CN109270187B

CN109270187B - 一种基于代谢组学与全成分半定量分析的中药制剂质量评价方法

Info

Publication number: CN109270187B
Application number: CN201811299665.1A
Authority: CN
Inventors: 束雅春
Original assignee: Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine
Current assignee: Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2018-11-02
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2038-11-02
Also published as: CN109270187A

Abstract

本发明公开了一种基于代谢组学与全成分半定量分析的中药制剂质量评价方法，包括以下步骤：(1)取待评价制剂，和内标样品一起制成待测溶液，然后重复进样UPLC‑QTOF‑MS系统；(2)在正负离子模式下，采集数据，然后进行批量归一化分析；(3)利用上述处理的数据文件，通过数据库搜索和分子匹配生成化合物信息；(4)对于多元数据分析，通过提取的数据文件，从质量、保留时间和峰值区域的角度，利用分析软件对待评价制剂进行判别分类；(5)进行化学成分半定量分析，结合以上结果进行化合物鉴定。该方法可作为中药制剂全组分，全药味系统质量控制和评价切实可行的方法。

Description

一种基于代谢组学与全成分半定量分析的中药制剂质量评价方法

技术领域

本发明公开了一种基于代谢组学与全成分半定量分析的中药制剂质量评价方法，属于中药制剂质量评价技术领域。

背景技术

目前，中药制剂质量标准的建立,基本上是采用建立中药或制剂中某一(或某些)成分定性或定性和定量分析的模式。选定其中的“有效成分”、“活性成分”或“指标成分”，借鉴化学药品和国外植物药的质量控制方法和手段，建立该中药或制剂相应的鉴别和含量测定方法，包括理化鉴别、光谱、色谱鉴别及含量测定，近些年发展起来的指纹图谱技术、“一测多评”分析方法也取得了一定进展。这些中药分析方法和质量控制标准被逐步推广，并得到提高和改进。但总体而言，中药及其制剂化学成分与有效成分的多样性、复杂性以及相互间的协同作用，决定了以单一或少数成分为指标难以准确、全面地表达中药的内在质量，这些分析方法及质量标准尚未能较好体现传统中医的整体观，体现中药及其制剂多成分、多层次、多靶点的复杂特性，以及发挥药效的整体协同作用。

例如，银翘散为中国清代医家吴鞠通的名方，由金银花、连翘、薄荷、荆芥、牛蒡子、桔梗、淡豆豉、甘草、淡竹叶9味药组成，具有辛凉解表、清热解毒的功效，主要用于治疗流行性感冒、手足口病、咽喉炎、肺炎、急性扁桃腺炎、麻疹、流行性腮腺炎等病毒性感染疾病，是中医临床广泛使用且疗效确切的中药方剂之一。以银翘散为基础方，演变发展而来的一类中药制剂，统称为银翘类制剂^[3]，如银翘解毒片、银翘解毒丸、银翘解毒胶囊、银翘解毒颗粒等十多种不同剂型的制剂被广泛使用，这些制剂处方、功能主治均与银翘散汤剂相同，但生产厂家众多，生产工艺、所用辅料不尽相同，质量标准各异，加之原料药材来源、品种、产地、采收、加工炮制均不同，其化学成分及临床疗效因受各种因素影响也确有不同，因此如何建立银翘散这类中药制剂科学的质量标准成为当前研究的重要课题。

发明内容

发明目的：本发明目的是公开一种基于代谢组学与全成分半定量分析的中药制剂质量评价方法，该方法可作为中药制剂全组分，全药味系统质量控制和评价切实可行的方法。

技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于代谢组学与全成分半定量分析的中药制剂质量评价方法，包括以下步骤：

