CN112763606B - 一种附子理中制剂差异化合物的质量分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药复方制剂质量控制领域,特别涉及一种附子理中制剂差异化合物的质量分析方法,包括UPLC‑Q‑Exactive测试、中药指纹图谱对比分析、主成分分析法(PCA)以及正交偏最小二乘法判别分析法(OPLS‑DA)等多元统计分析,通过该方法能够使中药复方制剂的功效得到综合的体现,多成分、多靶点、多途径交互作用的体现,克服现有技术仅以单一的成分作为质控指标进行评价中药制剂功效所带来的不能全面切实的反应其临床功效的缺陷。
Description
技术领域
本发明属于中药复方制剂分析、中药质量控制技术领域,具体涉及到应用UPLC-Q-Exactive检测、分析附子理中丸剂和附子理中汤剂的差异化学成分的方法;特别涉及附子理中系列制剂的差异化合物检测及质量分析方法。
背景技术
附子理中制剂包括附子、党参、白术、干姜和甘草等成分,具有温中健脾之功效,用于脾胃虚寒、脘腹冷痛、呕吐泄泻及手足不温等症。该方的临床应用量较大,但目前中药复方制剂质量控制模式基本是借鉴化学药品质量控制模式而建立,质量标准多以单一指标成分的定性、定量分析为主,未能切实地、全面地反映其临床功效,这已经成为影响中药复方制剂进入国际医药市场的技术壁垒。为提高和保障该方药临床疗效提供依据,更好的服务临床广大患者,针对目前中药复方制剂质量标准研究中存在的问题,急需建立与功效相关的中药复方多组分质量评价体系以及多药味、多组分的含量测定和鉴别方法,以推动我国中药复方制剂质量标准的现代化。
UPLC-Q-Exactive是一种新型高分辨质谱仪,能够提供高质量的全扫描和MS/MS数据,具有高分辨率、高灵敏度、定性和定量能力强的特点,可以实现多种成分同时快速地鉴定和指认,特别适用于中药复杂组分的鉴定;中药指纹图谱是一种半定量鉴别技术,能够辨识光谱图或色谱图的共有峰并评价图谱相似性,相对于单一有效成分的测定模式而言,它包含的信息量更大,且是多层次的、可量化的、综合的,因此中药指纹图谱是研究中药复方制剂质量控制的有效工具;主成分分析法(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析法(OPLS-DA)是多元统计学方法中的一种,是常用的对样品原始数据进行综合评价的方法之一,通过对样品信息的统计处理,可以最大限度的保留样品的原始数据,并做出整体性评价和描述。
中药复方制剂的功效是其所含成分综合作用的结果,是多成分、多靶点、多途径交互作用的体现,但现在中药复方制剂质量控制体系多借鉴化学药品质量控制模式而建立,多以单一指标成分的定性、定量分析为主,如在《中国药典》2020版一部中,附子理中系列制剂项下的含量检测均使用高效液相色谱法,通过检测甘草这一单一成分作为质控指标,这并不利于体现中药复方系列制剂的功效和整体性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中所存在的中药组合物单一指标成分定性、定量质量分析不能全面反映临床功效的缺陷,提供一种附子理中制剂差异化合物的质量分析方法。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
样品检测:将附子理中丸剂样品和附子理中汤剂样品分别采用高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪UPLC-Q-Exactive-MS进行检测;
预处理:通过Xcalibur软件及Compound Discoverer软件对所述附子理中丸剂样品、所述附子理中汤剂样品检测得到的总离子流图和质谱数据进行预处理得到样品文件;
组内差异化合物分析:将多批次所述附子理中丸剂样品的样品文件导入至中药色谱指纹图谱相似度评价系统中,进行组内差异化合物分析,确定附子理中丸剂样品的共有成分;将多批次所述附子理中汤剂样品的样品文件导入至中药色谱指纹图谱相似度评价系统中,进行组内差异化合物分析,确定附子理中汤剂样品的共有成分;
