CN104198574A - 五倍子药材的双重指纹图谱质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
五倍子药材的双重指纹图谱质量控制方法，包括：步骤1、采用ICP-MS法测定每一来源的五倍子药材的无机元素，得到ICP-MS分析数据，建立五倍子药材无机元素的指纹图谱；步骤2、采用HPLC法测定每一来源的五倍子药材的有机成分，得到HPLC分析数据，建立五倍子药材有机成分的色谱指纹图谱；步骤3、所述步骤1中无机元素ICP-MS分析数据进行系统聚类分析；步骤4、所述步骤2中有机成分的HPLC分析数据进行系统聚类分析；步骤5、综合分析所述五倍子药材无机元素的指纹图谱及聚类分析与所述五倍子药材有机成分的色谱指纹图谱及聚类分析，评价五倍子药材的质量。本发明可为全面控制五倍子药材的质量提供依据，有效避免单一分析评价五倍子药材质量的片面性。
Description
技术领域
本发明涉及中药药材的质量控制方法，尤其涉及一种五倍子药材的双重指纹图谱质量控制方法。
背景技术
五倍子（Galla chinensis）为漆树科植物盐肤木（Rhus chinensis Mill.）、青麸杨（Rhus potaninii Maxim.）或红麸杨（Rhus punjabensis Stew.var.sinica（Diels）Rehd.et Wils.）叶上的虫瘿，主要由五倍子蚜（Melaphis chinensis（Bell）Baker）寄生而形成，其化学成分有五倍子鞣质、没食子酸、脂肪、树脂、蜡质及无机盐等。秋季采摘，置沸水中略煮或蒸至表面呈灰色，杀死蚜虫，取出，干燥；按外形不同，分为“肚倍”和“角倍”。
中药指纹图谱指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段，中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要的意义。
中药作用的物质基础主要包括两部分，一是有机成分，二是无机元素。无机元素是指存在于人、植物和动物机体中含量极低的，除碳、氢、氧和氮主要以有机化合物形式存在外，其余的元素的总称，统称为无机盐（矿物质或灰分）。虽然无机元素的含量极低，但在有机体内的生命过程中起着特别重要的作用。有机成分和无机元素在人体内起着互相协调、互相制约的作用，并参与体内各种生化反应，促进机体的自身调节，趋于新的阴阳平衡，从而达到治疗的目的。
目前，广大学者对五倍子的研究主要集中于其有机成分，对其无机元素的研究较少，且单一的从有机成分角度或者无机元素角度评价五倍子药材的质量，这使得五倍子药材的质量控制并不全面。因此，为了给五倍子药材的深入研究提供依据，解决五倍子药材质量控制不全面的问题，对五倍子药材质量的全面控制方法有待于开发建立。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种五倍子药材的双重指纹图谱质量控制方法，可为全面控制五倍子药材的质量提供依据，有效避免了单一分析评价五倍子药材质量的片面性。
为实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案，具体步骤为。
步骤1、采用ICP-MS法（Inductively coupled plasma mass spectrometry,电感耦合等离子体质谱）测定每一来源的五倍子药材的无机元素，得到ICP-MS分析数据，建立五倍子药材无机元素的指纹图谱。
步骤2、采用HPLC法（High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱法）测定每一来源的五倍子药材的有机成分，得到HPLC分析数据，建立五倍子药材有机成分的色谱指纹图谱。
步骤3、所述步骤1中五倍子药材无机元素的ICP-MS分析数据进行系统聚类分析。
步骤4、所述步骤2中五倍子药材有机成分的HPLC分析数据进行系统聚类分析。
步骤5、综合分析所述五倍子药材无机元素的指纹图谱及聚类分析与所述五倍子药材有机成分的色谱指纹图谱及聚类分析，评价五倍子药材的质量。
所述步骤1包括。
（1）样品预备：将每一来源的五倍子药材敲开，去除内部虫卵后，充分粉碎，过80目筛，备用。
（2）微波消解。
①、取每一来源的五倍子药材粉末样品0.2g，精密称定（精确至0.00001g），放入微波消解仪中。
