CN112229934A - 一种当归六黄汤全成分的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种当归六黄汤全成分的分析方法，属于药物分析技术领域。本发明采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UPLC‑Q‑TOF‑MS）技术对当归六黄汤样品进行检测，同时采用15种化学对照品:黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸黄柏碱、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、绿原酸、藁本内酯、毛蕊花糖苷、黄芩素、汉黄芩素对当归六黄汤检测结果进行确认，明确识别了68种成分，实现了对当归六黄汤成分的全面分析，提高了其质量控制的可靠性。

Description

一种当归六黄汤全成分的分析方法
技术领域
本发明属于药品分析技术领域，具体涉及一种当归六黄汤全成分的分析方法。
背景技术
当归六黄汤始载于金代李东垣《兰室秘藏》，由当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄芩、黄连、黄芪7味中药组成，是“治盗汗之圣药也”，现代临床常用于治疗围绝经期综合征、甲状腺功能亢进、皮肤病、病毒性心肌炎、慢性口腔溃疡、慢性前列腺炎等疾病。目前对当归六黄汤的研究主要集中在临床应用方面，化学成分研究主要是运用高效液相色谱法（HPLC）建立指纹图谱及对毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、黄连碱、黄芩苷、小檗碱、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等成分中部分成分进行含量测定，对于其全成分分析未见报道。
但目前对当归六黄汤的成分研究存在一定的局限和不足：（1）含量测定方法主要集中在处方单味药材以及处方药味药典检测成分的含量测定研究；（2）现有的关于当归六黄汤成分检测的方法灵敏度低，无法检测到含量较低的成分。（3）由于HPLC分离度较低，当归六黄汤指纹图谱大部分成分并未实现较好分离，无法进行定性分析，因此无法实现全面成分分析。但中药复方的药效物质组成复杂，其影响不是单个成分的累积效应，而是包含各成分之间的相互作用，单一成分的含量不能全面地反映复方的质量，无法实现当归六黄汤的整体质量控制。因此，需要采用多技术方法结合多指标成分测定进行全面的质量控制，本发明提供了一种当归六黄汤全成分分析方法，为其全面质量控制提供依据。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的上述缺陷，提供一种当归六黄汤全成分的分析方法。
本发明提供的一种当归六黄汤全成分的分析方法，采用UPLC-Q-TOF-MS法，对当归六黄汤进行检测；其中，所述高效液相色谱的条件为：色谱柱为C18柱，柱长150-250mm，柱内径2.1-4.6mm，粒径1.8-5.0um；流动相流速0.2-1mL/min；进样量2-5uL，波长280nm；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为含0.1%（v/v）甲酸的水溶液，流动相B为甲醇，采用如表1所示的梯度洗脱程序：
表1 流动相梯度洗脱程序
时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%）
0 90 10
10 65 35
25 50 50
35 35 65
45 20 80
55 10 90
60 5 95
65 5 95
所述四级杆飞行时间质谱的条件为：采用电喷雾正、负离子模式，全扫描质荷比范围100~3000，干燥气温度350℃，干燥气流速12L/min，雾化气压力为50psi，毛细管电压4000V（+）、3500V（-），毛细管出口电压170V，碰撞能量30V。
所述当归六黄汤样品由当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄连、黄芩、黄芪7种药材煎煮，浓缩、冻干后，用50%甲醇提取制得。通过所述UPLC-Q-TOF-MS法能实现对当归六黄汤中L-精氨酸、水苏糖、甘露三糖、麦芽糖、奎宁酸、N-(1-deoxy-D-fructos-1-yl)pyroglutamic acid、柠檬酸、梓醇、腺苷、鸟苷、丹参素、oblongine、黄柏碱、木兰花碱、绿原酸、4-O-阿魏酰奎宁酸、N-methylhigenamine-7-O-glucopymnoside、隐绿原酸、N-甲基紫堇定碱、咖啡酸、5-O-阿魏酰奎宁酸、5-羟基小檗碱、3-O-阿魏酰奎宁酸、小檗红碱、去亚甲基小檗碱、黄连碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、非洲防己碱、表小檗碱、药根碱、阿魏酸、毛蕊花糖苷、格兰地新、白杨素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖、小檗碱、巴马汀、野黄芩苷、环五（异）亮氨酸、白杨素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖、异毛蕊花糖苷、环六（异）亮氨酸、芒柄花苷、5，7，2'-三羟基-6-