主成分分析和最小偏二乘判别分析:通过SIMCA软件对附子理中丸剂样品的共有成分、附子理中汤剂样品的共有成分,依次进行主成分分析和最小偏二乘判别分析,得到最终的差异化合物。
本发明将附子理中丸剂样品和附子理中汤剂样品进行高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪UPLC-Q-Exactive-MS进行检测,然后通过Xcalibur软件及Compound Discoverer软件中对所述附子理中丸剂样品、所述附子理中汤剂样品的总离子流图和质谱数据进行预处理得到样品文件,对多批次所述附子理中丸剂样品和多批次所述附子理中汤剂的样品文件分别导入至中药色谱指纹图谱相似度评价系统中进行组内差异化合物分析确定附子理中丸剂样品的共有成分和附子理中汤剂样品的共有成分,通过SIMCA软件对中药色谱指纹图谱处理后的数据表依次进行主成分分析和最小偏二乘判别分析得到最终的差异化合物。
本申请在对附子理中丸剂和附子理中汤剂进行差异化成分分析过程中,首先将两种不同的剂型进行样品的制备,然后通过液质联用质谱仪的检测得到包含了各化合物分子量、保留时间、峰面积的数据表,通过指纹图谱分别对多批次的附子理中丸剂样品和多批次的附子理中汤剂样品进行同一剂型的共有稳定成分的分析检测,在此基础上,再通过SIMCA软件进行主成分分析以及最小偏二乘判别分析,在95%的置信区间内,根据VIP值大于1,得到较精确的差异化合物。
通过上述的方法定性获得的差异化成分一定程度上代表了基于不同剂型以及不同功能主治的制剂特征性成分,利用上述方法对附子理中系列制剂进行质量控制,能够更为全面的反映附子理中制剂的关键质量属性,为建立新型中药质量评价体系提供了参考。
作为本发明的优选技术方案,采用高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪UPLC-Q-Exactive-MS进行样品检测过程中,设置参数如下(液相色谱-质谱条件):
色谱条件:
色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH-C18,50mm×2.1mm,1.7μm;
流动相为0.1%甲酸水溶液A,0.1%甲酸乙腈溶液B;
梯度洗脱顺序为:0-15min,95-70%;15-30min,70-48%;30-45min,48-25%;45-48min,25-15%;48-55min,15-2%;55-65min,2-2%;
流速为1.0mL/min,柱温为35℃,进样量为10μL;
质谱条件:
带鞘流气的电喷雾电离源ESI,正离子扫描;干燥气为N2,气体流量8.0L/min,雾化气温325℃,喷雾器压40psig,鞘流气温度350℃,鞘流气流量11L/min,毛细管电压4000V,Skimmer 65V,OCT1 RFVpp 750V,裂解电压110V,化合物定性时二级质谱碰撞能量设置为10,20,30,40V,数据采集范围m/z 50~1200Da。
作为本发明的优选技术方案,所述预处理包括:将所述高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪UPLC-Q-Exactive-MS检测得到的总离子流图和质谱信息在所述Xcalibur软件中进行色谱图优化处理,得到色谱图信号表、各峰保留时间及峰面积信息;所述优化处理包括平滑曲线以及基线扣除。
作为本发明的优选技术方案,对多组附子理中丸剂样品和多组附子理中汤剂样品分别进行组内的共有成分分析具体步骤为:
将多个批次的附子理中丸剂样品的样品文件导入至中药色谱指纹图谱相似度评价系统中,设置参照图谱和时间窗宽度,再进行多点矫正以及峰匹配,所述峰匹配设置为全谱峰匹配,最后导出匹配数据,通过匹配数据得到了不同批次的稳定的共有成分的数据信息;所述多个批次的附子理中汤剂样品的样品文件组内差异化合物分析步骤与所述附子理中丸剂样品的样品文件分析步骤相同。
本申请的发明人在研究过程中,不同批次的附子理中汤剂之间或不同批次的附子理中丸剂之间存在一定程度的差异,如果直接对附子理中汤剂和附子理中丸剂进行比较的话,会存在较多的偶然性误差干扰,是我们比对的结果不具有参考价值,为了保证不同制剂样品本身的稳定性,我们进行了指纹图谱分析,即通过指纹图谱对多批次的附子理中丸剂样品以及多批次的附子理中汤剂样品分别进行比对分析,得到不同批次的同一剂型的稳定共有成分,使得后续进行差异化合物分析的附子理中丸剂样品与附子理中汤剂样品的计算结果更加具备参考价值。
