，得浓度均为20μg/ml的混合对照品溶液；
S4.将供试品溶液和对照品溶液分别采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)进行检测，得到供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图；
S5.收集中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、PubChem中有关圣愈汤各单味药的化学成分信息，同时参考文献，通过Progenesis QI 2.0软件中Progenesis SDFStudio建立全方化学成分信息库，将信息库的数据集导入UNIFI 1.8软件中，与所采集的质谱数据进行自动匹配，选择误差在±5ppm以内的化合物；
S6.通过对照品色谱图比对、裂解规律分析并结合相关文献报道，进一步对化合物结构进行鉴定。
实施例1
本实施例1的具体试验过程如下：
1、材料与方法
1.1试验药物
熟地黄(产地山西襄汾，批号17102315)、生地黄(产地山西襄汾，批号17102615)、人参(产地吉林靖宇，批号1709275)、当归身(产地甘肃岷县，批号17112015)、黄芪(产地甘肃定西，批号17110115)、川芎(产地四川彭州、批号17092715)质量均均由神威药业集团有限公司提供，经黑龙江中医药大学中药鉴定教研室鉴定为正品。梓醇、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、异阿魏酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、黄芪甲苷、藁本内酯、川芎嗪、汉黄芩素(批号分别为：110808-201711、110885-201703、110773-201613、110753-201817、111920-201606、111698-201103、110703-201832、110754-201827、110704-201827、110781-201717、111737-201910、110817-201608、111514-201706)对照品购自中国食品药品检定研究院，地黄苷D(批号CAS#81720-08-5)对照品购自成都瑞芬思生物科技有限公司，刺芒柄花素(批号201805)对照品购自四川维克奇生物科技有限公司。
1.2试验试剂
乙腈、甲醇为质谱纯，甲酸为色谱纯，水为屈臣氏蒸馏水，其他试剂为分析纯。
1.3试验仪器
WATERS ACQUITYTM超高效液相色谱仪，WATERS SYNAPT G2Si Q/TOF质谱仪(美国Waters公司)；WATERS ACQUITY UPLCTM HSS T3色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm)；BTP-3ES00X型冷冻干燥机(美国SP Scientific公司)；低温超高速离心机(美国Thermo Fisher)；PB1501-N分析天平(上海梅特勒·托利多仪器有限公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1.4试验方法
采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)对圣愈汤基准样品中的化学成分进行表征。
检测条件如下：
UPLC色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLCTM HSS T3色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm)，流动相A为0.1％甲酸乙腈，流动相B为0.1％甲酸水，柱温为40℃，进样室温度为4℃，进样量为2μl，流速为0.4ml/min，梯度洗脱。梯度洗脱程序为0-5min，1％-10％A；5-11min，10％-28％A；11-18min，28％-48％A；18-20min，48％-70％A；20-22min，70％-100％A；22-24min，100％-100％A；24-24.5min，100％-1％A；24.5-27min，1％-1％A。
Q-TOF-MS质谱条件：电喷雾电离源(ESI)，正、负离子检测模式(ESI+、ESI-)，扫描模式为全扫描；MS参数：质量范围m/z 50-1500Da，扫描时间0.2s，雾化气和锥孔气为氮气，毛细管电压2.8kv，锥孔采样电压40v，锥孔气流量50L/h，离子源温度110℃，碰撞能15-45eV，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气流量800L/h；准确质量校正采用亮氨酸脑啡肽([M+H]+556.2771，[M-H]-554.2615)溶液，质量浓度为1μg/L，流速5μL/min，校正频率为5s。
具体操作步骤如下：
S1.圣愈汤基准样品的制备：取圣愈汤现代日剂量：当归、黄芪各6.0g，生地黄、熟地黄、人参、川芎各3.6g。加水1200mL，浸泡60min，武火加热至沸腾后，转为文火保持微沸，35min后煎煮至600mL，药液趁热用120目尼龙滤布滤过。待滤液冷却后将其转至冻干瓶中，置于冷冻干燥机内，预冻：温度-80℃，时间12h；冷冻干燥：温度-45℃，压力29Pa，时间24h；冷冻干燥结束得棕褐色蜂窝鳞片状粉末，即为圣愈汤基准样品。
