CN110887927A - 一种黄芪桂枝五物汤全成分的分析方法 - Google Patents

一种黄芪桂枝五物汤全成分的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种黄芪桂枝五物汤全成分的分析方法，属于药物分析技术领域。本发明采用超快速高效液相色谱三重四级杆飞行时间串联质谱联用(HPLC‑Q‑TOF‑MS/MS)技术对黄芪桂枝五物汤样品进行检测，同时采用药典标识性的5种化学成分——黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、葡萄糖苷、桂皮醛、芍药苷、6‑姜辣素对黄芪桂枝五物汤检测结果进行确认，明确识别了31种成分，实现了对黄芪桂枝五物汤复方成分的全面分析，提高了其质量控制的可靠性。

Description

一种黄芪桂枝五物汤全成分的分析方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种黄芪桂枝五物汤全成分的分析方法。
背景技术
黄芪桂枝五物汤于汉代张仲景《金匮要略》首次记载，由黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣5味中药组成，具有益气温经，和营通痹之效，为治疗血痹虚劳症的名方，现代临床常用于治疗糖尿病神经性病变、中风后遗症、血栓闭塞性脉管炎和颈椎病等疾病。现有的关于黄芪桂枝五物汤的成分研究，包括运用HPLC-ELSD(高效液相色谱-蒸发光散射法)、LC-MS(液相色谱-质谱联用法)、UFLC(超快速液相色谱法)法对黄芪甲苷、毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芍药内酯苷和桂皮酸这些主要成分进行含量测定，以达到综合评价黄芪桂枝五物汤的质量的目的；并且使用HPLC方法[4]建立黄芪桂枝五物汤中药指纹图谱，试图为黄芪桂枝五物汤的质量控制提供依据。
但目前对黄芪桂枝五物汤的成分研究存在一定的局限和不足：(1)含量检测方法主要集中在组方单味药材以及代表性成分的含量测定研究；(2)现有的关于黄芪桂枝五物汤成分检测的方法灵敏度低，无法检测到含量低的成分，如关于黄芪桂枝五物汤中药指纹图谱研究，采用HPLC方法也只是筛选出了黄芪桂枝五物汤13个共有峰(魏国利,曹鹏,霍介格,等.黄芪桂枝五物汤HPLC指纹图谱研究[J].中华中医药学刊,2013(12):2796-2798.)。但中药复方的药效物质组成复杂，其影响不是单个成分的累积效应，而是包含各成分之间的相互作用，单一成分的含量不能全面地反映复方的质量；同时现有的关于黄芪桂枝五物汤成分检测的方法无法检测到含量低的成分，无法反应复方的整体情况。因此，需要采用多技术方法结合多指标成分测定进行全面的质量控制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的上述缺陷，提供一种黄芪桂枝五物汤全成分的分析方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：本发明提供了一种黄芪桂枝五物汤全成分的分析方法，其采用HPLC-Q-TOF-MS/MS法(超快速高效液相色谱三重四级杆飞行时间串联质谱联用方法)，对黄芪桂枝五物汤样品进行检测；其中，所述高效液相色谱的条件为：色谱柱为C18柱，柱长100-250mm，柱内径3.0-4.6mm，粒径1.5-5.0μm；流动相流速0.2-1mL/min；进样量5-20μL；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为含0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，采用如表1所示的梯度洗脱程序：
表1流动相梯度洗脱程序
Figure BDA0002325634430000021
所述三重四级杆飞行时间串联质谱的条件为：采用电喷雾正、负离子模式，全扫描质荷比范围50～1200，雾化气压力35-75psi，辅助气压力37-75psi，气帘气压力25-45psi，雾化温度350-600℃，喷雾压力绝对值4000-6000V，碰撞能量20-60V，去簇电压40-80V；
所述黄芪桂枝五物汤样品由黄芪、桂枝、白芍、生姜和大枣制备而成。通过所述HPLC-Q-TOF-MS/MS法能实现同时对黄芪桂枝五物汤中黄芪甲苷、黄芪皂苷II、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、山奈酚、槲皮素、黄芪皂苷VII、异鼠李素、柒料木苷、桂皮醛、桂皮酸、香豆素、原儿茶酸、原儿茶醛、肉桂醇、2-甲氧基桂皮酸、芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚、羟基芍药苷、没食子酸、芍药苷亚硫酸酯、没食子酰基芍药苷、6-姜辣素、姜油酮、β-倍半水芹烯、齐墩果酸、东莨菪内酯、芦丁等31种成分的定性分析。