作为本发明的优选技术方案,将通过指纹图谱分析后的数据信息输入至Simca软件中进行分析的具体步骤为:
所述主成分分析和最小偏二乘判别分析的具体步骤包括:
将所述附子理中丸剂和所述附子理中汤剂分别得到的共有成分数据信息导入至SIMCA软件中建立数据库。将所述附子理中丸剂样品的共有成分和所述附子理中汤剂样品的共有成分数据信息导入至SIMCA软件中建立数据库,将所述数据库分为附子理中丸组和附子理中汤组,并且分别对共有成分进行编号,然后采用主成分分析模型初步分析组间各成分含量的差异性,再采用主成分分析(PCA)模型初步分析组间各成分含量是否有差异性。结果显示R2X=0.71,Q2=0.42,表明该模型稳定,附子理中丸组和附子理中汤组有明显的分离趋势,初步判断组间各成分含量具有差异性,在此基础上,进一步采用最小偏二乘判别分析(PLS-DA)中的变量载荷评价参数(VIP)值确定造成组间差异的因素,即具体化合物。结果显示R2Y=0.92,Q2=0.82,表明该模型稳定,预测能力较强,有40个大于VIP值大于1的化合物,既有40差异化合物,进一步确认化合物。
作为本发明的优选技术方案,所述40个差异化合物包括两类,第一类化合物为含量差异化合物,第二类化合物为剂型导致的差异归属性化合物;第一类为化合物的含量差异,第二类为剂型导致的归属性化合物差异;
所述第一类化合物包括Tauroursodeoxycholic acid、Eicosapentaenoic acid、monolinolein、Docosahexaenoic acid、8Z,11Z,14Z-Eicosatrienoic acid、Methylpalmitate、α-Eleostearic acid、5-Henicosyl-1,3-benzenediol、4-Phenylbutyricacid、Irgafos 168和Erucamide;
所述第二类化合物包括DL-Pipecolinic acid、Acetyl-L-carnitine、L-Pyroglutamic acid、P-Coumaric acid、L-Tyrosine、DL-Norleucine、Serotonin、Thymine、Phenylalanine、Pantothenic acid、2-quinolinecarboxylic acid、Kynurenic acid、(R)-Equol、NP-019374、2-Atractylenolide、Taurodeoxycholic Acid、Glycocholic acid、2-Amino-1,3-octadecanediol、Sphingosine、Cetrimonium、18-β-Glycyrrhetinic acid、4-Methoxycinnamic acid、Glycerophospho-N-palmitoyl ethanolamine、Oleamide、Eicosapentaenoic acid methyl ester、Choline、Palmitoyl sphingomyelin和DL-Dipalmitoylphosphatidylcholine。
作为本发明的优选技术方案,通过上述分析方法,得到附子理中丸剂样品和附子理中汤剂样品之间的40个差异化合物,该差异化合物包括两种类型,一种是化合物的含量差异,就是说剂型的不同,制剂工艺不同,导致的化合物含量存在不同;另一种是由于不同的剂型导致的归属性化合物差异,也就是说,仅出现在丸剂或仅出现在汤剂中的化合物种类。
作为本发明的优选技术方案,将共有成分数据信息中为0的数据替换成液质联用仪器最低检测限数据,然后导入至SIMCA软件中建立数据库。所述共有成分数据信息在所述SIMCA软件进行分析之前,将其中为0的数据替换成液质联用仪器最低检测限数据。
上述附子理中制剂差异化合物的质量分析方法在附子理中制剂质量控制中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果:
本发明的质量分析方法具有分离度高、检测时间短,检测结果准确度高等优点;通过一次进样可测定出多种药效关联的共有关键化合物如AtractylenolideⅡ,18-β-Glycyrrhetinic acid,L-Pyroglutamic acid等,以及制剂工艺导致的关键差异化合物数十种,这些化合物可作为附子理中制剂中不同剂型的重要质量控制成分。
附子理中制剂差异化合物检测及质量分析方法的建立,是基于中药复方多药味、多组分质量评价体系以及多药味、多组分的含量测定和鉴别方法,建立的复合分析鉴定方法,有助于提高附子理中系列制剂的质量评价标准和临床用药的安全性,有效性;对于各药厂生产附子理中制剂提供了重要的理论依据,对于有效药效成分及含量确定,具有明显的指示。
附图说明:
图1为附子理中丸和汤样品的总离子流图(ESI+)(a:附子理中丸样品1的总离子流图;b:附子理中汤样品1的总离子流图);
图2为附子理中丸和附子理中汤的指纹图谱;
图3为附子理中丸和附子理中汤的PCA图;
图4为附子理中丸和附子理中汤的VIP图;
图5是附子理中制剂的指纹图谱的放大图。
具体实施方式
下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例,凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
仪器与试药
仪器
UPLC-Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(Thermo FisherScientific,USA),配有电喷雾电离(ESI)源和Xcalibur、Compound Discoverer数据系统;
ARSS4CN 1/10万型分析天平(Ohaus,USA);
Milli-Q超纯水仪(Millipore,USA);
DZ-20半自动中药制丸机(青州市精诚医药装备制造有限公司,CHN);
DL-720D超声机(上海之信仪器有限公司,CHN);
AllegraX-15R台式冷冻离心机(Becman,GER);
DW-86L338J海尔冰箱(青岛海尔特种电器有限公司,CHN);
试药
本发明中,适用于附子理中系列制剂,包括实验室自制药和市销中成药,故本次研究药物中附子理中丸按照《中国药典》2015版一部附子理中丸项下要求进行自制,附子理中汤无中成药销售,也按文献进行自制。但是本专利研究方法适用对象包括但不仅限于丸剂和汤剂,也适用于目前市售的片剂,颗粒剂等。
实施例1
一种附子理中制剂差异化合物检测及质量分析方法,具体包括如下步骤:
步骤1、采用UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪检测附子理中丸和附子理中汤共20批样品中各化学成分的保留时间(tR)和质谱信息。
样品的制备:
附子理中丸样品制备:
依照《中国药典》(2015版)第一部附子理中丸项下规定自制附子理中丸,将附子(制)10g,党参20g,炒白术15g,干姜10g,甘草10g,以上五味,粉碎成细粉,过筛,混匀。加适量的水泛丸,干燥至恒重。
称取3-4g附子理中丸,用研钵研细,精密称定粉末(含生药量2g),置于50mL具塞锥形瓶中,精密量取甲醇20ml并加入,密塞,称定重量,超声提取(功率300W,频率25kHz)45分钟,放冷,称重,补重,过滤,离心(5000r/min,5min),取上清液,过0.22微米微孔滤膜,即得丸剂样品,4℃冷藏。
附子理中汤样品制备:
称取附子(制)、干姜、白术(炒)、甘草、党参饮片分别10,10,15,10,20g。量取10倍的水加入1000mL烧杯中,称重,加入饮片,浸泡30min,用纱布将饮片与水分离,称重,补足吸水量,转移至自动煎药机中(武火煮沸,文火熬煮),煎煮1小时,过滤,再加入量取的8倍水煎煮半小时,合并续滤液,蒸发至略浓状,定容至100mL,摇匀,精密量取10mL于100mL圆底烧瓶中,旋转蒸发至流浸膏,精密量取65mL甲醇加入复溶,摇匀。取复溶溶液离心(5000r/min,5min),取上清液,过0.22微米微孔滤膜,即得汤剂样品,4℃冷藏。
混合标准品样品制备:
精密称取苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、6-姜酚、6-姜烯酚、甘草酸、甘草次酸、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、7-羟基香豆素各1mg,分别置于10mL容量瓶中,甲醇定容。再分别精密量取1mL置于10mL容量瓶中,甲醇定容,过0.22微米微孔滤膜,即得混合标准品样品,4℃冷藏。
在进行附子理中制剂差异化合物的质量分析过程中,共准备了10个批次的附子理中丸剂以及10个批次的附子理中汤剂样品以及标准混合样品的准备,所述标准混合样品用于后面化合物的鉴定。
上述样品在进行高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪UPLC-Q-Exactive-MS检测的色谱条件、流动相洗脱程序以及质谱条件如下所述:
色谱参数:
色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH-C18,50mm×2.1mm,1.7μm;
流动相为0.1%甲酸水溶液A(流动相A),0.1%甲酸乙腈溶液B(流动相B);
梯度洗脱顺序为:0-15min,95-70%;15-30min,70-48%;30-45min,48-25%;45-48min,25-15%;48-55min,15-2%;55-65min,2-2%;
流速为1.0mL/min,柱温为35℃,进样量为10μL;
质谱分析过程中参数为:
带鞘流气的电喷雾电离源,干燥气(N2),气体流量8.0L/min,雾化气温325℃,喷雾器压40psig,鞘流气温度350℃,鞘流气流量11L/min,毛细管电压4000V,Skimmer 65V,OCT1RFVpp 750V,裂解电压110V,化合物定性时二级质谱碰撞能量设置为10,20,30,40V,数据采集范围m/z 50~1200Da。
表1为UPLC-Q-Exactive的流动相洗脱程序
将所述高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪UPLC-Q-Exactive-MS检测得到的总离子流图和质谱信息在所述Xcalibur软件中进行色谱图优化处理,得到色谱图信号表、各峰保留时间及峰面积信息;所述优化处理包括平滑曲线以及基线扣除。可见总离子流图,如图1所示,在正离子模式(ESI+)下,被检测处出的成分较多,成分的响应值和分离度都较好。
为了保证不同制剂样品本身的稳定性,我们进行了指纹图谱分析,即通过指纹图谱对多批次的附子理中丸剂样品以及多批次的附子理中汤剂样品分别进行比对分析,得到不同批次的同一剂型的稳定共有成分,使得后续进行差异化合物分析的附子理中丸剂样品与附子理中汤剂样品的计算结果更加具备参考价值。
具体的,所述组内差异化合物的分析具体包括如下步骤:将10个批次的附子理中丸剂样品的样品文件和10个批次的附子理中汤剂样品文件分别导入至中药色谱指纹图谱相似度评价系统中,设置参照图谱和时间窗宽度,再进行多点矫正以及峰匹配,所述峰匹配设置为全谱峰匹配,最后导出匹配数据,通过匹配数据得到了不同批次的稳定的共有成分的数据信息;这一步对后续的组间的差异化合物的精确分析提供了保障。
如图2所示,S1-S10为对应的附子理中丸剂样品数据,S11-S20为对应的附子理中汤剂样品数据,样品间用不同颜色区分,一个点代表一个峰,从图中可看出大部分的峰在丸和汤剂的样品中都被检测出来,还有小部分峰更多的在汤或者丸剂样品中出现。将得到的匹配数据表导出,将匹配数据转换为可导入SIMCA软件的格式,并将表中0置换为液质联用质谱仪最低检测限值,避免假阳性;