②、按照每1g五倍子药材样品中加入20-40mL浓硝酸的比例，进行样品消化。
③、采用压力主控的微波消解方法，确定微波消解条件如下。
| 压力（MPa） | 时间（min） | 功率（W） |
| 0.3 | 4 | 800 |
| 0.6 | 4 | 800 |
| 1.0 | 4 | 800 |
| 1.5 | 8 | 800 |
④、样品消解完成后，取下冷却至室温，将微波消解仪中的消解液转移至塑料容量瓶中，得到微波消解液样品，待测。
⑤、相同方法处理空白溶剂进行空白试验，即：在未加五倍子药材粉末样品的空白微波消解仪中，按照上述步骤②中相同的浓硝酸用量，进行样品消化，其他步骤同上述步骤③、④，最终定容溶液为空白溶液。
（3）、ICP-MS测定每一来源的五倍子药材中的无机元素：依次将单元素标准储备溶液、空白溶液、及上述步骤（2）中的每一来源的五倍子药材的微波消解液样品引入仪器，在线加入内标液，进行无机元素ICP-MS半定量分析测定，得到ICP-MS分析数据。
具体的ICP-MS测定条件如下。
| 工作条件 | 参数 |
| RF功率 | 1300 W |
| 等离子体流速 | 15.0 L·min-1 |
| 载气流速 | 1.13 L·min-1 |
| 采样深度 | 8.2 mm |
| 雾化室温度 | 2℃ |
| 分析时间/质量 | 0.3 |
（4）、五倍子药材无机元素指纹图谱的建立：所述ICP-MS分析数据经归纳整理后，绘制五倍子药材无机元素的指纹图谱。
所述步骤2包括。
（1）样品预备：将每一来源的五倍子药材敲开，去除内部虫卵后，充分粉碎，过80目筛，备用。
（2）供试品溶液的制备：取五倍子药材粉末0.1g，精密称定（精确至0.00001g），用10mL甲醇超声提取半小时，放至室温，过滤，滤液置容量瓶中，所述滤液用甲醇稀释并定容至刻度，制成每毫升含5mg五倍子药材的溶液，摇匀，滤过，取续滤液，备用。
（3）对照品溶液的制备：以没食子酸为内参照物，取没食子酸对照品9.7mg（精确至0.00001g），用甲醇溶解稀释，滤过，制成0.097 mg·mL-1的对照品溶液。没食子酸为五倍子水溶性成分中的主要药效成分之一，含量较大且容易辨认，将其选为参照物。
（4）HPLC法测定每一来源的五倍子药材有机成分。
①、色谱条件：采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相A为甲醇-乙腈（v:v=3:1）及B为0.2%磷酸水溶液，0-16min，1%A-2%A，16-43min，10%A-11%A，43-65min，18%A，65-125min，20%A-25%A；柱温为27℃；流速为0.8mL·min-1；进样量10μL；检测波长280nm。
②、测定：取供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，得到HPLC分析数据。
（5）五倍子药材有机成分色谱指纹图谱的建立：所述HPLC分析数据经归纳整理后，绘制五倍子药材有机成分的色谱指纹图谱。
采用10批不同来源的五倍子药材，分别记为：Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10。
所述步骤1中ICP-MS测定的无机元素为18种，分别为：B、Mg、Al、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Ga、Rb、Sr、Ba、Ce、Pb。
所述步骤（3）中单元素标准储备溶液为K、Ca、Na、Mg、Fe、Al、Cr、As，该单元素标准储备溶液浓度为1000μg·mL-1。
所述步骤（3）中内标液为 Li、Sc、Ge、Y、In、Tb、Bi，该内标液浓度为10μg·mL-1。
所述步骤3中采用SPSS软件对ICP-MS分析所得数据进行系统聚类分析，采用链内平均链锁法，利用欧式距离平方为测度。
所述步骤4中采用SPSS软件对HPLC分析所得数据进行系统聚类分析，采用链内平均链锁法，利用欧式距离平方为测度。
与现有技术相比本发明的有益效果。