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷、5，7，8-三羟基黄酮-7-O-葡萄糖苷、黄芩素-7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、环七（异）亮氨酸、黄芩苷、5，7，8-三羟基-6-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷、羟基千层纸素A-9-O-葡萄糖醛酸苷、去甲汉黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、二氢千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、羟基汉黄芩苷、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、5，7-二羟基-6，8-二甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷、Methylnissolin、4-羟基汉黄芩素、黄芩素、芒柄花素、黄芩新素Ⅱ、汉黄芩素、藁本内酯、华良姜素、藁本内酯A、千层纸素A、黄芪甲苷、亚油酸，68种成分的定性分析。
作为本发明分析方法的优选实施方式，所述色谱柱的柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5um；所述流动相流速为1mL/min；所述进样量为2uL；所述色谱柱的柱温为25℃。
作为本发明分析方法的优选实施方式，所述全扫描质荷比范围100~3000，干燥气温度350℃，干燥气流速12L/min，雾化气压力为50psi，毛细管电压4000V（+）、3500V（-），毛细管出口电压170V，碰撞能量30V。
作为本发明分析方法的优选实施方式，所述分析方法还采用相同的UPLC-Q-TOF-MS方法对黄芩苷、汉黄芩苷、小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、黄柏碱、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、绿原酸、藁本内酯、毛蕊花糖苷、黄芩素、汉黄芩素15种化学成分对照品进行检测分析以验证所述当归六黄汤样品的分析结果的准确性和可靠性。
作为本发明分析方法的优选实施方式，所述当归六黄汤的制备方法为：将当归六黄汤中的各饮片制成最粗粉（指能全部通过10目筛，但混有能通过50目筛不超过20%的粉末），并按照一定的质量比混合，加水煎煮后趁热过滤，浓缩、干燥得棕黄色至棕色粉末。
作为本发明分析方法的优选实施方式，所述当归六黄汤的详细制备方法为：取当归2.5g、生地黄2.5g、熟地黄2.5g、黄柏2.5g、黄芩2.5g、黄连2.5g、黄芪5.0g，将各饮片最粗粉置于1.5L砂锅中，加水600mL，加盖，用电陶炉以武火800W煎煮15min至沸腾，然后转文火400W煎煮60min至约300mL，用200目不锈钢滤网常压趁热过滤，滤液用旋转蒸发仪在80℃条件下减压浓缩25min至约150mL，浓缩液用真空冷冻干燥机干燥48h，收集，即得。
作为本发明分析方法的优选实施方式，所述当归六黄汤供试品溶液制备：取本品0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，再称定重量，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：（1）本发明采用UPLC-Q-TOF-MS法对当归六黄汤进行全成分检测，可识别其中68种化学成分，不但能准确、全面、可靠的分析当归六黄汤的质量，而且高效快速；（2）将当归六黄汤的分析结果与黄芩苷、汉黄芩苷、小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、黄柏碱、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、绿原酸、藁本内酯、毛蕊花糖苷、黄芩素、汉黄芩素15种对照品的分析结果进行对比能验证前者的准确性。
附图说明
图1为当归六黄汤正离子总离子流图；
图2为当归六黄汤负离子总离子流图；
图3为当归六黄汤正离子总离子流图局部放大图；
图4为当归六黄汤负离子总离子流图局部放大图；
图5-1~图5-3为表2 当归六黄汤目标检测化合物表；
图6-1~图6-7为表3 当归六黄汤化学成分质谱数据；
图7-1~图7-2为表4 当归六黄汤与混合对照品质谱信息对比表；
图8-1~图8-9为表5 当归六黄汤3批样品质谱数据对比及TR标准差统计表。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本发明进行详细阐述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。
1、仪器、试剂与材料
1.1仪器
超高效液相色谱仪 Agilent 1290；四级杆飞行时间质谱 Agilent 6530C；万分之一电子天平 BSASS4S-CW，赛多利斯；十万分之一电子天平XS105，梅特勒；超声波清洗器 KQ-300DE，深圳科洁仪器有限公司；高速粉碎机 浙江屹立工贸有限公司；一号药典筛（10目）、三号药典筛（50目）、九号药典筛（200目）；旋转蒸发器 YRE-2000A，巩义市予华仪器有限责任公司；真空冷冻干燥机 BK-FD18BP，山东博科生物产业有限公司。