将所述附子理中丸剂和所述附子理中汤剂分别得到的共有成分数据信息导入至SIMCA软件中建立数据库,将所述数据库分为附子理中丸组和附子理中汤组,并且分别对共有成分进行编号,然后采用主成分分析(PCA)模型初步分析组间各成分含量的差异性,结果显示R2X=0.71,Q2=0.42,这表明该模型稳定,附子理中丸组和附子理中汤组有明显的分离趋势,初步判断组间各成分含量具有差异性,如图3所示,除附子理中汤的样本T1,T2,T3有一定的偏离外,其余附子理中汤的样本之间聚集性好,附子理中丸样本间的聚集性均良好,表明相同制剂内部的相似性较好。附子理中丸和附子理中汤样本间有明显的分离性,表明附子理中丸和附子理中汤之间有较明显的差异性。在此基础上,进一步采用最小偏二乘判别分析(PLS-DA)中的变量载荷评价参数(VIP)值确定造成组间差异的因素,即具体化合物。结果显示R2Y=0.92,Q2=0.82,表明该模型稳定,预测能力较强,有40个大于VIP值大于1的化合物,既有40差异化合物,最后根据与标准样品的检测信息对比进一步确认化合物。将VIP>1作为两组间的标志性差异成分的筛选指标,如图4所示,最终得到40个区分附子理中丸剂和汤剂的标志性差异化合物。
差异化合物中一部分化学成分主要通过对比标准品的保留时间、分子离子和碎片离子进行准确鉴别;其他化合物主要通过Compound Discoverer 3.1软件化合物数据库和相关参考文献对比相关质谱信息,结合质谱和光谱数据进行推断。根据精确的准分子离子,如[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+等测定结果,利用Xcalibur 4.2等数据分析软件工具计算可能的分子式(误差±5ppm),同时考虑氮律、不饱和度和同位素分布规律,得到候选化合物,再结合采集的碎片离子进行结构比较,确定最有可能的结构。
通过结合PCA和PLS-DA分析得到40个差异化合物,其详细信息见表2:
表2为差异化合物的信息
*T代表汤剂;
*W代表丸剂。
通过上述分析方法,得到附子理中丸剂样品和附子理中汤剂样品之间的40个差异化合物,该差异化合物包括两种类型,一种是化合物的含量差异,就是说剂型的不同,制剂工艺不同,导致的化合物含量存在不同;另一种是由于不同的剂型导致的归属性化合物差异,也就是说,仅出现在丸剂或仅出现在汤剂中的化合物种类。
基于中药复方多药味、多组分质量评价体系以及多药味、多组分的含量测定和鉴别方法,建立了一套附子理中制剂差异化合物检测及质量复合分析鉴定方法,通过不同维度的差异化合物分析,有助于提高附子理中系列制剂的质量评价标准和临床用药的安全性、有效性。有利于促进我国中药复方制剂的现代化发展,为中药复方制剂进入国际医药市场也可以起到良好的助力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种附子理中制剂差异化合物的质量分析方法,其特征在于,
样品检测:将附子理中丸剂样品和附子理中汤剂样品分别采用高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪UPLC-Q-Exactive-MS进行检测;预处理:通过Xcalibur软件及Compound Discoverer软件对所述附子理中丸剂样品、所述附子理中汤剂样品检测得到的总离子流图和质谱数据进行预处理得到样品文件;具体的,将所述高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪UPLC-Q-Exactive-MS检测得到的总离子流图和质谱信息,在所述Xcalibur软件中进行色谱图优化处理,得到色谱图信号表、各峰保留时间及峰面积信息;所述优化处理包括平滑曲线以及基线扣除;
采用高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪UPLC-Q-Exactive-MS进行样品检测过程中,设置参数如下:
色谱条件:
色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH-C18,50 mm×2.1 mm,1.7 μm;
流动相A为0.1% 甲酸水溶液,流动相B为0.1% 甲酸乙腈溶液;
梯度洗脱顺序为:0-15min,95-70%的流动相A;15-30min,70-48%的流动相A;30-45min,48-25%的流动相A;45-48min,25-15%的流动相A;48-55min,15-2%的流动相A;55-65min,2-2%的流动相A;
流速为1.0mL/min,柱温为35℃,进样量为10μL;
质谱条件:
带鞘流气的电喷雾电离源ESI,正离子扫描;干燥气为N2,气体流量8.0 L/min,雾化气温325 ℃,喷雾器压40 psig,鞘流气温度350 ℃,鞘流气流量11 L/min,毛细管电压4000 V,Skimmer 65 V,OCT1 RFVpp 750 V,裂解电压110 V,化合物定性时二级质谱碰撞能量设置为10,20,30,40 V,数据采集范围m/z 50~1200 Da;
组内差异化合物分析:将多批次所述附子理中丸剂样品的样品文件导入至中药色谱指纹图谱相似度评价系统中,进行组内差异化合物分析,确定附子理中丸剂样品的共有成分;将多批次所述附子理中汤剂样品的样品文件导入至中药色谱指纹图谱相似度评价系统中,进行组内差异化合物分析,确定附子理中汤剂样品的共有成分;具体的,将多个批次的附子理中丸剂样品的样品文件导入至中药色谱指纹图谱相似度评价系统中,设置参照图谱和时间窗宽度,再进行多点矫正以及峰匹配,所述峰匹配设置为全谱峰匹配,最后导出匹配数据,通过匹配数据得到了不同批次的稳定的共有成分的数据信息;所述多个批次的附子理中汤剂样品的样品文件组内差异化合物分析步骤与所述附子理中丸剂样品的样品文件分析步骤相同;
主成分分析和最小偏二乘判别分析:通过SIMCA软件对附子理中丸剂样品的共有成分、附子理中汤剂样品的共有成分,依次进行主成分分析和最小偏二乘判别分析,得到最终的差异化合物;具体的,将所述附子理中丸剂样品的共有成分和所述附子理中汤剂样品的共有成分数据信息导入至SIMCA软件中建立数据库,将所述数据库分为附子理中丸组和附子理中汤组,并且分别对共有成分进行编号,然后采用主成分分析模型初步分析组间各成分含量的差异性,接着采用PLS-DA中的变量载荷评价参数值确定造成组间差异的因素,最终得到40个差异化合物。
2.根据权利要求1所述的附子理中制剂差异化合物的质量分析方法,其特征在于,所述40个差异化合物包括两类:第一类化合物为含量差异化合物,第二类化合物为剂型导致的差异归属性化合物;
所述第一类化合物包括Tauroursodeoxycholic acid、Eicosapentaenoic acid、monolinolein、Docosahexaenoic acid、8Z,11Z,14Z-Eicosatrienoic acid、Methylpalmitate、α-Eleostearic acid、5-Henicosyl-1,3-benzenediol、4-Phenylbutyricacid、Irgafos 168和Erucamide;
所述第二类化合物包括DL-Pipecolinic acid、Acetyl-L-carnitine、L-Pyroglutamicacid、P-Coumaric acid、L-Tyrosine、DL-Norleucine、Serotonin、Thymine、Phenylalanine、Pantothenic acid、2-quinolinecarboxylic acid、Kynurenic acid、(R)-Equol、NP-019374、2-Atractylenolide、Taurodeoxycholic Acid、Glycocholic acid、2-Amino-1,3-octadecanediol、Sphingosine、Cetrimonium、18-β-Glycyrrhetinic acid、4-Methoxycinnamic acid、Glycerophospho-N-palmitoyl ethanolamine、Oleamide、Eicosapentaenoic acid methyl ester、
Ricinoleic acid methy easter、Choline、Palmitoyl sphingomyelin和DL-Dipalmitoylphosphatidylcholine。
3.根据权利要求1所述的附子理中制剂差异化合物的质量分析方法,其特征在于,将共有成分数据信息中为0的数据替换成液质联用仪器最低检测限数据,然后导入至SIMCA软件中建立数据库。
4.如权利要求1-3任一项所述的附子理中制剂差异化合物的质量分析方法在附子理中制剂质量控制中的应用。
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