本发明提供一种五倍子药材的双重指纹图谱质量控制方法，采用ICP-MS法建立五倍子药材无机元素指纹图谱并聚类分析，通过优化微波消解条件和ICP—MS的各项参数，可以高效、简便、快速的对五倍子药材中18种无机元素进行半定量分析检测，有效的从无机元素的角度表征五倍子药材的质量；采用HPLC法建立五倍子药材有机成分的色谱指纹图谱并聚类分析，进而从有机成分的角度表征五倍子药材的质量。本发明通过综合分析无机元素和有机成分的双重指纹图谱及聚类分析结果，更好的揭示药物无机元素、有机组分之间的联系，可以更全面的控制五倍子药材的质量，避免因测定个别化学成分而判定五倍子药材整体质量的片面性。
附图说明
图1为本发明五倍子药材的双重指纹图谱质量控制方法流程图。
图2为本发明不同来源的五倍子药材无机元素指纹图谱。
图3为本发明不同来源的五倍子药材的无机元素聚类谱系图。
图4为本发明不同来源的五倍子药材有机成分色谱指纹图谱。
图5为本发明不同来源的五倍子药材的有机成分聚类谱系图。
具体实施方式
一、仪器与试药。
1、仪器：电子天平（AB135-S，双量程，可读性0.01/0.1mg，瑞士Mettler-Toledo公司）；电感耦合等离子体质谱仪（安捷伦7500a，美国安捷伦科技有限公司）；高效液相色谱仪（安捷伦1100，美国安捷伦科技有限公司）；微波系统的消解仪（MDS-6，上海新仪微波化学科技有限公司）；超纯水处理装置（Milli-Q，美国Millipore公司）；微量移液器（M100，法国吉尔森公司）；高速微型粉碎机（FW-80，中兴仪器有限公司）；色谱柱（型号Luna C18（2），250mm×4.6mm, 5μm，广州菲罗门科学仪器有限公司）。
2、试剂及试药：单元素标准储备溶液：K、Ca、Na、Mg、Fe、Al、Cr、As储备溶液浓度为1000μg·mL-1，均由国家标准物质研究中心提供，根据测试需要稀释后使用；调谐液 Li、Y、Ce、Ti、Co浓度为10μg·mL-1（美国Agilent公司）；内标液 Li、Sc、Ge、Y、In、Tb、Bi浓度为10μg·mL-1（美国Agilent公司）；高纯氩气（氩体积分数＞99.99﹪）；没食子酸对照品（批号110831-200302，购自中国药品生物制品检定所）；甲醇（色谱纯，中国天津科密欧化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，中国天津科密欧化学试剂有限公司）；磷酸（色谱纯，中国天津科密欧化学试剂有限公司）；超纯水（18.2 MΩ）；硝酸（优级纯，中国天津科密欧化学试剂有限公司）。
3、药材：本发明共收集了10批不同来源的五倍子药材样品进行实验，分别记为：Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10。药材样品来源及分类参见表1。
表1：药材样品来源及分类。
| 序号 | 品种 | 来源 | 分类 |
| Y1 | Galla chinensis | 湖南 | 角倍 |
| Y2 | Galla chinensis | 湖南 | 肚倍 |
| Y3 | Galla chinensis | 大连 | 角倍 |
| Y4 | Galla chinensis | 大连 | 肚倍 |
| Y5 | Galla chinensis | 四川 | 肚倍 |
| Y6 | Galla chinensis | 四川 | 角倍 |
| Y7 | Galla chinensis | 四川 | 角倍 |
| Y8 | Galla chinensis | 湖南 | 肚倍 |
| Y9 | Galla chinensis | 湖北 | 角倍 |
| Y10 | Galla chinensis | 四川 | 肚倍 |
二、实验部分。
请参阅图1，为图1为本发明五倍子药材的双重指纹图谱质量控制方法流程图。步骤1、采用ICP-MS法测定每一来源的五倍子药材的无机元素，得到ICP-MS分析数据，建立五倍子药材无机元素的指纹图谱。具体步骤包括。
（1）样品预备：将每一来源的五倍子药材敲开，去除内部虫卵后，用粉碎机充分粉碎，过80目筛，备用。
（2）微波消解：本发明通过对微波消解条件进行优化，确定微波消解方法为：①、取每一来源的五倍子药材粉末样品0.2g，精密称定（精确至0.00001g），放入微波消解仪中。
②、按照每1g五倍子药材样品中加入20-40mL浓硝酸的比例，进行样品消化；浓硝酸是消化有机样品的氧化试剂，可以酸化五倍子药材，进而达到在微波产生的高温高压下使五倍子药材被消化分解的目的。