S2.供试品溶液的制备：取圣愈汤基准样品0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入50％甲醇10mL溶解，密塞，称定重量，超声处理：功率250W，频率50kHz，超声时间60min，放冷至室温，称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，转移至离心管中，然后进行离心处理：离心时间10min，离心结束静置，取上清液，即得供试品溶液。
S3.对照品溶液的制备：精密称取梓醇、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、异阿魏酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、黄芪甲苷、藁本内酯、川芎嗪、汉黄芩素、地黄苷D、刺芒柄花素，各对照品0.2g，加甲醇使溶解并定容10ml，摇匀，得浓度均为20μg/ml的混合对照品溶液。
S4.将供试品溶液和对照品溶液分别采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)进行检测，得到供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图。
S5.收集中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、PubChem中有关圣愈汤各单味药的化学成分信息，同时参考文献，通过Progenesis QI 2.0软件中Progenesis SDFStudio建立全方化学成分信息库。将信息库数据集导入UNIFI 1.8软件中，与所采集的质谱数据进行自动匹配，选择误差在±5ppm以内的化合物。
S6.通过对照品色谱图比对、裂解规律分析并结合相关文献报道，进一步对化合物结构进行鉴定。
2、试验结果
2.1圣愈汤化学成分分析与鉴定
供试品溶液、对照品溶液进样分析，所得基峰离子(BPI)色谱图见图1、图2。按照S5、S6项下的处理方法，在圣愈汤中共鉴定出147个化合物，其中黄酮类14个，苯丙素类22个，有机酸类15个，核苷类8个，糖类6个，氨基酸类5个，内酯类18个，萜类11个，生物碱类4个，皂苷类27个，其他类17个。化合物信息详见表1。
表1圣愈汤基准样品中化学成分的UPLC-Q-TOF-MS鉴定
注：*与标准品比对后确认；a.地黄；b.熟地黄；c.人参；d.黄芪；e.当归；f.川芎；A.黄酮类；B.苯丙素类；C.有机酸类；D.核苷类；E.糖类；F.氨基酸类；G.内酯类；H.萜类；I.生物碱类；J.皂苷类；K.其他类。
2.2化合物的裂解规律分析
(1)黄酮类
共表征出14个黄酮类化合物，主要来源于黄芪。这类化合物的质谱裂解方式主要包括脱糖基、RDA裂解和CO2、H2O等中性丢失，根据文献报道(见：崔琳琳，包永睿，王帅，等.UPLC-Q-TOF-MS/MS快速鉴定补肺健脾方的化学成分[J].中国实验方剂学杂志，2020，26(09):184-193；Li T,He Y,Zhang M,et al.High throughput metabolomics exploresthe mechanism of Jigucao capsules in treating Yanghuang syndrome rats usingultra-performance liquid chromatography quadrupole time of flight coupledwith mass spectrometry.[J]Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2022Apr1；1194:123185.)。以化合物66为例，保留时间为9.74min，在负离子模式下，其准分子离子峰为M/Z 609.1826[M-H]-，借助MassLynx4.1工作站中的Elemental Composition功能，推测可能的分子式为C23H26O10。二级质谱显示母离子脱去芸香糖得M/Z301.0606[M-H-C12H20O9]-，进一步脱去B环得M/Z 179.0347[M-H-C12H20O9-C7H6O2]-，此外M/Z 301.0606[M-H-C12H20O9]-脱去CO2得M/Z 257.1005[M-H-C12H20O9-CO2]-，通过RDA裂解得M/Z 151.0398[M-H-C12H20O9-C9H10O2]-。根据其碎片信息及文献报道(见：李东红，胥芷灵，徐翠珊，等.复方麝香黄芪滴丸的体外及体内血清化学成分分析[J/OL].中国医院药学杂志，2022(06):582-589.)，推测该化合物为橙皮苷。橙皮苷可能的裂解途径见图3。
(2)苯丙素类