作为本发明分析方法的优选实施方式，所述色谱柱的柱长为150mm，柱内径为3.0mm，粒径为2.8μm；所述流动相流速为0.3mL/min；所述进样量为10μL。
作为本发明分析方法的优选实施方式，所述色谱柱的柱温为40℃。
作为本发明分析方法的优选实施方式，所述雾化气压力为55psi，辅助气压力为55psi，气帘气压力为35psi，雾化温度为550℃，碰撞能量为40V，去簇电压为60V。
作为本发明分析方法的优选实施方式，采用电喷雾正离子模式时，喷雾电压为5500V；采用电喷雾负离子模式时，喷雾电压为-4500V。
作为本发明分析方法的优选实施方式，所述分析方法还采用相同的超快速高效液相色谱三重四级杆飞行时间串联质谱联用方法对黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛、芍药苷和6-姜辣素的标准物进行检测分析以验证所述黄芪桂枝五物汤样品的分析结果的准确性和可靠性。
作为本发明分析方法的优选实施方式，所述黄芪桂枝五物汤样品的进样生药浓度为0.4～0.6g/mL。
作为本发明分析方法更优选的实施方式，所述黄芪桂枝五物汤样品的进样生药浓度为0.4g/mL。
作为本发明分析方法的优选实施方式，所述黄芪、桂枝、白芍、生姜和大枣的质量比为黄芪：桂枝：白芍：生姜：大枣＝1:1:1:2:1。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：本发明采用HPLC-Q-TOF-MS/MS法对黄芪桂枝五物汤进行全成分检测，可识别其中31种有效成分，不但能准确、全面、可靠的分析黄芪桂枝五物汤制剂的质量，而且高效快速；另外，将黄芪桂枝五物汤的分析结果与黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛、芍药苷和6-姜辣素5种药典成分标准物的分析结果进行对比能验证前者的准确性。
附图说明
图1为不同处理方法得到的不同生药浓度的黄芪桂枝五物汤样品在负离子模式下的总离子流图，其中图1A黄芪桂枝五物汤浓缩液样品的生药浓度为0.562g/mL，图1B黄芪桂枝五物汤冻干粉水溶液样品的生药浓度为0.4g/mL；
图2为黄芪桂枝五物汤冻干粉水溶液样品的总离子流图，其中图2A为负离子模式，图2B为正离子模式。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
1、仪器、试剂与材料
1.1仪器
新型密封式粉碎机(500g密封型摇摆式粉碎机)、二号筛(24目)、四号筛(65目)、挥发油提取装置(包括：KDM型调温电热套、5000mL圆底烧瓶、挥发油提取器、冷凝管)、旋蒸仪(IKA公司，型号RV10，包括真空泵、低温冷却液循环泵)、低温真空干燥机(LABCONCO公司)、超快速高效液相色谱仪(LC-20AD-XR二元泵，SIL-20AD-XR自动进样器，CTO-20A柱温箱，日本岛津公司)；四级杆-飞行时间质谱仪(Triple TOF5600+，美国AB SCIEX公司)、超纯水器(美国Millipore公司，型号Simplicity)。
1.2试剂
对照品：黄芪甲苷(纯度≥98.0wt.％)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(纯度≥98.0wt.％)、桂皮醛(纯度≥98.0wt.％)、芍药苷(纯度≥98.0wt.％)、6-姜辣素(纯度≥98.0wt.％)均购自成都曼思特生物科技有限公司。
甲醇(分析纯，广东光华化学厂有限公司)、乙腈(色谱纯，Fisher Scientific公司)、甲酸(Sigma公司，批号：0001408600)。
1.3材料
(1)药材来源与处理：黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣中药材来源于康美药业股份有限公司。将黄芪、桂枝、白芍药材分别置于粉碎机中打粉，过二号筛与四号筛，得到黄芪粗粉、桂枝粗粉、白芍粗粉。生姜切成约为2cm*2cm小块，大枣切成约为2cm*2cm小丁(留枣核)。
(2)复方水煎液获取：称取上述黄芪、桂枝、白芍的粗粉各45g，生姜块90g，大枣丁(加枣核重量)45g置于5000mL圆底烧瓶中，采用挥发油提取装置进行复方煎煮：电热套加热，加水煎煮两次，第一次加水10倍量(2700mL水)，即水的质量是黄芪桂枝白芍生姜大枣这5种物质总质量的10倍，煎煮1h，过滤，得到第一次滤液，期间每半小时收集一次芳香水，共收集两次；第二次加水6倍量(1620mL纯水)，即水的质量是黄芪桂枝白芍生姜大枣这5种物质总质量的6倍，煎煮45min，过滤，得到第二次滤液，收集一次芳香水。合并两次滤液，得黄芪桂枝五物汤水煎液，4℃存储备用。将三次芳香水合并用后密封储存于100mL锥形瓶中，得到总芳香水，4℃存储备用。