③、采用压力主控的微波消解方法，优化时间、功率等参数，确定微波消解条件，如表2所示。
表2：微波消解条件。
| 压力（MPa） | 时间（min） | 功率（W） |
| 0.3 | 4 | 800 |
| 0.6 | 4 | 800 |
| 1.0 | 4 | 800 |
| 1.5 | 8 | 800 |
④、样品消解完成后，取下冷却至室温，将微波消解仪中的消解液转移至50mL塑料容量瓶中，得到微波消解液样品，待测。
⑤、相同方法处理空白溶剂进行空白试验，即：在未加五倍子药材粉末样品的空白微波消解仪中，按照上述步骤②中相同的浓硝酸用量，进行样品消化，其他步骤同上述步骤③、④，最终定容溶液为空白溶液。
（3）ICP-MS测定每一来源的五倍子药材中的无机元素：在测定五倍子药材样品之前，为减小实验误差，分别用硝酸、水、空白溶液冲洗ICP-MS系统和流路，按仪器说明调谐仪器灵敏度、相对标准偏差（RSD%）、氧化物双电荷、质量轴等参数。依次对空白溶液和上述步骤②中的每一来源的五倍子药材的微波消解液样品，进行无机元素ICP-MS半定量分析测定，得到ICP-MS分析数据。在五倍子药材的微波消解液样品测定时，在线加入适度稀释的内标液，用以减轻基体效应并补偿信号漂移。具体的ICP-MS测定条件，如表3所示。
表3：ICP-MS测定条件。
| 工作条件 | 参数 |
| RF功率 | 1300 W |
| 等离子体流速 | 15.0 L·min-1 |
| 载气流速 | 1.13 L·min-1 |
| 采样深度 | 8.2 mm |
| 雾化室温度 | 2℃ |
| 分析时间/质量 | 0.3 |
（4）五倍子药材无机元素指纹图谱的建立：所述ICP-MS分析数据经归纳整理后，绘制五倍子药材无机元素的指纹图谱。
步骤2、采用HPLC法测定每一来源的五倍子药材的有机成分，得到HPLC分析数据，建立五倍子药材有机成分的色谱指纹图谱。具体步骤包括。
（1）样品预备：将每一来源的五倍子药材敲开，去除内部虫卵后，充分粉碎，过80目筛，备用。
（2）供试品溶液的制备：取五倍子药材粉末0.1g，精密称定（精确至0.00001g），用10mL甲醇超声提取半小时，放至室温，过滤，滤液置容量瓶中，所述滤液用甲醇稀释并定容至刻度，制成每毫升含5mg五倍子药材的溶液，摇匀，滤过，取续滤液，备用。
（3）对照品溶液的制备：以没食子酸为内参照物，精密称取没食子酸对照品9.7mg（精确至0.00001g），用甲醇溶解稀释，滤过，制成0.097 mg·mL-1的对照品溶液。
（4）HPLC法测定每一来源的五倍子药材有机成分。
①、色谱条件：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱（型号为Luna C18（2），250mm×4.6mm, 5μm），梯度洗脱，流动相A为甲醇-乙腈（v:v=3:1）及B为0.2%磷酸水溶液，0-16min，1%A-2%A，16-43min，10%A-11%A，43-65min，18%A，65-125min，20%A-25%A；柱温为27℃；流速为0.8mL·min-1；进样量10μL；检测波长280nm。
②、测定：取供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，得到HPLC分析数据。
（5）五倍子药材有机成分色谱指纹图谱的建立：所述HPLC分析数据经归纳整理后，绘制五倍子药材有机成分的色谱指纹图谱。
步骤3、采用SPSS软件对所述无机元素的ICP-MS分析数据进行系统聚类分析，采用链内平均链锁法（Within-groups linkage），利用欧式距离平方（Squared Euclidean distance）为测度。
步骤4、采用SPSS软件对所述有机成分的HPLC分析数据进行系统聚类分析，采用链内平均链锁法，利用欧式距离平方为测度。
步骤5、综合分析所述五倍子药材无机元素的指纹图谱及聚类分析与所述五倍子药材有机成分的色谱指纹图谱及聚类分析，评价五倍子药材的质量。
三、结果。
（一）、无机元素指纹图谱测定及聚类分析。
含量低于百万分之一水平的微量元素、氧化物干扰（Ti、Ni、Se、Eu、Lu）、氩化物离子干扰（Cr、Hf、Mo、Br、Lu）、氢化物（La）和二聚体（Yb），统计时不包括在内。最终分析了18种无机元素，该18种无机元素分别为：B、Mg、Al、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Ga、Rb、Sr、Ba、Ce、Pb，具体的分析结果参见表4，其中“-”表示未测出该种物质。