1.2试剂
对照品：阿魏酸（批号：110773-201614，含量以99.0%）、藁本内酯（批号：111737-201610）、黄芩苷（批号：110715-201821，含量以95.4%计）、汉黄芩苷（批号：11202-201702，含量以98.5%计）、黄芩素（批号：111595-201808，含量以97.9%计）、汉黄芩素（批号：112002-201702）、盐酸小檗碱（批号：110713-201814，含量以86.7%计）、盐酸黄柏碱（批号：111895-201504，含量以94.9%计）、盐酸黄连碱（批号：112026-201802，含量以94.0%计）、盐酸巴马汀（批号：110732-201913，含量以85.7%计）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号：111920-201606，含量以97.6%计）、绿原酸（批号：110753-201716,含量以99.3%计）、黄芪甲苷（批号：110781-201717，含量以96.9%计）、毛蕊花糖苷（批号：111530-201914，含量以95.2%计）以上均购自中国食品药品检定研究院。盐酸表小檗碱（批号：PS012485，含量以98.52%计）购自成都普斯生物科技股份有限公司。
甲醇（质谱纯），Merck；甲酸（色谱纯），天津市光复精细化工有限公司；超纯水，广州屈臣氏食品饮料有限公司。
1.3材料
（1）药材来源与处理：当归、地黄、黄柏、黄芩、黄连、黄芪药材均由本单位采购部从产地购买。将六味处方药材分别按药典炮制方法炮制成7种饮片，将各饮片分别置于粉碎机中粉碎，过一号筛与三号筛，分别得当归饮片最粗粉、生地黄饮片最粗粉、熟地黄饮片最粗粉、黄柏饮片最粗粉、黄芩饮片最粗粉、黄连饮片最粗粉和黄芪饮片最粗粉。
（2）当归六黄汤的制备：取当归2.5g、生地黄2.5g、熟地黄2.5g、黄柏2.5g、黄芩2.5g、黄连2.5g、黄芪5.0g，将各饮片最粗粉置于1.5L砂锅中，加水600mL，加盖，用电陶炉以武火800W煎煮15min至沸腾，然后转文火400W煎煮60min至约300mL，用200目不锈钢滤网常压趁热过滤，滤液用旋转蒸发仪在80℃条件下减压浓缩25min至约150mL，浓缩液用真空冷冻干燥机干燥48h，收集，即得。
（3）单味饮片冻干粉的制备：按当归六黄汤处方中各饮片的处方量，分别单独取各饮片最粗粉，按当归六黄汤的制备方法制备各单味饮片冻干粉。
2、色谱条件与质谱条件
2.1色谱条件
色谱柱：C18柱（250×4.6mm，5um，Kromasil公司）；流速1mL/min；柱温为25℃；进样量2uL；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为含0.1%（v/v）甲酸水溶液，流动相B为甲醇，按表1所示的洗脱程序进行梯度洗脱。
2.2质谱条件
离子源：ESI（电喷雾）；分析软件：Agilent MassHunter Workstation；质谱条件：分别采用正、负离子模式进行检测，全扫描质荷比范围100~3000，干燥气温度350℃，干燥气流速12L/min，雾化气压力为50psi，毛细管电压4000V（+）、3500V（-），毛细管出口电压170V，碰撞能量30V。
3、检测目标化合物的确定：
根据《中国药典》2015版、中国知网及外文文献关于当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄芩、黄连以及黄芪化学成分测定的记载与文献报道，初步确定出当归六黄汤可能存在的目标检测化合物共77种，详情见表2。
4、溶液的制备
4.1混合对照品溶液的制备
分别取黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸黄柏碱、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、绿原酸、藁本内酯、毛蕊花糖苷、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，精密称定，用甲醇分别配成浓度为1mg/mL的单一对照品储备液。分别精密吸取前述单一储备液1ml，进行混合，定容至50ml，摇匀，即得以上混合对照品溶液，浓度分别约为0.02mg/mL。
4.2当归六黄汤供试品溶液的制备
取当归六黄汤冻干粉0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，再称定重量，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。
4.3单味饮片供试品溶液的制备
分别取各单味饮片冻干粉0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50%甲醇25mL，称定重量，超声处理30min，称定重量，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。
5、样品测定
根据“4、溶液的制备”项下的方法制备对照品、当归六黄汤供试品和单味饮片供试品溶液，按“2、色谱条件与质谱条件”项下所述的条件进行测定，获得当归六黄汤化学成分正负离子模式总离子流图，如图1-4所示。
6、结果判定