(3)旋蒸浓缩液获取：利用旋转蒸发仪对上述黄芪桂枝五物汤水煎液进行旋蒸浓缩，循环水冷却温度0℃以下，旋蒸转速100rpm，旋蒸温度60℃，将其浓缩至200-250mL，再与上述总芳香水混合，得黄芪桂枝五物汤浓缩液。
(4)冻干粉获取：将上述黄芪桂枝五物汤浓缩液分装在冷冻干燥盘里，置于-80℃冰箱冻存超过4h，后取出置于低温真空干燥机中干燥24h，得黄芪桂枝五物汤冻干粉。
2、色谱条件与质谱条件
2.1色谱条件
色谱柱：C18柱(150×3.0mm,2.8μm，Phenomenex公司)；流速0.3mL/min；柱温为40℃；进样量10μL；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为含0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，按表1所示的洗脱程序进行梯度洗脱。
2.2质谱条件
离子源：ESI(电喷雾)；分析软件：Analyst software(PeakView,Version 2.1,ABSciex)。质谱条件：分别采用正、负离子模式进行检测，全扫描质荷比m/z范围50～1200，雾化气压力55psi，辅助气压力55psi，气帘气压力33psi，雾化温度550℃，喷雾电压5500V或-4500V，碰撞能量40V，去簇电压60V。
3、检测目标化合物的确定：
根据《中华人民共和国2015版药典》、中国知网及PubMed外文网站关于黄芪、桂枝、白芍、生姜以及大枣成分测定的记载与文献报道，初步确定出黄芪桂枝五物汤可能存在的目标检测化合物共47种，详情见表2。
表2黄芪桂枝五物汤目标检测化合物表
Figure BDA0002325634430000061
Figure BDA0002325634430000071
Figure BDA0002325634430000081
Figure BDA0002325634430000091
Figure BDA0002325634430000101
Figure BDA0002325634430000111
4、溶液的配制
4.1混合对照品溶液的配制
混合对照品制备：向黄芪甲苷(20mg)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(20mg)、芍药苷(20mg)、桂皮醛(20μL)、6-姜辣素(20mg)中分别加入1mL甲醇，配制成20mg/mL(桂皮醛为20μL/mL)的单一对照品储备液，置于4℃冰箱中储存备用；再将前述单一储备液进行混合，稀释，混匀后离心取上清液并过0.45μm的有机微孔滤膜制成混合对照品，其中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芍药苷以及6-姜辣素的浓度均为0.02mg/mL，桂皮醛的浓度为0.02μL/mL。
4.2供试品的制备
取0.4g上述黄芪桂枝五物汤冻干粉，纯水溶解配成生药浓度为0.4g/mL的样品水溶液，混匀后离心取上清液并过0.45μm的有机微孔滤膜，即得所需供试品样品。
4.3供试品浓度的选择
(1)因为黄芪桂枝五物汤复方提取液中含有多种难溶性成分，会干扰测定，我们以水溶性成分最大溶解量为标准之一来选择待检测样品的上样浓度，最大溶解度通过观察样品颜色深浅及样品离心后的澄清度判定。具体方法为：取不同质量的同一批黄芪桂枝五物汤冻干粉样品配成不同生药浓度(1g生药＝0.188g冻干粉，即药材总质量与冻干粉总质量的比值为0.188)的水溶液，比较不同生药浓度水溶液澄清度，当黄芪桂枝五物汤冻干粉水溶液的生药浓度超过0.4g/mL时，澄清度较低；当黄芪桂枝五物汤冻干粉水溶液的生药浓度为0.4g/mL以下时，澄清，适用于HPLC-Q-TOF-MS/MS上样，考虑对含量较低成分的检测，选择黄芪桂枝五物汤冻干粉水溶液的上样浓度为澄清条件下的最大浓度，即其生药浓度为0.4g/mL，详情见表3。
表3生药浓度颜色澄清度对照表
Figure BDA0002325634430000121
Figure BDA0002325634430000131