(1)取待评价制剂，和内标样品一起制成待测溶液，然后重复进样UPLC-QTOF-MS系统；

(2)在正负离子模式下，采集数据，然后进行批量归一化分析；

(3)利用上述处理的数据文件，通过数据库搜索和分子匹配生成化合物信息；

(4)对于多元数据分析，通过提取的数据文件，从质量、保留时间和峰值区域的角度，利用分析软件对待评价制剂进行判别分类；

(5)进行化学成分半定量分析，通过已知内标的浓度及特征，将其它化合物特征与峰值与内标比较，从而得到半定量分析结果。

优选，包括以下步骤：

(2)在正负离子模式下，首先运用数据采集软件Agilent MassHunter定性分析软件，然后使用Agilent Profinder软件进行批量归一化分析；

(3)将每一种剂型新的数据文件导入到Agilent专业(MPP)软件中，用于METLIN AM数据库搜索和分子匹配生成化合物信息；

(4)对于多元数据分析，通过Profinder软件提取的数据文件，从质量、保留时间和峰值区域的角度，导入MetaboAnalyst分析软件，分别选用PCA、PLS-DA、OPLS-DA 3种模式识别方法对待评价制剂进行判别分类；

(5)Mass Hunter定量分析软件用于化学成分半定量分析，通过已知内标的浓度及特征，将其它化合物特征与峰值与内标比较，从而得到半定量分析结果。

进一步优选：

步骤(2)的方法为：由Profinder软件的每个分子特性提取的数据文件和相应的数据文件由MassHunter数据采集软件导入到Agilent MassHunter定性分析软件中，提取一级、二级质谱数据，及保留时间等数据。

步骤(5)中Mass Hunter定量分析软件用于化学成分半定量分析的方法为：每一组数据的化合物信息及其相应的原始文件上传到Mass Hunter定量分析软件，所有的特征化合物都显示在软件上，设置保留时间窗口，通过已知内标的浓度及特征，将其它化合物特征与峰值与内标比较，从而得到半定量分析结果。

所述待评价制剂为利用中草药原料所制成的制剂。优选，所述待评价制剂为银翘类中药制剂。进一步优选，所述待评价制剂为银翘散汤剂、银翘散配方颗粒、银翘解毒丸和银翘解毒片。

本发明基于代谢组学与全成分半定量分析的中药制剂质量评价方法，尤其适用于中药制剂的质量评价，本发明以中医临床常用的银翘类制剂(银翘散汤剂、银翘散配方颗粒、银翘解毒片、银翘解毒丸)为研究对象，运用代谢组学及稳定同位素分析技术，采用LC-QTOF MS/MS现代分析手段，进行模式识别、全域扫描以及大数据分析的方法，对不同银翘类制剂化学成分进行定性与半定量分析，对化学信息进行综合评价，从而以银翘类制剂为例，构建中药及其制剂质量控制评价体系新模式，以体现中医整体观要求，体现中药及其制剂多组分、多靶点发挥药效的整体协同作用，推进中药制剂质量标准现代化和国际化，从而指导临床用药。

技术效果：相对于现有技术，本发明方法可作为中药制剂全组分，全药味系统质量控制和评价切实可行的方法，有利于尽快阐明中药“多组分”对复杂生物系统“多靶点、整体调节”作用的科学内涵，构建中药复方制剂多维结构的质量控制评价体系，并可广泛应用于不同产地、不同采收季节、不同药用部位中药材的质量评价，以及用不同炮制方法加工的中药饮片质量控制与标准研究，该方法的应用与推广将有利于指导创新药物研发，指导临床合理用药，推进中药质量标准的统一化和国际化。

附图说明

图1：银翘散四种剂型样品LC-QTOF MS/MS TIC色谱图--正离子模式(A-E)、负离子模式(F-J)；

图2：银翘散四种剂型样品6种指标性成分EIC图(IS浓度为1.69μM)；

图3：银翘散四种剂型样品Venn Diagram图；

图4：银翘散四种剂型样品PCA(A)、PLS(B)、OPLS(C)图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步详细的说明。

实施例

1.材料与方法

1.1试药

氢氧化铵与醋酸购于美国Sigma-Aldrich公司，乙腈与甲醇为色谱纯购于美国Fisher Scientific公司，超纯水由Barnstead

净化系统制得，(美国ThermoScientific公司)，电阻率为18.2MΩ-cm，内标Etoposide-d3购于加拿大Toronto ResearchChemicals公司。

