CN102749409A - 一种基于代谢组学技术的中药制剂制备工艺的评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于代谢组学技术的中药制剂制备工艺的评价方法，主要技术路线包括：1.通过正交实验设计或平行对照实验设计获取不同制备工艺的中药制剂制品；2.对制备得各制品进行样品前处理；3.应用液相串联高分辨质谱仪，获得中药制剂制品的色谱图；4.根据质量亏损策略，在色谱图中找寻中药材归属性的成分；5.依据测定的精确质量数和源内诱导碰撞碎裂所得的碎片信息，推断各成分结构；6.定量分析各制品中所有归属性成分的含量；7.通过多变量的数据统计分析方法整体评价制备工艺对制剂的影响。该方法准确、灵敏、不依赖于标准化合物，从整体上跟踪制剂制品中药材归属性成分的变化，可广泛适用于中药制剂的制备工艺评价。
Description
技术领域：
本发明涉及制药生产领域，具体涉及中药制剂或天然药物制剂的制备工艺评价、质量评价及质量标准的建立。
背景技术：
中药制剂是以临床应用效果良好的中药处方为基础研制而成的，因其具有多靶点多效应的作用而被广泛使用，如复方丹参滴丸、复方丹参片、葛根素注射液、步长脑心痛、脉络宁注射液等。长期以来，中药制剂在满足临床需求、促进中医药事业发展方面发挥了重要作用，但是也存在发展不平衡的现象，如基础性研究缺乏、制剂质量监管体制落后、制剂质量不稳定、制备工艺落后、缺乏系统性评价等问题。因此，在医疗实践中，发生了较多由中药制剂所引发的严重不良反应，如过敏性休克、抽搐昏迷、呼吸困难等。特别针对中药注射剂，近年来不良反应在数量上增幅较大、品种也较多。这使得中药制剂陷入了患者质疑、医院停用、病例增多的现状。
制剂制备工艺不够合理、质量标准不够完善是中药制剂目前最突出的问题。中药制剂与单一成分的化学药物不同，中药制剂是将中药材经过提取纯化而制成的具有一定规格，直接用于防病治病的多成分混合的药品，成分复杂不确定。其质量的影响因素很多，在处方确定之后，从原料药材的生长、采收、贮藏，到原药材的粉碎、浸提、分离，再到浸提液的浓缩、干燥与成剂型，每个环节的改变都会使中药制剂的质量发生变化。早期中药制剂的质量评价只是经过感官的检验。50年代开始将中药制剂的质量管理纳入法制化、规范化的轨道。90年代，随着色谱技术的广泛发展，中药制剂的质量评价开始从最初的植物形态学检查、物理化学方法检查发展到利用高效液相色谱法、液相串联质谱法对多个指标性成分检测。2000年8月国家食品药品监督管理局颁发了《中药指纹图谱研究技术指导原则(试行)》，这种指纹图谱形式的评价手段更为灵敏、专属性更强、更客观、科学。但是，中药制剂特别是复方制剂，其药效成分不明确、杂质多、存在未知成分、作用复杂(如山楂：在制剂中以健胃消食为主治功效，需测定有机酸含量；如以心血管疾病为主治功效，需测定黄酮类成分)，仅通过指纹图谱色谱峰的相似性来评价中药制剂的质量并不合理，同时也不能支持工艺改进。指纹图谱中色谱峰的归属、归属成分的定量检测及综合的统计学意义上的评价是今后研究发展的必然趋势和要求。
近年来，国内外均开始重视(生物)系统的组学研究，这给我们中药制剂的质量评价带来新的思路和借鉴。代谢组学是一种通过组群指标的高通量定量检测，进行数据处理，从而研究系统的特征和变化的技术。总体来说，代谢组学技术分成两个步骤：1)利用现代分析技术对系统中的成分组群定性定量检测；2)通过统计软件对组群成分的定量分析数据进行多变量统计分析如PCA、PLS-DA等。结合高分辨的质谱分析手段，代谢组学技术对完善中药制剂的质量评价体系和改进提高中药制剂的制备工艺具有重要意义。借助多变量的统计分析方法，分析归纳总结并预测制剂及制剂中间产物中多组分的综合效用；借助液相串联高分辨质谱仪，能够高通量的定性和定量中药制剂中多组分；其高准确度的精确质量数测定和对化合物的诱导碎裂的特点提供了丰富而精确的化合物结构信息，对鉴定制剂及制剂中间产物复杂的成分结构具有突出优势；同时其高通量、高灵敏度、宽动态范围的分析平台为复杂的化学成分定量提供便利。基于此的制剂及制剂中间产物的代谢组学评价方法更为科学、合理。