(2)将生药浓度为0.562g/mL黄芪桂枝五物汤浓缩液(经“1.3材料”部分所述的步骤(1)-(3)制得，未经过步骤(4)，即冻干粉制备)与生药浓度为0.4g/mL的黄芪桂枝五物汤冻干粉水溶液分别采用HPLC-Q-TOF-MS/MS法(检测条件同“2、色谱条件与质谱条件”部分)进行检测，所得质谱图见图1A和图1B，经对比可知生药浓度为0.4g/mL的样本出峰正常，且出峰数多于生药浓度为0.562g/mL的样本，故确定生药浓度0.4g/mL为黄芪桂枝五物汤样本的最终上样浓度，“5、样品测定”、“6、结果判定”“7、方法学考察”部分中黄芪桂枝五物汤样本的上样浓度均为0.4g/mL(生药浓度)。
5、样品测定
根据“4、溶液的配制”部分制备供试品样本，按“2、色谱条件与质谱条件”部分所述的条件进行测定，获得黄芪桂枝五物汤冻干粉化学成分正负离子模式总离子流图，如图2所示。
6、结果判定
经过HPLC-Q-TOF-MS/MS法检测，记录对比混合对照品及黄芪桂枝五物汤供试品目标化合物分子式、色谱峰的TR(保留时间)及m/z信息(其中实测值指母离子碎片分子量实测值，理论值指母离子碎片分子量理论值)，并将相关图谱、数据作为电子版本保存。表4是通过HPLC-Q-TOF-MS/MS技术检测到的黄芪桂枝五物汤31种共有化学成分TR、m/z信息，其中有11种化学成分归属于黄芪，7种化学成分来源于桂枝，7种化学成分归属于白芍，3种化学成分归属于生姜，3种化学成分归属于大枣。
表4黄芪桂枝五物汤中化学成分质谱数据
Figure BDA0002325634430000141
Figure BDA0002325634430000151
Figure BDA0002325634430000161
7、方法学考察
7.1原理
1)HPLC-Q-TOF-MS/MS法准确性评价指标：选取五个标准品(黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芍药苷、桂皮醛、6-姜辣素)的TR，found at mass(样品母离子碎片分子量实测值)和MS2(主要二级离子碎片)三个质谱主要检测参数与黄芪桂枝五物汤冻干粉水溶液中相应的三个参数的差值，即△TR(TR的差值)、△Mass(found at mass的差值)以及△MS2(MS2的差值)作为HPLC-Q-TOF-MS/MS检测方法及成分结果是否准确可靠的参考指标，本发明认为△TR(单位min)、△Mass以及△MS2数值位于±0.1范围内属于正常误差范围。
2)对二级离子碎片的选择：因为在质谱分析中，同一样品每次分析的二级离子碎片(母离子裂解时产生的碎片)的数量均不完全一致，本发明中，我们选择了优化的质谱条件下信号最好，稳定性最高的1个或多个二级离子为研究对象进行稳定性的评价。
7.2HPLC-Q-TOF-MS/MS法的检测结果准确性验证实验
为了检验上述实施方式中建立的HPLC-Q-TOF-MS/MS法检测黄芪桂枝五物汤全成分结果的准确性，选用药典标识性的5种成分(黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛、芍药苷、6-姜辣素)，根据“4、溶液的配制”部分制备混合对照品与供试品样本，按“2、色谱条件与质谱条件”部分所述的条件进行上样测定。记录5种混合对照品及黄芪桂枝五物汤相应的5种成分的TR、母离子碎片分子量实测值、主要二级碎片MS2，计算△TR/min、△Mass与△MS2，统计结果见表5，从表中可以看出，对照品与黄芪桂枝五物汤样品的△TR/min(TR，对照-TR，五物汤)、△Mass(Mass对照-Mass五物汤)、△MS2(MS2 对照-MS2 五物汤)差值均位于±0.1误差范围内，由此可以证明本发明的HPLC-Q-TOF-MS/MS法检测黄芪桂枝五物汤全成分的结果是准确可靠的。
表5黄芪桂枝五物汤与药典混合对照品质谱信息对比表
Figure BDA0002325634430000171
7.3HPLC-Q-TOF-MS/MS法重复性实验：
1)为了检验HPLC-Q-TOF-MS/MS法检测黄芪桂枝五物汤全成分结果的重复性，本发明对3批原料根据“1.3材料”部分所述方法分别制成冻干粉，再根据“4.2供试品制备”部分所述方法分别制成供试品样本，然后根据“2、色谱条件与质谱条件”部分所述检测条件进行上样测定。记录3批黄芪桂枝五物汤样本检测成分的TR、母离子分子量实测值、主要二级碎片MS2，数据对比结果显示，煎煮的三批黄芪桂枝五物汤样本数据重复性高，HPLC-Q-TOF-MS/MS法检测黄芪桂枝五物汤全成分结果的重复性好，具体对比结果见表6。
表6黄芪桂枝五物汤3批煎煮样本质谱数据对比分析表
Figure BDA0002325634430000181
Figure BDA0002325634430000191
Figure BDA0002325634430000201
2)本发明进一步对三批样本的TR重复性标准偏差S进行了对比分析，具体分析方法为：
Figure BDA0002325634430000202