共表征出22个苯丙素类化合物，主要来源于当归和川芎。这类化合物易发生酯键断裂，随后又产生H2O、CO2等中性丢失，根据文献报道(见：叶馨源，吴建明，杨杰，等.白背三七化学成分及代表性成分质谱裂解特征的研究进展[J].中草药，2021，52(21):6687-6700.)。以化合物63为例，保留时间为9.47min，在负离子模式下，其准分子离子峰为M/Z623.1998[M-H]-，借助MassLynx 4.1工作站中的Elemental Composition功能，推测可能的分子式为C29H36O15。二级质谱显示母离子先脱去C20H28O11得M/Z 179.0349[M-H-C20H28O11]-，下一步分别脱去H2O和C2H2O2得M/Z 161.0244[M-H-C20H28O11-H2O]-和M/Z 135.0419[M-H-C20H28O11-C2H2O2]-。根据其碎片信息及文献报道(见：樊晓荃，付娟，胡军华，等.UPLC-Q-TOF-MS/MS快速分析六味地黄苷糖片化学成分[J].中草药，2021，52(21):6473-6484.)，推测该化合物为连翘酯苷A。连翘酯苷A可能的裂解途径见图4。
(3)有机酸类
共表征出15个有机酸类化合物。这类化合物易在羰基断裂处形成碎片离子，根据文献报道(见：崔琳琳，包永睿，王帅，等.UPLC-Q-TOF-MS/MS快速鉴定补肺健脾方的化学成分[J].中国实验方剂学杂志，2020，26(09):184-193.)。以化合物7为例，保留时间为1.22min，在负离子模式下，其准分子离子峰为M/Z 191.0201[M-H]-，借助MassLynx 4.1工作站中的Elemental Composition功能，推测可能的分子式为C6H8O7。二级质谱显示母离子脱去1分子H2O得M/Z 173.0090[M-H-H2O]-，下一步脱去CH2O3得M/Z 111.0101[M-H-H2O-CH2O3]-，准分子离子峰还可以通过脱去CH2O3得到M/Z 129.0201[M-H-CH2O3]-。根据其碎片信息及文献报道(见：杨福燕，许如玲，钮炜，等.经典名方一贯煎标准煎液UPLC-Q-TOF-MS化学成分分析[J].中国中药杂志，2022，47(08):2134-2147.)，推测该化合物为柠檬酸。柠檬酸可能的裂解途径见图5。
(4)核苷类
共表征出8个核苷类化合物。这类化合物的N-糖苷键易发生断裂，脱去脱氧核糖或核糖，根据文献报道(见：叶馨源，吴建明，杨杰，等.白背三七化学成分及代表性成分质谱裂解特征的研究进展[J].中草药，2021，52(21):6687-6700.)。以化合物16为例，保留时间为2.39min，在负离子模式下，其准分子离子峰为M/Z 282.0850[M-H]-，借助MassLynx4.1工作站中的Elemental Composition功能，推测可能的分子式为C10H13N5O5。二级质谱显示母离子脱去核糖得到M/Z 150.0431[M-H-C5H8O4]-，N-糖苷键裂解后继续脱去NH3得到M/Z 135.0317[M-H-C5H8O4-NH]-。根据其碎片信息及文献报道(见：杨福燕，许如玲，钮炜，等.经典名方一贯煎标准煎液UPLC-Q-TOF-MS化学成分分析[J].中国中药杂志，2022，47(08):2134-2147.)，推测该化合物为鸟苷。鸟苷可能的裂解途径见图6。
(5)糖类
共表征出6个糖类化合物。这类化合物O-糖苷键容易断裂，形成单糖的碎片离子，另外还有脱H20、开环的质谱行为，根据文献报道(见：张烨，邓琦，魏敏，等.基于UPLC-Q-OrbitrapHRMS技术的明日叶化学成分鉴定[J].亚太传统医药，2022，18(02):40-49.)。以化合物6为例，保留时间为1.10min，在负离子模式下，其准分子离子峰为M/Z 503.1663[M-H]-，借助MassLynx 4.1工作站中的Elemental Composition功能，推测可能的分子式为C18H32O16。二级质谱显示母离子先脱去一分子葡萄糖(Glu)得M/Z 341.1087[M-H-Glu]-，下一步脱去一分子果糖(Fru)得M/Z 179.0569[M-H-Glu-Fru]-，再下一步开环得到M/Z89.0258[M-H-Glu-Fru--C3H6O3]-。根据其碎片信息及文献报道(见：丁腾，孙宇宏，杜霞，等.经典名方百合地黄汤的化学成分与网络药理学研究[J].中草药，2019，50(08):1848-1856.)，推测该化合物为棉子糖。棉子糖可能的裂解途径见图7。
(6)内酯类
共表征出18个内酯类化合物，主要来源于川芎。这类化合物的质谱行为表现为内酯环开环及CO2、CO等碎片的丢失，根据文献报道(见：张聪，刘建勋，孙明谦等.3种银杏内酯成分的质谱裂解途径研究[J].中国中药杂志，2018，43(20):4093-4096.)。以化合物126为例，保留时间为18.00min，在正离子模式下，其准分子离子峰为M/Z 193.1229[M+H]+，借助MassLynx 4.1工作站中的Elemental Composition功能，推测可能的分子式为C12H16O2。二级质谱显示母离子分别脱去C4H8得到M/Z 137.0600[M+H-C4H8]+，接着脱去一分子CO得到M/Z109.0654[M+H-C4H8-CO]+。根据其碎片信息及文献报道(见：刘佳星，魏洁，武锦春，等.基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术的酸枣仁汤颗粒化学成分分析[J].中国实验方剂学杂志，2021，27(12):1-12.)，推测该化合物为洋川芎内酯A。洋川芎内酯A可能的裂解途径见图8。