鉴于此，本发明应用代谢组学技术建立了一种整合的中药、天然药物制剂及制剂中间产物的评价方法，对中药制剂的质量标准建立和制剂制备工艺的改进具有重要意义和普遍使用性。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：利用代谢组学技术，跟踪中药制剂制备过程中药材归属性成分的变化，得到的数据采用多变量统计分析建立数学模型，以表征不同制备工艺对中药制剂制品最终质量的影响。
为解决上述问题，本发明提供如下技术方案，步骤包括：
a：明确影响中药制剂质量的因素，通过平行对照实验设计或正交实验设计制备不同工艺的中药制剂制品，为保证准确性，每种工艺平行制备6个以上的批次；制剂过程中影响最终制剂质量的因素包括：中药材的产地、中药材的投料配比、中药材粉碎粒度、中药材的提取溶剂、中药材提取的温度、中药材提取的时间、中药材提取次数、所用的助溶剂、所用吸附沉淀剂。
b：根据中药制剂所含化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法对中药制剂制品进行处理，获得中药制剂特征性总成分提取物；处理方法包括：液液萃取、固相萃取、过滤，其中液液萃取溶剂包括正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、苯、正己烷；固相萃取包括各种型号的固相小柱；过滤包括各种型号的滤膜。
c：应用液相串联高分辨质谱联仪，在一定的色谱分离条件下，对不同制备工艺的中药制剂进行分析，获取特征性的总离子流色谱图；所用的高分辨质谱仪必须为同时具有高准确度的离子精确质量数测定功能和离子碎裂功能的各种高分辨质谱仪；其中串联的液相色谱仪包括高效液相色谱仪(HPLC)以及超高效液相色谱仪(UPLC)。
d：运用质量亏损策略，筛选谱图中中药制剂药材归属性的成分；
e：依靠高分辨质谱仪产生的高准确度的精确质量数测定值预测各成分的分子式，结合诱导碰撞裂解产生的碎片信息，进行数据库比对，确定所有归属性成分的化学结构；
f：在不进行诱导碰撞裂解的质谱条件下，对所有样品进行定量分析；定量分析方法包括依赖于标准品的绝对定量方法和不依赖于标准品的半定量方法，其中不依赖于标准品的半定量方法包括用峰面积或峰高进行定量分析的方法。
g：通过代谢组学相关软件，建立数学模型，从多维空间数学模型中提取参数，计算各样品之间的相对距离，表征其在含量上的差异，数学模型的建立应根据6个批次以上的供试品的测定结果来计算；基于代谢组学技术的多变量统计分析，包括利用各种代谢组学数据处理软件进行的主成份分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、偏最小二乘分析(PLS)、正交偏最小二乘分析(OPLS)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)、非线性映射(Nonlinemapping，NLM)、热图分析(Heat map)或聚类分析(HCA)；其中所述软件具体为SPSS、Metlab或Simca-P。
本发明具有以下优点：
1 本发明提出的质量亏损策略，可以快速的筛选并归属中药制剂中药材归属性成分，其具有普适性，避免了烦琐的数据处理和归纳。与常规的单指标或多指标成分含量测定的评价相比，其能够整体性的反应中药制剂在生产过程中的变化；与指纹图谱技术相比，该方法立足于对药材归属性成分的测定和比较，并且对归属性成分进行初步的结构推测，其专属性更强，能够排除杂质成分对评价的干扰。
2 体内药物的代谢产物亦具有相似的母核结构，因此本发明提出的质量亏损策略可以延伸于体内药物代谢产物的筛选。
3 本发明中运用的液相串联高分辨质谱可以同时获得中药制剂药材归属性组分的结构信息和含量变化信息。通过高分辨质谱仪提供的离子精确质量数测定和离子的碎裂信息，能够快速的鉴定出未知组分的分子结构式。
4 利用代谢组学技术可以综合而全面的量化反映不同制备工艺的制剂中所有组分(包括未知组分和已知组分)的含量变化，相对于传统的单一指标的评价形式，该方法不依赖于标准化合物，适用广泛、评价标准客观且准确。