银翘散汤剂复方饮片购于江苏省中医院，经朱育凤主任中药师鉴定为金银花(批号：150320)；连翘(批号：150718)；薄荷(批号：150701)；荆芥(批号：150313)；牛蒡子(批号：150601)；桔梗(批号150601)；淡豆豉(批号：150401)；甘草(批号：150701)；淡竹叶(批号：150302)。

银翘散配方颗粒购自南京中医药大学附属医院中药房，由中国江阴天江药业有限公司生产。炒牛蒡子(批号：1411156)；连翘(批号：1501092)；金银花(批号：1503112)；桔梗(批号：1503133)；薄荷(批号：1412140)；荆芥(批号：1501094)；淡豆豉(批号：1410023)；淡竹叶(批号：1501021)；甘草(批号：1502100)。

银翘解毒片(批号：140695)购自中国云南腾药制药股份有限公司。

银翘解毒丸(批号：14033352)购自北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂。

1.2内标溶液的制备

精密称定稳定同位素内标Etoposide-d3 1.00mg溶解在1.00mL甲醇中，得浓度为1.00mg/mL的内标储备液；再将储备液用甲醇稀释10倍，制成质量浓度为100μg/mL(or 169μM)的内标溶液，备用。

1.3药样溶液的制备

1.3.1银翘散汤剂样品溶液的制备

精密称取银翘散复方用量的饮片连翘(9g)、金银花(9g)、淡豆豉(5g)、苦桔梗(6g)、生甘草(5g)、竹叶(4g)、牛蒡子(9g)，加水696mL(12倍量)，浸泡30min，用传统砂锅武火煮沸后，改用文火煎煮15min，其中汤剂煎煮10min时，加入后下饮片薄荷(6g)、荆芥(5g)煎煮5min；趁热滤出药液，加超纯水定容至500mL，摇匀，静置30min，取上清液3mL，加入6.9mL甲醇，加入100μL 0.1mg/mL的Etoposide-d3内标溶液，涡旋30S，取上清液以4℃18000×g/min离心10min，移取上清液，进样5μL。

1.3.2银翘解毒片样品溶液的制备

精密称量银翘解毒片1片489.09mg，加入超纯水40.76mL，浸泡90min，涡旋3min，超声30min，静置30min，取上清液3mL，加入6.9mL甲醇，加入100μL 0.1mg/mL的Etoposide-d3内标溶液，涡旋30S，取上清液以4℃18000×g/min离心10min，移取上清液，进样5μL。

1.3.3银翘解毒丸样品溶液的制备

精密称量银翘解毒丸14粒1431.79mg，加入超纯水39.78mL，浸泡90min，涡旋3min，超声30min，静置30min，取上清液3mL，加入6.9mL甲醇，加入100μL 0.1mg/mL的Etoposide-d3内标溶液，涡旋30S，取上清液以4℃18000×g/min离心10min，移取上清液，进样5μL。

1.3.4银翘散配方颗粒样品溶液的制备

经折算后的与银翘散传统饮片等量的单味药配方颗粒，每味药同比例精密称量银翘散9味饮片配方颗粒554.64mg，加入100℃热开水40mL冲兑，搅拌混匀，浸泡30min，放凉，涡旋1min，静置30min，取上清液3mL，加入6.9mL甲醇，加入100μL 0.1mg/mL的Etoposide-d3内标溶液，涡旋30S，取上清液以4℃18000×g/min离心10min，移取上清液，进样5μL。

1.4质量控制样品的制备

按照2.3.1-2.3.4项下的制备方法分别将四种剂型样品取200μL，将其混合成800μL，用于实验样品质量与重复性检验，以及49种公共化合物的分析。

1.5UPLC-QTOF-MS系统

Agilent 1290系列液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括溶剂储备器，在线脱气机，G4220A二元梯度泵、G1330B自动调温器、G4226A高性能自动进样器，G1316C柱温箱和G4212A二极管阵列检测器；Agilent 6540四极杆-飞行时间质谱仪(美国Agilent公司)，配备电喷雾离子源(AJS-ESI)。