(7)皂苷类
共表征出27个皂苷类化合物，主要来源于人参。这类化合物在质谱裂解过程中主要发生糖苷键断裂，而母核较为稳定，一般不会断裂，根据文献报道(见：Li T,He Y,ZhangM,et al.High throughput metabolomics explores the mechanism of Jigucaocapsules in treating Yanghuang syndrome rats using ultra-performance liquidchromatography quadrupole time of flight coupled with mass spectrometry.[J]Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2022Apr1；1194:123185.)。以化合物128为例，保留时间为18.79min，在负离子模式下，其准分子离子峰为M/Z 793.4388[M-H]-，借助MassLynx 4.1工作站中的Elemental Composition功能，推测可能的分子式为C42H66O14。二级质谱显示母离子脱去C6H8O6得到M/Z 617.2712[M-H-C42H66O14]-，下一步脱去一分子Glu得M/Z 455.1431[M-H-C42H66O14-Glu]-，接着再依次脱去一分子H20和一分子CO2得到M/Z 427.1780[M-H-C42H66O14-Glu-H20]-和M/Z 383.1437[M-H-C42H66O14-Glu-H20-CO2]-。根据其碎片信息及文献报道(见：刘佳星，魏洁，武锦春，等.基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术的酸枣仁汤颗粒化学成分分析[J].中国实验方剂学杂志，2021，27(12):1-12.)，推测该化合物为竹节人参皂苷IVa。竹节人参皂苷Iva可能的裂解途径见图9。
(8)萜类
共表征出11个萜类化合物，主要来源于地黄和熟地黄。这类化合物的糖苷键非常容易断裂，同时也容易发生环裂解及麦氏重排，根据文献报道(见：梁红宝，姜宇，袁晓梅，等峰.基于GC-MS和UPLC-Q-Exactive MS技术的荆防颗粒化学成分研究[J].中草药，2022，53(06):1697-1708.)。以化合物19为例，保留时间为3.09min，在负离子模式下，其准分子离子峰为M/Z361.1152[M-H]-，借助MassLynx 4.1工作站中的Elemental Composition功能，推测可能的分子式为C15H22O10。二级质谱显示母离子脱去一分子Glu得到M/Z199.0646[M-H-Glu]-，下一步脱去C5H6O3得到M/Z 85.0293[M-H-Glu-C5H6O3]-，或脱去-C5O2H6得到M/Z101.0211M-H-Glu-C5H6O2]-。根据其碎片信息及文献报道(见：赵媛媛，任一冉，刘兆薇，等.基于UHPLC-LTQ-Orbitrap MS-n的苦碟子醇提物不同洗脱部位化学成分分析[J].中南药学，2022，20(03):482-493.)，推测该化合物为单蜜力特苷。单蜜力特苷可能的裂解途径见图10。
综上可知，本实施例证实采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)进行检测圣愈汤中的成分，其中通过限定UPLC色谱条件和Q-TOF-MS质谱条件结合，能够清晰得到很多个化合物的色谱图，即每个化合物的具体出峰保留时间和峰型，根据每个化合物的色谱图结合信息库数据集和多个分析软件的应用，可以对圣愈汤中的化学成分进行全面的有效分析及鉴定，即能够快速分析及准确鉴定出多个化合物，检测方法灵敏度高，分离度好。
以上所述实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例技术方案的精神和范围，均属于本申请的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定，其特征在于：采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)对圣愈汤基准样品中的化学成分进行表征。
2.根据权利要求1所述的一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定，其特征在于，包括以下UPLC色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLCTM HSS T3色谱柱(2.1mm×100mm,1.8μm)，流动相A为0.1％甲酸乙腈，流动相B为0.1％甲酸水，柱温为40℃，进样室温度为4℃，进样量为2μl，流速为0.4ml/min，梯度洗脱。