表4：无机元素分析结果（ng/g）。
| 序号 | Y1 | Y2 | Y3 | Y4 | Y5 |
| B | 150 | 100 | 130 | 160 | 130 |
| Mg | 13,000 | 10,000 | 8,800 | 10,000 | 10,000 |
| Al | 2,800 | 820 | 2,800 | 1,500 | 1,400 |
| K | 510,000 | 410,000 | 400,000 | 450,000 | 410,000 |
| Ca | 12,000 | 6,800 | 10,000 | 11,000 | 7,200 |
| V | 8.4 | 1.2 | 8.3 | 3 | 2 |
| Cr | 22 | 10 | 10 | 40 | 9 |
| Mn | 420 | 210 | 340 | 260 | 210 |
| Fe | 49,000 | 4,800 | 17,000 | 5,800 | 4,900 |
| Co | 41 | 10 | 22 | 17 | 10 |
| Cu | 3,800 | 1,600 | 1,400 | 1,200 | 1,300 |
| Zn | 2,000 | 540 | 1,000 | 820 | 740 |
| Ga | 440 | 84 | 190 | 210 | 150 |
| Rb | 9,000 | 7,700 | 8,400 | 4,800 | 5,700 |
| Sr | 2,200 | 1,000 | 1,500 | 970 | 1,200 |
| Ba | 3,200 | 550 | 1,200 | 1,500 | 1,100 |
| Ce | 120 | 11 | 56 | 27 | 74 |
| Pb | 260 | 25 | 380 | 100 | 63 |
| 总量 | 608461 | 444261.2 | 453236.3 | 488407 | 444187.2 |
表4续。
| 序号 | Y6 | Y7 | Y8 | Y9 | Y10 |
| B | 110 | 120 | 40 | 140 | 69 |
| Mg | 9,800 | 9,900 | - | 9,900 | 120 |
| Al | 1,300 | 1,100 | - | 1,900 | - |
| K | 410,000 | 500,000 | 15,000 | 550,000 | 64,000 |
| Ca | 9,100 | 7,800 | - | 5,300 | - |
| V | 3 | 2 | - | 3.3 | - |
| Cr | 8 | 27 | - | 6.1 | - |
| Mn | 150 | 150 | - | 120 | 3.8 |
| Fe | 4,600 | 4,600 | - | 6,000 | - |
| Co | 7 | 11 | - | 13 | - |
| Cu | 1,100 | 1,500 | - | 1,100 | 9.6 |
| Zn | 780 | 1,200 | 100 | 960 | 280 |
| Ga | 240 | 290 | - | 61 | - |
| Rb | 5,400 | 5,300 | 270 | 5,500 | 730 |
| Sr | 1,100 | 1,300 | - | 690 | 32 |
| Ba | 1,400 | 1,500 | - | 390 | - |
| Ce | 81 | 46 | - | 15 | - |
| Pb | 77 | 130 | - | 100 | - |
| 总量 | 445256 | 534976 | 15410 | 582198.4 | 65244.4 |