经过UPLC-Q-TOF-MS法检测，记录对比混合对照品及当归六黄汤供试品目标化合物分子式、色谱峰的TR（保留时间）及m/z信息（其中实测值指母离子碎片分子量实测值，理论值指母离子碎片分子量理论值），并将相关图谱、数据作为电子版本保存。表3是通过UPLC-Q-TOF-MS技术检测到的当归六黄汤68种化学成分TR、m/z信息，其中有7种化学成分归属于当归，6种化学成分来源于地黄，7种化学成分归属于黄柏，22种化学成分归属于黄芩，6种化学成分归属于黄连，4种化学成分来源于黄芪，11种化学成分为两种所共有，4种化学成分为三种及以上药材所共有，详见表3。
7、方法学考察
7.1原理
1）UPLC-Q-TOF-MS法准确性评价指标：选取15个对照品（黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸黄柏碱、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、绿原酸、藁本内酯、毛蕊花糖苷、黄芩素、汉黄芩素）的TR，MS（样品母离子碎片分子量实测值）和MS2（主要二级离子碎片）三个质谱主要检测参数与当归六黄汤供试品溶液中相应的三个参数的差值，即△TR（TR的差值）、△MS（MS的差值）以及△MS2（MS2的差值）作为UPLC-Q-TOF-MS检测方法及成分结果是否准确可靠的参考指标，本发明认为△TR（单位min）、△MS以及△MS2数值位于士0.1范围内属于正常误差范围。
2）对二级离子碎片的选择：因为在质谱分析中，同一样品每次分析的二级离子碎片（母离子裂解时产生的碎片）的数量均不完全一致，本发明中，我们选择了优化的质谱条件下信号最好，稳定性最高的1个或多个二级离子为研究对象进行稳定性的评价。
7.2UPLC-Q-TOF-MS法的检测结果准确性验证实验
为了检验上述实施方式中建立的UPLC-Q-TOF-MS法检测当归六黄汤全成分结果的准确性，选用15种对照品（黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸黄柏碱、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、绿原酸、藁本内酯、毛蕊花糖苷、黄芩素、汉黄芩素），根据“4、溶液的制备”的方法制备混合对照品与供试品溶液，按“2、色谱条件与质谱条件”项下所述的条件进行上样测定。记录15种混合对照品及当归六黄汤相应的15种成分的TR、母离子碎片分子量实测值、主要二级碎片MS，计算△TR/min、△MS与△MS2，统计结果见表4，从表中可以看出，以上对照品与当归六黄汤样品的△TR/min（TR对照-TR当归六黄汤）、△MS（MS对照-MS当归六黄汤）、△MS2（MS2 对照-MS2 当归六黄汤）差值均位于士0.1误差范围内，由此可以证明本发明的UPLC-Q-TOF-MS法检测当归六黄汤全成分的结果是准确可靠的。
7.3UPLC-Q-TOF-MS法重复性试验：
1）为了检验UPLC-Q-TOF-MS法检测当归六黄汤全成分结果的重复性，本发明对根据“1.3材料”项下所述方法分别制成的3批当归六黄汤，再根据“4.2供试品制备”项下所述方法分别制成供试品溶液，然后根据“2、色谱条件与质谱条件”项下所述检测条件进行上样测定。记录3批当归六黄汤各成分的TR、母离子分子量实测值、主要二级碎片MS2，数据对比结果显示，三批当归六黄汤数据重复性高，因此说明UPLC-Q-TOF-MS法检测当归六黄汤全成分结果的重复性好，具体对比结果见表5。
2）本发明进一步对三批样本的TR重复性标准偏差S进行了对比分析，具体分析方法为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中，S-标准偏差（%）；n-试样总数或测量次数；i-物料中某成分的各次测量值，可以为1~n中的任何一个数。本发明中认为重复性标准差（S）位于士0.1范围内属于正常误差范围。统计结果显示，三批当归六黄汤样品各检测化合物的重复性标准差（S）均小于0.1%，表明数据重复性高。分析对比结果见表4。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种当归六黄汤全成分的分析方法，其特征在于，所述分析方法采用UPLC-Q-TOF-MS方法对当归六黄汤进行分析；其中，所述高效液相色谱条件为：以十八烷基键合硅胶为填充剂，柱长150-250mm，柱内径2.1-4.6mm，填料粒径1.8-5.0um；流动相流速0.2-1mL/min；进样量2-5uL；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为含0.1%（v/v）甲酸水溶液，流动相B为甲醇，采用如下梯度洗脱程序：0-10min，A相90%-65%，B相10%-35%；15-25min，A相65%-50%，B相35%-50%；25-35min，A相50%-35%，B相50%-65%；35-45min，A相35%-20%，B相65%-80%；45-55min，A相20%-10%，B相80%-90%；55-60min，A相10%-5%，B相90%-95%；60-65min，A相5%，B相95%；所述四级杆飞行时间质谱的条件为：采用电喷雾正、负离子模式，全扫描质荷比范围100~ 3000，干燥气温度300-500℃，干燥气流速5-15L/min，雾化气压力35-75psi，毛细管电压3000-5000V，毛细管出口电压100-200V，碰撞能量10-60V；所述当归六黄汤样品由当归、生地黄、熟地黄、黄柏、黄连、黄芩、黄芪7种饮片煎煮、浓缩、冻干后，用50%甲醇提取制得。