3.根据权利要求2所述的一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定，其特征在于：梯度洗脱程序为0-5min，1％-10％A；5-11min，10％-28％A；11-18min，28％-48％A；18-20min，48％-70％A；20-22min，70％-100％A；22-24min，100％-100％A；24-24.5min，100％-1％A；24.5-27min，1％-1％A。
4.根据权利要求1所述的一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定，其特征在于，包括以下Q-TOF-MS质谱条件：电喷雾电离源(ESI)，正、负离子检测模式(ESI+、ESI-)，扫描模式为全扫描；MS参数：质量范围m/z 50-1500Da，扫描时间0.2s，雾化气和锥孔气为氮气，毛细管电压2.8kv，锥孔采样电压40v，锥孔气流量50L/h，离子源温度110℃，碰撞能15-45eV，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气流量800L/h；准确质量校正采用亮氨酸脑啡肽([M+H]+556.2771，[M-H]-554.2615)溶液，质量浓度为1μg/L，流速5μL/min，校正频率为5s。
5.根据权利要求1所述的一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定，其特征在于，包括以下步骤：
S1.圣愈汤基准样品的制备：取圣愈汤各组分物质，加水，浸泡，煎煮，滤过；待滤液冷却后将其转至冻干瓶中，冷冻干燥，得圣愈汤基准样品；
S2.供试品溶液的制备：取圣愈汤基准样品，置于瓶中，加入甲醇溶解，超声处理，然后进行离心处理，取上清液，即得供试品溶液；
S3.对照品溶液的制备：精密称取梓醇、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、异阿魏酸、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、黄芪甲苷、藁本内酯、川芎嗪、汉黄芩素、地黄苷D、刺芒柄花素各对照品0.2g，加甲醇使溶解并定容10ml，摇匀，得浓度均为20μg/ml的混合对照品溶液；
S4.将供试品溶液和对照品溶液分别采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)进行检测，得到供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图；
S5.收集有关圣愈汤各单味药的化学成分信息，建立全方化学成分信息库，将信息库的数据集导入UNIFI 1.8软件中，与所采集的质谱数据进行自动匹配，选择误差在±5ppm以内的化合物；
S6.通过对照品色谱图比对、裂解规律分析并结合相关文献报道，进一步对化合物结构进行鉴定。
6.根据权利要求5所述的一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定，其特征在于，步骤S1中，圣愈汤基准样品的制备具体操作为：取当归、黄芪各6.0g，取生地黄、熟地黄、人参、川芎各3.6g，加水1200mL，浸泡60min，武火加热至沸腾后，转为文火保持微沸，35min后煎煮至600mL，药液趁热用120目尼龙滤布滤过，待滤液冷却后将其转至冻干瓶中，置于冷冻干燥机内预冻再冷冻干燥，冷冻干燥结束得圣愈汤基准样品。
7.根据权利要求6所述的一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定，其特征在于，预冻的温度为-80℃，时间为12h；冷冻干燥的温度为-45℃，压力为29Pa，时间为24h。
8.根据权利要求5所述的一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定，其特征在于，步骤S2中，供试品溶液的制备具体操作为：取圣愈汤基准样品0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入50％甲醇10mL溶解，密塞，称定重量，超声处理后放冷至室温，称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，转移至离心管中，然后进行离心处理，然后静置，取上清液，即得供试品溶液。
9.根据权利要求8所述的一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定，其特征在于，步骤S2中，超声处理的功率为250W，频率为50kHz，超声时间为60min；离心时间为10min。
10.根据权利要求1所述的一种基于UPLC-Q-TOF-MS技术的圣愈汤化学成分分析方法及鉴定，其特征在于：在圣愈汤中共鉴定出147个化合物，其中黄酮类14个，苯丙素类22个，有机酸类15个，核苷类8个，糖类6个，氨基酸类5个，内酯类18个，萜类11个，生物碱类4个，皂苷类27个，其他类17个。
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