由表4可知，所述10批五倍子药材中无机元素含量差异较大，故五倍子药材中无机元素的分析测定可以为药材选取提供依据。根据每批五倍子药材中的18种无机元素的含量测定结果，分别绘制含量分布曲线，即每一来源的五倍子药材的无机元素指纹图谱。考虑到各种无机元素间含量的差异较显著，为方便绘图，对一些含量悬殊的元素同时放大或缩小不同倍数至同一数量级（如元素V、Cr、Co放大1000倍；元素B、Mn、Ga、Ce、Pb放大100倍；元素Al、Fe、Cu、Zn、Sr、Ba放大10倍；元素K缩小10倍；元素Mg、Ca、Rb数值不变），并将10批不同来源的五倍子药材样品中18种无机元素含量分布图谱绘在一起，形成如图2所示的不同来源五倍子药材无机元素指纹图谱。请参阅图2，五倍子药材中常量无机元素K、Mg、Ca含量较高，且K>Mg>Ca；必需微量元素Fe、Cu、Zn的含量也较高；而有毒有害元素Pb的含量小于药典规定的限量标准。由此可见，从无机元素的角度分析，五倍子具有较好的药用价值，且毒副作用较小。
应用SPSS软件对所测数据进行聚类分析，采用链内平均链锁法，利用欧式距离平方为测度，所得分析结果将10批不同来源的五倍子药材分为2类，分别为Ⅰ类和Ⅱ类，聚类分析结果如表5所示，聚类谱系图如图3所示。结合表4中不同来源的五倍子药材中无机元素测定结果，可以发现：第Ⅱ类所含的18种无机元素无论是单一元素含量还是元素总量均少于第Ⅰ类，那么，从无机元素的角度分析，第Ⅰ类的五倍子药材质量优于第Ⅱ类。由此可见，本发明可以从无机元素角度为五倍子药材质量控制提供一定依据，具有理论及现实意义。
表5：不同来源的五倍子药材无机元素聚类分析结果。
| 类别 | 样品批次 |
| Ⅰ | Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y9 |
| Ⅱ | Y8，Y10 |
（二）、有机成分指纹图谱测定及聚类分析。
1、请参阅图4，为不同来源的五倍子药材有机成分色谱指纹图谱。共有峰确定：10批不同来源的五倍子药材有机成分色谱指纹图谱，以没食子酸色谱峰为内参比峰，标示了其色谱指纹图谱中14个共有峰，色谱峰编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，其中2为没食子酸色谱峰。由图4可知，不同来源的五倍子药材之间共有峰含量存在一定差异，故有机成分色谱指纹图谱分析可为药材质量控制提供一定依据。
2、在各批不同来源五倍子药材的指纹图谱中，分别按公式“Xij= Aij / Wi”计算各色谱峰面积相对其称样量的比值，得到数据矩阵，如表6所示。其中，Xij：第i个样品的第j个峰面积与称样量的比值，Aij：第 i个样品第j个峰的峰面积，Wi：第i个样品的称样量。应用SPSS软件对其进行系统聚类分析，采用链内平均链锁法，并利用欧式距离平方为测度。聚类分析将10批药材分为2类，分别为I类和Ⅱ类，聚类谱系图如图5所示，聚类分析结果见表7。结合表6中不同来源的五倍子药材中有机成分相对峰面积测定结果，可以发现：第Ⅱ类所含的14个共有峰的总峰面积多于第Ⅰ类。对比Ⅰ类与Ⅱ类药材的色谱峰数据可以发现，第Ⅱ类药材中的第7、10和12号色谱峰的峰面积显著大于第I类药材，其他共有峰面积则相差不多，从有机成分的相似性角度分析，第Ⅰ类的五倍子药材优于第Ⅱ类。由此可见，本发明可以从有机成分角度为五倍子药材质量控制提供一定依据，具有理论及现实意义。
表6：不同来源的五倍子药材相对峰面积。
| 序号 | Y1 | Y2 | Y3 | Y4 | Y5 |
| 1 | 462.2 | 510 | 1198.6 | 1024.5 | 1238.9 |
| 2 | 3278.9 | 2879.5 | 1464.7 | 3048.6 | 3756.3 |
| 3 | 164.5 | 215.2 | 230.3 | 68.2 | 93.5 |
| 4 | 889.8 | 199.2 | 69.3 | 30.4 | 36.5 |
| 5 | 14633.5 | 18009.4 | 25693.3 | 13522.5 | 16404 |
| 6 | 1138.1 | 733.1 | 456.4 | 930.4 | 1733.8 |
| 7 | 53.6 | 153.6 | 479 | 82.5 | 213.7 |
| 8 | 399.7 | 323.9 | 318.2 | 69.2 | 65.4 |
| 9 | 91.3 | 42.8 | 48.5 | 2484.4 | 2217.7 |
| 10 | 418 | 430.9 | 1397.7 | 46 | 149.2 |
| 11 | 359.5 | 221.1 | 168.6 | 174.4 | 84.7 |