色谱条件：色谱柱为Waters超高效液相色谱柱(Milford,MA,美国)BEH C18(2.1mmi.d.×100mm,1.7μm,

)，内联高性能的滤过器(0.5μm,不锈钢制品)购于UpchurchScientific公司(Oak Harbor,WA,美国)，正离子流动相A:0.1％醋酸溶液，B:乙腈；负离子流动相A:0.05％氢氧化铵溶液，B:乙腈；梯度洗脱：0-4min,5％B；4-7min,5％-10％B；7-20min,10％-15％B；20-30min,15％-22％B；30-35min,22％-35％B；35-40min,35％-50％B；40-45min,50％-70％B；45-50min,70％-90％B；50-52min,5％B；52-60min,5％B。流速:0.4mL/min，柱温:60℃；进样量:5μL；在分析样品之前，该色谱柱与移动相平衡至少30min，流速为0.4mL/min。

质谱条件：电喷雾离子源，采用正离子(ESI+)和负离子(ESI-)模式扫描，使用Agilent MassHunter数据采集软件(版本B.05.01)为每个ESI模式获取色谱和光谱数据(.d)。质谱仪的操作参数如下：干燥气体(N₂)温度：350℃；干燥气流速10.0L/min；雾化气压(N₂)，35psi；鞘气流速：11.0L/min；鞘气(N₂)温度，325℃；毛细管电压：4000V；喷嘴电压，500V；碎裂电压：100V；锥孔电压：65V；碰撞能量(CE)：10、20和40eV。扫描范围50m/z-1000m/z为保持质量精准，质谱仪在分析前进行校准，采用内部实时质量校正，正离子模式的校准溶液在m/z 121.0508和922.0098m/z，负离子模式的校准溶液在112.9885m/z和1033.9881m/z，贯穿整个采集过程。

1.6方法验证

通过获得的质谱数据，构建PCA分数图，并对49种共有化合物进行鉴定，全成分半定量分析，经过对4种银翘类制剂样品的重复检测，对UPLC-QTOF-MS方法的重复性进行评估。

1.7数据处理、成分鉴定与统计分析

银翘散四种剂型多次重复进样，在正负离子模式下，首先运用数据采集软件Agilent MassHunter定性分析软件(版本：B.06.00)，然后使用Agilent Profinder软件(版本B.06.00)进行批量归一化分析。由Profinder软件的每个分子特性提取的数据文件(.cef)和相应的数据文件(.d)由MassHunter数据采集软件导入到Agilent MassHunter定性分析软件中，提取一级、二级质谱数据，及保留时间等数据；然后将每一种剂型新的数据文件(.cef)导入到Agilent专业(MPP)软件(版本：B.11.1)中，用于METLIN AM数据库搜索和分子匹配生成化合物信息。对于多元数据分析，通过Profinder软件提取的数据文件(.csv)，从质量、保留时间和峰值区域的角度，导入了MetaboAnalyst 4.0分析软件，分别选用PCA、PLS-DA、OPLS-DA 3种模式识别方法对四种银翘类制剂进行了判别分类。

1.8半定量分析方法

Mass Hunter定量分析软件(版本：B.06.00)用于化学成分半定量分析。每一组数据的化合物信息及其相应的原始文件通过CEF和.d文件被上传到该软件。所有的特征化合物都显示在软件上，保留时间窗口被设置为0.5分钟。选择的内标Etoposide-d3，质量浓度为100μg/mL(or 169μM)，通过已知内标的浓度及特征，将其它化合物特征与峰值与内标比较，从而得到半定量分析结果，在半定量过程完成后，导出了一个Excel文件，其中包括质荷比(m/z)，保留时间(RT)，峰值区域(PA)，以及所有化合物特征及其计算后的浓度。

2.实验结果

2.1回收率实验

取内标Etoposide-d3适量，精密称定，用甲醇溶解并稀释制成质量浓度为0.1mg/mL的内标溶液，备用。取超纯水3mL，加入6.9mL甲醇，加入100μL Etoposide-d3内标溶液，涡旋30S，取上清液以4℃18000×g/min离心10min，移取上清液，进样。制备内标溶液3份，分别进样5μL。

取已知含量的银翘散汤剂、银翘散配方颗粒、银翘解毒片、银翘解毒丸样品分别按2.3.1、2.3.2、2.3.3、2.3.4项下加入100μL内标溶液制备，分别取供试品各3份，进样5μL，计算内标Etoposide-d3的回收率。结果见表1。