5 本发明运用的多变量统计方法能够科学的阐明所有组分的变化趋势，提供综合的评价指标。其具有客观的统计学意义，更具科学性和准确性，避免了一些人为主观的判断。
附图说明：
图1为改法评价不同制备工艺的中药制剂的技术路线。
图2为利用质量亏损策略筛选麦冬皂苷和麦冬黄酮归属性的成分。依据质量亏损的原理，可以推测出麦冬黄酮类组分的质量亏损值范围为(.0510～.1653)，麦冬皂苷类组分的质量亏损值范围为(.3382～.6223)。在该范围内，筛选出36个麦冬黄酮归属性成分和63个麦冬皂苷归属性成分。
图3为麦冬皂苷和麦冬黄酮的总离子流色谱图。a)麦冬黄酮总离子流色谱图；b)麦冬皂苷总离子流色谱图；根据质量亏损策略，共筛选出36个麦冬黄酮类成分和63个麦冬皂苷类成分(6号峰为定量麦冬黄酮的内标，62号峰为定量麦冬皂苷的内标)
图4为根据精确质量数和碎裂信息推测出来的麦冬黄酮的结构，共推测出19个麦冬黄酮归属性成分的化学结构
图5为根据精确质量数和碎裂信息推测出来的麦冬皂苷的结构，共推测出48个麦冬皂苷归属性成分的化学结构
图6为四种不同工艺的麦冬提取物在PLS-DA模型中的得分图。根据PLS-DA模型的得分图可以直观的看出各个样品在多维空间模型中的相对位置，图中的每个表示一个样品所有成分含量的综合信息，从该得分图可以明显的观测到四种不同的麦冬提取物存在差异。
图7为四种不同工艺的麦冬提取物所有样品的热图。该图中的一个方块表示一个样品所对应的一个成分的含量，颜色越红表示该样品中该成分的含量多，颜色越绿则表示含量少。从图中可以看出麦冬黄酮类成分在90％或75％的乙醇提取物中含量较高，麦冬皂苷类则在55％或35％乙醇提取物中含量较高。
具体实施方式：
实施例1：
对不同提取溶剂制备得到的麦冬提取物进行评价
a：制备不同工艺的麦冬提取物
市售的麦冬药材粉碎过筛，取1g粉碎药材分别用35％、55％、75％和90％的乙醇水混合溶剂200ml进行回流提取2次，2次提取液合并，合并的提取液经旋转蒸发浓缩仪在55摄氏度的条件下浓缩，浓缩浸膏100ml甲醇复溶，5um滤膜过滤。为了考察实验的准确度，各提取工艺重复8个批次。
b：所有待测样品进行固相萃取处理
各样品经过滤后，采用固相萃取技术进行除杂处理。固相萃取小柱(C18，500mg/3ml，United ChemicalTechnologies Inc)在上样前分别用2ml的甲醇和2ml去离子水活化各两次，后取200ul样品上样，用2ml去离子水冲洗并吹干，再用2ml甲醇洗脱，洗脱液浓缩蒸干，用200ul甲醇溶解，18000rmp离心，取上清，5ul进样。
c：采用高效液相-离子阱-飞行时间质谱仪对供试样品进行负离子全扫描得到总离子流色谱图，并设定在数据采集过程中，将丰度超过一定标准的离子自动进行二级碎裂。
仪器及工作站软件：高效液相-离子阱-飞行时间串联质谱仪(岛津，日本)，LC solution 3.0。
麦冬皂苷和麦冬黄酮的系列组分的色谱分离参数一致，其条件如下：
色谱柱：phenomenex Luna(C18，5μm，2.1*150mm I.D.)；柱温：35℃；流速：0.2ml/min；采用梯度洗脱方式，流动相：水相(A)为含0.02％甲酸的水溶液，有机相(B)为含0.02％甲酸的乙腈，梯度洗脱程序如下：0～5min(B：25％→25％)5～50min(B：25％→75％)；50～53min(B：75％→75％)；53～55min(B：75％→25％)；55～60min(B：25％→25％)；进样量：5ul。
麦冬皂苷系列组分的质谱参数如下：
离子化方式：电喷雾离子化(ESI-)；扫描范围：MS1 m/z 500-1500，MS2 m/z 100-1000；多级MS碰撞能量：设为100％；检测电压：1.60kV，雾化气流速(N2)：1.5L/min，干燥气流速(N2)：5L/min，曲型脱溶剂装置(CDL)和加热块(block)温度：200℃；碰撞气为高纯氩气，TOF真空度：1.5×10-4Pa，离子阱真空度：1.7×10-2Pa，离子累积时间：30ms，精确质量数用三氟醋酸钠校准，分子式的推断由Formula Predictorsoftware(Shimadzu，Japan)分子式预测软件完成。
麦冬黄酮系列组分的质谱参数如下：