| 12 | 415.6 | 9731.5 | 4481.7 | 874.3 | 710.6 |
| 13 | 7527.1 | 8311.1 | 5833.3 | 9288 | 8215.1 |
| 14 | 23476.1 | 18078.3 | 32603.5 | 22808.4 | 32121 |
| 总量 | 53307.9 | 59839.6 | 74443 | 54451.8 | 67040.5 |
表6续。
| 序号 | Y6 | Y7 | Y8 | Y9 | Y10 |
| 1 | 598.5 | 1440.5 | 1229.2 | 883 | 967 |
| 2 | 3838.1 | 2098.9 | 6584.6 | 1272.3 | 2631.1 |
| 3 | 98.2 | 42 | 204.4 | 60.2 | 179.4 |
| 4 | 44.6 | 13 | 441.3 | 26.7 | 253.1 |
| 5 | 14525 | 12943.1 | 19030.4 | 21863.8 | 25411.3 |
| 6 | 1984.9 | 1127 | 3172.9 | 583.9 | 111.9 |
| 7 | 272.3 | 15.6 | 1627.5 | 35.3 | 1858.7 |
| 8 | 76.9 | 78.5 | 168.9 | 41.5 | 51.6 |
| 9 | 1764.9 | 3037.6 | 1193.2 | 1702.7 | 994.1 |
| 10 | 1867 | 75.7 | 9537.9 | 127 | 12886.3 |
| 11 | 123.8 | 40.7 | 650.5 | 109.9 | 119.5 |
| 12 | 3351.5 | 834.8 | 13909.8 | 3217.9 | 16139.6 |
| 13 | 10262.7 | 11406.9 | 13850 | 8631.4 | 7983.2 |
| 14 | 27478.1 | 21182.5 | 19584.4 | 35294.9 | 15436.1 |
| 总量 | 66286.5 | 54336.8 | 91185 | 73850.5 | 85022.9 |
表7：不同来源的五倍子药材有机成分聚类分析结果。
| 类别 | 样品批次 |
| Ⅰ | Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y9 |
| Ⅱ | Y8，Y10 |
（三）、综合分析。
将五倍子药材的无机元素指纹图谱及聚类分析结果与有机成分指纹图谱及聚类分析结果进行综合分析。结果表明，无机元素指纹图谱聚类分析结果将10批不同来源的药材分为2类，即Ⅰ类与Ⅱ类，其中第8批和第10批为Ⅱ类，其余批次药材为Ⅰ类；有机成分指纹图谱聚类分析结果也将其分为2类，即Ⅰ类与Ⅱ类，其中第8批和第10批为Ⅱ类，其余批次药材为Ⅰ类，即该有机成分的聚类分析结果与无机元素聚类分析结果相同。
五倍子药材无机元素的聚类分析结果中，第Ⅱ类所含的18种无机元素无论是单一元素含量还是元素总量均少于第Ⅰ类，那么，从无机元素的角度分析，第Ⅰ类的五倍子药材质量优于第Ⅱ类。有机成分聚类分析结果中，第I类与第Ⅱ类所含成分含量之间有较大差异，其中，Ⅱ类药材指纹图谱中第7、10和12号峰明显高于第I类，从有机成分的相似性角度分析，第Ⅰ类的五倍子药材优于第Ⅱ类。
综合分析五倍子药材的无机元素指纹图谱及聚类分析结果与有机成分指纹图谱及聚类分析结果，可知第Ⅰ类的五倍子药材优于第Ⅱ类，即来源为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y9的五倍子药材质量优于Y8、Y10的五倍子药材。由此可见，分析方法联用后避免了单一分析评价五倍子药材质量的片面性，可为全面控制五倍子药材质量提供依据。
综上所述，本发明提供的五倍子药材的双重指纹图谱质量控制方法，通过综合分析无机元素指纹图谱及聚类分析和有机成分指纹图谱及聚类分析，更好的揭示五倍子药材无机元素、有机成分之间的联系，可以更全面的控制五倍子药材的质量，避免因测定个别化学成分而判定五倍子药材整体质量的片面性，为五倍子药材的进一步研究提供依据。
Claims (1)
1.五倍子药材的双重指纹图谱质量控制方法，包括：