表1银翘散样品基质对内标测定的影响

^a[IS]＝1.69μM；^bA_IS＝mean peak area of the spiked IS；^cSD＝standarddeviation

^dMF_IS＝(PA_IS in the extracted sample matrix)/(PA_IS in the solution)

2.2银翘散四种剂型化学成分定性分析结果

按上述实验方法和条件，对银翘散汤剂、银翘散配方颗粒、银翘解毒片、银翘解毒丸四种制剂化学成分进行定性与半定量分析，采用正、负离子两种模式分别进行数据采集，结果正、负离子模式中响应峰均较多，银翘散汤剂共鉴别出302个化合物，其中正离子模式中鉴别出确认名称的化合物158个，未确认名称的化合物37个，负离子模式中鉴别出确认名称的化合物21个，未确认名称的化合物86个；银翘散配方颗粒共鉴别出434个化合物，其中正离子模式中鉴别出确认名称的化合物79个，未确认名称的化合物177个，负离子模式中鉴别出确认名称的化合物36个，未确认名称的化合物142个；银翘解毒丸共鉴别出427个化合物，其中正离子模式中鉴别出确认名称的化合物67个，未确认名称的化合物186个，负离子模式中鉴别出确认名称的化合物38个，未确认名称的化合物136个；银翘解毒片共鉴别出388个化合物，其中正离子模式中鉴别出确认名称的化合物91个，未确认名称的化合物163个，负离子模式中鉴别出确认名称的化合物24个，未确认名称的化合物110个；四种银翘散制剂共有化合物104个，确认名称的化合物49个，未确认名称的化合物55个。结果分别见图1-4，表2-5。

表2四种银翘散剂型化学成分总表

表3银翘散四种剂型中已鉴定共有化学成分表

*Marker constituents

表4银翘散四种剂型检测(未确认名称)共有化学成分表

表5.半定量分析银翘散四种剂型49种共有化合物(n＝3)

*Marker constituents.D＝decoction；G＝granule；T＝tablet；P＝pill.

3结论

近年来，代谢组学向着一体化、定量化及整合化趋势发展，其以组群指标分析为基础，采用高灵敏度、高通量和高特异性的现代分析仪器技术，并结合模式识别，如主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)等多变量统计数据分析方法，研究机体在受外界干扰后其代谢产物的变化规律。随着分析技术的发展，UPLC/Q-TOF-MS系统在分析领域特别是药物代谢和代谢组学方面正被越来越广泛的应用。它以超高的分离能力和高准确度、高精密度的质量分析能力以及可以提供高准确度的离子碎片等特点，被认为是对复杂系统进行定性研究的第一选择，其相应的定量方法也在不断发展，其中同位素标记内标法因其不需要对照品，只需选择合适的内标物质，在定量代谢组学研究领域得到广泛应用。该法采用同位素标记选定好的内标物，将标记后的内标物与样品混合进行分析，再根据同位素信号，计算得到相关待测物的含量。其中稳定同位素内标被认为是LC-MS/MS定量分析方法最理性的内标。本发明选用的稳定同位素内标Etoposide-d3因与待测物的结构类似，有着相似的物理化学性质、色谱保留时间和质谱裂解方式一致，可有效校正基质效应，保证分析结果的准确性和重现性，可对银翘类制剂这样的复杂系统全成分进行半定量分析研究。

近几年，王智民等也提出了一测多评(quantitative analysis of multi-components by Single Marker，QAMS)的多指标质控模式，即在多指标质量控制时,利用中药有效成分内在函数关系和比例关系,以药材中对照品廉价易得的典型成分为内标,建立该成分与其他成分间的相对校正因子,再通过校正因子同步计算出其他成分的含量。在方法实施时,可在只有一个对照品的情况下，实现这些成分的同步含量测定。但一测多评应用范围定位于中药复杂体系中同类成分(结构母核相似仅取代基不同)之间的评价是可行的，在不同结构母核的化学成分类别之间使用该法仍需深入研究；一测多评法选择的内标未必是反应该中药的指标性成分或活性成分；且当各待测成分含量差距悬殊时，其显示出有一定局限性。本发明与一侧多评法虽然都是选择内标对相关成分进行定量分析，但原理与方法各不相同。本发明基于高效液相色谱-串联四极杆质谱联用技术，将代谢组学方法及稳定性同位素内标应用于银翘类制剂化学成分的定性与半定量分析方法，取得了较好的定量效果、较高的重复性，不仅能反映中药制剂中的共有信息，还能够推断差异存在的原因，与中医药防病治病的整体观念不谋而合。