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述色谱柱的柱长为250mm，柱内径为4.6mm，粒径为5um；所述流动相流速为1mL/min；所述进样量为2uL；所述色谱柱的柱温为25℃。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述全扫描质荷比范围100~3000，干燥气温度350℃，干燥气流速12L/min，雾化气压力为50psi，毛细管出口电压170V，碰撞能量30V。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，采用电喷雾正离子模式时，喷雾电压为4000V；采用电喷雾负离子模式时，喷雾电压为-3500V。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述分析方法同时对所述当归六黄汤中的68种成分进行定性检测，所述68种成分分别为L-精氨酸、水苏糖、甘露三糖、麦芽糖、奎宁酸、N-(1-deoxy-D-fructos-1-yl) pyroglutamic acid、柠檬酸、梓醇、腺苷、鸟苷、丹参素、oblongine、黄柏碱、木兰花碱、绿原酸、4-O-阿魏酰奎宁酸、N-methylhigenamine-7-O-glucopymnoside、隐绿原酸、N-甲基紫堇定碱、咖啡酸、5-O-阿魏酰奎宁酸、5-羟基小檗碱、3-O-阿魏酰奎宁酸、小檗红碱、去亚甲基小檗碱、黄连碱、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、非洲防己碱、表小檗碱、药根碱、阿魏酸、毛蕊花糖苷、格兰地新、白杨素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖、小檗碱、巴马汀、野黄芩苷、环五（异）亮氨酸、白杨素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖、异毛蕊花糖苷、环六（异）亮氨酸、芒柄花苷、5，7，2'-三羟基-6-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷、5，7，8-三羟基黄酮-7-O-葡萄糖苷、黄芩素-7-O-β-D吡喃葡萄糖苷、环七（异）亮氨酸、黄芩苷、5，7，8-三羟基-6-甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷、羟基千层纸素A-9-O-葡萄糖醛酸苷、去甲汉黄芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、二氢千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、羟基汉黄芩苷、千层纸素A-7-O-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、5，7-二羟基-6，8-二甲氧基黄酮-7-O-葡萄糖醛酸苷、Methylnissolin、4-羟基汉黄芩素、黄芩素、芒柄花素、黄芩新素Ⅱ、汉黄芩素、藁本内酯、华良姜素、藁本内酯A、千层纸素A、黄芪甲苷和亚油酸。
6.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述分析方法还采用相同的UPLC-Q-TOF-MS方法对黄芩苷、汉黄芩苷、小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、黄柏碱、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、绿原酸、藁本内酯、毛蕊花糖苷、黄芩素、汉黄芩素15种化学成分对照品进行检测分析，以验证所述当归六黄汤分析结果的准确性和可靠性。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，当归六黄汤的制备方法为：将当归六黄汤中的各饮片制成最粗粉（指能全部通过10目筛，但混有能通过50目筛不超过20%的粉末），并按照一定的质量比混合，加水煎煮后趁热过滤，浓缩，干燥得棕黄色至棕色粉末。
8.根据权利要求7所述的当归六黄汤的制备方法，其特征在于，取当归2.5g、生地黄2.5g、熟地黄2.5g、黄柏2.5g、黄芩2.5g、黄连2.5g、黄芪5.0g，将各饮片最粗粉置于1.5L砂锅中，加水600mL，加盖，用电陶炉以武火800W煎煮15min至沸腾，然后转文火400W煎煮60min至约300mL，用200目不锈钢滤网常压趁热过滤，滤液用旋转蒸发仪在80℃条件下减压浓缩25min至约150mL，浓缩液用真空冷冻干燥机干燥48h，收集，即得。
9.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，供试品溶液制备：取本品0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50%甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，再称定重量，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。
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