步骤1、采用ICP-MS法测定每一来源的五倍子药材的无机元素，建立五倍子药材无机元素的指纹图谱，具体步骤为：
（1）样品预备：将每一来源的五倍子药材敲开，去除内部虫卵后，充分粉碎，过80目筛，备用；
（2）微波消解：
①、取每一来源的五倍子药材粉末样品0.2g，精确至0.00001g，放入微波消解仪中；
②、按照每1g五倍子药材样品中加入20-40浓硝酸的比例，进行样品消化；
③、采用压力主控的微波消解方法，确定微波消解条件如下：
压力0.3 MPa，时间4 min，功率800W；
压力0.6 MPa，时间4 min，功率800W；
压力1.0 MPa，时间4 min，功率800W；
压力1.5 MPa，时间8 min，功率800W；
④、样品消解完成后，取下冷却至室温，将微波消解仪中的消解液转移至塑料容量瓶中，得到微波消解液样品，待测；
⑤、相同方法处理空白溶剂进行空白试验，即：在未加五倍子药材粉末样品的空白微波消解仪中，按照上述步骤②中相同的浓硝酸用量，进行样品消化，其他步骤同上述步骤③、④，最终定容溶液为空白溶液；
（3）ICP-MS测定每一来源的五倍子药材中的无机元素：依次将单元素标准储备溶液、空白溶液、及上述步骤（2）中的每一来源的五倍子药材的微波消解液样品引入仪器，在线加入内标液，进行无机元素ICP-MS半定量分析测定，得到ICP-MS分析数据；
具体的ICP-MS测定条件为：RF功率1300W，等离子体流速15.0L·min-1，载气流速1.13L·min-1，采样深度8.2，雾化室温度2度，分析时间/质量0.3；所述单元素标准储备溶液为K、Ca、Na、Mg、Fe、Al、Cr、As，该单元素标准储备溶液浓度为1000μg·mL-1；所述内标液为Li、Sc、Ge、Y、In、Tb、Bi，该内标液浓度为10μg·mL-1；
（4）、五倍子药材无机元素指纹图谱的建立：所述ICP-MS分析数据经归纳整理后，绘制五倍子药材无机元素的指纹图谱；
所述ICP-MS测定的无机元素为16种，分别为：B、Mg、Al、K、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Ga、Rb、Sr、Ba、Ce、Pb；
步骤2、采用HPLC法测定每一来源的五倍子药材的有机成分，建立五倍子药材有机成分的色谱指纹图谱，具体步骤为：
（1）样品预备：将每一来源的五倍子药材敲开，去除内部虫卵后，充分粉碎，过80目筛，备用；
（2）供试品溶液的制备：取五倍子药材粉末0.1g，精确至0.00001g，用10mL甲醇超声提取半小时，放至室温，过滤，滤液置容量瓶中，所述滤液用甲醇稀释并定容至刻度，制成每毫升含5mg五倍子药材的溶液，摇匀，滤过，取续滤液，备用；
（3）对照品溶液的制备：以没食子酸为内参照物，取没食子酸对照品9.7mg，精确至0.00001g，用甲醇溶解稀释，滤过，制成0.097 mg·mL-1的对照品溶液；
（4）HPLC法测定每一来源的五倍子药材有机成分：
①、色谱条件：采用色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相A为甲醇-乙腈（v:v=3:1）及B为0.2%磷酸水溶液，0-16min，1%A-2%A；16-43min，10%A-11%A；43-65min，18%A；65-125min，20%A-25%A；柱温为27℃；流速为0.8mL·min-1；进样量10μL；检测波长280nm；
②、测定：取供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，得到HPLC分析数据；
（5）五倍子药材有机成分色谱指纹图谱的建立：所述HPLC分析数据经归纳整理后，绘制五倍子药材有机成分的色谱指纹图谱；
步骤3、采用SPSS软件对所述步骤（1）中五倍子药材无机元素的ICP-MS分析数据进行系统聚类分析，采用链内平均链锁法，利用欧式距离平方为测度；
步骤4、采用SPSS软件对所述步骤（2）中五倍子药材有机成分的HPLC分析数据进行系统聚类分析，采用链内平均链锁法，利用欧式距离平方为测度；
步骤5、综合分析所述五倍子药材无机元素的指纹图谱及聚类分析与所述五倍子药材有机成分的色谱指纹图谱及聚类分析，评价五倍子药材的质量。
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