根据研究结果所示，不同厂家，不同制备工艺生产出来的银翘类制剂化学成分在数量与含量上均有较大差异。银翘散汤剂共鉴别出302个化合物；银翘散配方颗粒共鉴别出434个化合物；银翘解毒丸共鉴别出427个化合物；银翘解毒片共鉴别出388个化合物。虽然每种剂型均鉴定出300至400多个化合物，但其中四种银翘散制剂共有化合物只有104个(见图3)，其它成分均不同。从104种共有化合物中已鉴定名称的化学成分半定量分析结果(表5)来看，即使同一种成分，其在不同剂型中的含量也具有显著性差异，本发明分别将配方颗粒、银翘解毒丸、银翘解毒片与银翘散汤剂相比较，同一个成分含量可以相差几十倍。另一方面，在本发明中分别选用PCA，PLS-DA或OPLS-DA3种模式识别方法对四种银翘类制剂进行了判别分类(见图4)，结果显示：3种模式识别分析均可以对四种银翘类制剂做出正确分类，且四种剂型可以有效地区分。综上所述，四种银翘类制剂化学成分之间具有显著差异，分析其原因，可能由于中药材具有多基原、多产地的属性，其化学成分及药材质量有差异，除此以外，外在因素包括药材品种、栽培种植及产地生态环境、采收加工、炮制、运输贮藏条件、以及不同剂型的生产过程中提取、纯化、加辅料、生产工艺等均不同，加之内在因素包括药物传输途径、复方及各成分之间交互作用均会对其内在化学成分及产品质量造成影响，从而不同厂家生产的银翘类制剂有明显差异。

随着当前科技的发展，指纹图谱技术、“一测多评”分析方法虽取得了一定进展，但在我国中药制剂质量控制过程中仍存在一些问题，主要为中药及其制剂化学成分与有效成分的多样性、复杂性以及相互间的协同作用，决定了以单一或少数成分为指标难以准确、全面地表达中药的内在质量，中药及其制剂多成分、多层次、多靶点的复杂特性，以及发挥药效的整体协同作用未能得到有效体现。

因此基于代谢组学方法及稳定性同位素分析技术，LC-QTOF MS/MS全域扫描方法，定性与半定量分析银翘散四种制剂化学成分，通过大数据分析，模式识别方法建立PCA，PLS或OPLS质量控制模型，能够更为真实地全面反映中药制剂的内在品质，所构建的模型均具有良好的组间分离度和稳定性，实现对银翘类不同制剂的准确分类与鉴别，以保证临床应用的疗效，并为中药制剂质量控制和品质评价奠定基础。该方法可作为中药制剂全组分，全药味系统质量控制和评价切实可行的方法，有利于尽快阐明中药“多组分”对复杂生物系统“多靶点、整体调节”作用的科学内涵，构建中药复方制剂多维结构的质量控制评价体系，并可广泛应用于不同产地、不同采收季节、不同药用部位中药材的质量评价，以及用不同炮制方法加工的中药饮片质量控制与标准研究，该方法的应用与推广将有利于指导创新药物研发，指导临床合理用药，推进中药质量标准的统一化和国际化。