其中，S-标准偏差(％)；n-试样总数或测量次数；i-物料中某成分的各次测量值，可以为1～n中的任何一个数。本发明中认为重复性标准差(S)位于±0.1范围内属于正常误差范围。统计结果显示，三批黄芪桂枝五物汤煎煮样本各检测化合物的重复性标准差(S)均小于0.1，表明数据重复性高。分析对比结果见表7。
表7三批黄芪桂枝五物汤TR/min重复性标准差统计表
Figure BDA0002325634430000211
Figure BDA0002325634430000221
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种黄芪桂枝五物汤全成分的分析方法，其特征在于，所述分析方法采用超快速高效液相色谱三重四级杆飞行时间串联质谱联用方法对黄芪桂枝五物汤样品进行检测；
其中，所述高效液相色谱的条件为：色谱柱为C18柱，柱长100-250mm，柱内径3.0-4.6mm，粒径1.5-5.0μm；流动相流速0.2-1mL/min；进样量5-20μL；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为含0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，采用如下梯度洗脱程序：1)0～30min，流动相A的体积百分含量由95％降至5％；2)30～35min，流动相A的体积百分含量为5％；3)35～37min，流动相A的体积百分含量由5％升至95％；4)37～45min，流动相A的体积百分含量为95％；
所述三重四级杆飞行时间串联质谱的条件为：采用电喷雾正、负离子模式，全扫描质荷比范围50～1200，雾化气压力35-75psi，辅助气压力37-75psi，气帘气压力25-45psi，雾化温度350-600℃，喷雾压力绝对值4000-6000V，碰撞能量20-60V，去簇电压40-80V；
所述黄芪桂枝五物汤样品由黄芪、桂枝、白芍、生姜和大枣制备而成。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述色谱柱的柱长为150mm，柱内径为3.0mm，粒径为2.8μm；所述流动相流速为0.3mL/min；所述进样量为10μL。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为40℃。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述雾化气压力为55psi，辅助气压力为55psi，气帘气压力为35psi，雾化温度为550℃，碰撞能量为40V，去簇电压为60V。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，采用电喷雾正离子模式时，喷雾电压为5500V；采用电喷雾负离子模式时，喷雾电压为-4500V。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述分析方法同时对所述黄芪桂枝五物汤样品中的31种成分进行定性检测，所述31种成分分别为黄芪甲苷、黄芪皂苷II、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、山奈酚、槲皮素、黄芪皂苷VII、异鼠李素、柒料木苷、桂皮醛、桂皮酸、香豆素、原儿茶酸、原儿茶醛、肉桂醇、2-甲氧基桂皮酸、芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚、羟基芍药苷、没食子酸、芍药苷亚硫酸酯、没食子酰基芍药苷、6-姜辣素、姜油酮、β-倍半水芹烯、齐墩果酸、东莨菪内酯和芦丁。
7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述分析方法还采用相同的超快速高效液相色谱三重四级杆飞行时间串联质谱联用方法对黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、桂皮醛、芍药苷和6-姜辣素的标准物进行检测分析以验证所述黄芪桂枝五物汤样品的分析结果的准确性和可靠性。
8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述黄芪桂枝五物汤样品的进样生药浓度为0.4～0.6g/mL。
9.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述黄芪、桂枝、白芍、生姜和大枣的质量比为黄芪：桂枝：白芍：生姜：大枣＝1:1:1:2:1。
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