Claims

1.一种基于代谢组学与全成分半定量分析的中药制剂质量评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取待评价银翘类中药制剂，加入内标样品Etoposide-d3一起制成待测溶液，然后重复进样UPLC- QTOF-MS系统；所述UPLC-QTOF-MS 系统中色谱柱为Waters 超高效液相色谱柱BEH C18，内联高性能的滤过器，正离子流动相 A: 0.1 % 醋酸溶液，B: 乙腈；负离子流动相 A: 0.05% 氢氧化铵溶液，B: 乙腈；梯度洗脱：0 - 4 min，5% B； 4 - 7 min，5% -10% B； 7 - 20 min，10% - 15% B； 20 - 30 min，15% - 22% B；30 - 35 min， 22% - 35%B；35 - 40 min，35% - 50% B； 40 - 45 min， 50% - 70% B；45 - 50 min，70% - 90% B；50 - 52 min， 5% B；52 - 60 min, 5% B；流速: 0.4 mL/min，柱温: 60℃；进样量: 5μL；在分析样品之前，该色谱柱与流动相平衡至少30 min，流速为0.4 mL/min；质谱条件：电喷雾离子源，采用正离子ESI+ 和负离子 ESI- 模式扫描，使用Agilent MassHunter数据采集软件，版本B.05.01，为每个ESI模式获取色谱和光谱数据；质谱仪的操作参数如下：干燥气体N₂温度：350°C；干燥气流速10.0 L/min；雾化气压N₂，35 psi；鞘气流速：11.0 L/min；鞘气N₂温度，325°C；毛细管电压：4000V；喷嘴电压，500V；碎裂电压：100V；锥孔电压：65V；碰撞能量（CE）：10、20和40 eV；扫描范围50 m/z-1000 m/z，采用内部实时质量校正，正离子模式的校准溶液在m / z 121.0508和922.0098 m / z，负离子模式的校准溶液在112.9885 m / z和1033.9881 m / z，贯穿整个采集过程；

（2）在正负离子模式下，采集数据，然后进行批量归一化分析；

（3）利用上述步骤（2）处理的数据文件，导入到Agilent专业MPP软件中，通过数据库搜索和分子匹配生成化合物信息；

（4）对于多元数据分析，通过提取的数据文件，从质量、保留时间和峰值区域的角度，利用分析软件对待评价制剂进行判别分类；

（5）进行化学成分半定量分析，通过已知内标的浓度及特征，将其它化合物特征与峰值与内标比较，从而得到半定量分析结果。

2.根据权利要求1所述的基于代谢组学与全成分半定量分析的中药制剂质量评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取待评价制剂，加入内标样品一起制成待测溶液，然后重复进样UPLC- QTOF-MS系统；

（2）在正负离子模式下，首先运用数据采集软件Agilent MassHunter定性分析软件，然后使用Agilent Profinder软件进行批量归一化分析；

（3）将每一种剂型新的数据文件导入到Agilent专业MPP软件中，用于METLIN AM数据库搜索和分子匹配生成化合物信息；

（4）对于多元数据分析，通过Profinder软件提取的数据文件，从质量、保留时间和峰值区域的角度，导入MetaboAnalyst分析软件，分别选用PCA、PLS-DA、OPLS-DA 3种模式识别方法对待评价制剂进行判别分类；

（5）Mass Hunter定量分析软件用于化学成分半定量分析，通过已知内标的浓度及特征，将其它化合物特征与峰值与内标比较，从而得到半定量分析结果。

3.根据权利要求2所述的基于代谢组学与全成分半定量分析的中药制剂质量评价方法，其特征在于，步骤（2）的方法为：由Profinder软件的每个分子特征提取的数据文件和相应的数据文件由MassHunter数据采集软件导入到Agilent MassHunter定性分析软件中，提取一级、二级质谱数据，及保留时间数据。

4.根据权利要求2所述的基于代谢组学与全成分半定量分析的中药制剂质量评价方法，其特征在于，步骤（5）中Mass Hunter定量分析软件用于化学成分半定量分析的方法为：每一组数据的化合物信息及其相应的原始文件上传到Mass Hunter定量分析软件，所有的特征化合物都显示在软件上，设置保留时间窗口，通过已知内标的浓度及特征，将其它化合物特征与峰值与内标比较，从而得到半定量分析结果。

5.根据权利要求1所述的基于代谢组学与全成分半定量分析的中药制剂质量评价方法，其特征在于，所述银翘类中药制剂为银翘散汤剂、银翘散配方颗粒、银翘解毒丸和银翘解毒片。