离子化方式：电喷雾离子化(ESI-)；扫描范围：MS1 m/z 200-450，MS2 m/z 50-300；多级MS碰撞能量：设为100％；检测电压：1.60kV，雾化气流速(N2)：1.5L/min，干燥气流速(N2)：5L/min，曲型脱溶剂装置(CDL)和加热块(block)温度：200℃；碰撞气为高纯氩气，TOF真空度：1.5×10-4Pa，离子阱真空度：1.7×10-2Pa，离子累积时间：30ms，精确质量数用三氟醋酸钠校准，分子式的推断由Formula Predictorsoftware(Shimadzu，Japan)分子式预测软件完成。
以上条件下，全扫描得到麦冬提取物在负离子模式下的总离子流色谱图分别如图2所示。
d：应用质量亏损策略，快速筛选麦冬皂苷和麦冬黄酮系列组分归属的成分
质量亏损值是化合物的固有性质，它表示的是化合物的精确质量数与整数质量之间的差值。具有类似结构的化合物，它们的质量亏损值相接近，且质量亏损范围可预测。依据这个原理，可以推测出中药系列成分的质量亏损范围。
分别提取麦冬皂苷和麦冬黄酮的公共骨架，并计算公共骨架的质量亏损值。分别给麦冬皂苷和麦冬黄酮的公共骨架赋值取代基，使产生最大和最小的质量亏损，从而得到麦冬皂苷和麦冬黄酮系列化合物可预测的质量亏损范围(如图1所示)。根据得到的质量亏损范围，从质谱数据中筛选质量亏损范围内的离子。
e：根据高效液相串联离子阱-飞行时间质谱仪所检测到的离子精确质量数，在一定的误差范围内推测各成分的分子式，并针对其多级碎裂信息，从SciFinder Sholar 2007数据库中找寻匹配的结构式。
基于该步骤，推断获得的麦冬皂苷和麦冬黄酮的结构如图3和图4。
f：对所有的样品中麦冬皂苷和麦冬黄酮归属的成分，用峰面积与内标峰面积的比值进行定量分析，由于难以获得麦冬皂苷和麦冬黄酮的标准品，因此采用相对定量方法，样品中麦冬皂苷和麦冬黄酮归属性成分的相对含量用各峰峰面积与内标峰面积(槲皮素作为黄酮类成分的内标，地高辛作为皂苷类成分的内标)的比值来表示。
g：对上述的定量分析数据进行多变量的主成份分析
上述获得数据调入多元数据分析软件Simca-P11软件(Umetrics AB，Umea，瑞典)中，利用数据内在关系投影偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)计算数学模型，确定得到的模型的主成份数目为2，该数学模型即为一个二维空间模型，每个样品都是此空间中的一个点，其位置由x和y坐标参数决定。由上述模型可以得到各个样品在此模型的平面坐标中的分布，如图6。
将上述定量分析数据导入软件(Heat map
1.1version)，产生热图。热图是一种表述多变量的图解表示方法。图中每个方块表示一个样品的一个成分的含量，其颜色的深浅表示含量的多少，如图7。
Claims (8)
1.一种基于代谢组学技术的中药制剂制备工艺的评价方法，其特征在于由以下几个步骤组成：
a：明确影响中药制剂质量的因素，通过平行对照实验设计或正交实验设计制备不同工艺的中药制剂制品，为保证准确性，每种工艺平行进行6次以上；
b：根据中药制剂所含化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法对中药制剂制品进行处理，获得中药制剂特征性总成分提取物；
c：运用液相串联高分辨质谱联仪，在一定的色谱质谱分离条件下，对中药制剂制品进行分析，获取特征性的总离子流色谱图；
d：运用质量亏损策略，筛选谱图中各药材归属性的成分；
e：依靠高分辨质谱仪产生的高准确度的精确质量数测定值预测各成分的分子式，结合诱导碰撞裂解产生的碎片信息，进行数据库比对，确定所有归属性成分的化学结构；
f：在不进行诱导碰撞裂解的质谱条件下，对所有样品进行定量分析；
g：通过代谢组学相关软件，建立数学模型，从多维空间数学模型中提取参数，计算各样品之间的相对距离，表征其在含量上的差异，数学模型的建立应根据6个批次以上的供试品的测定结果来计算。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的中药制剂为以中医药理论为指导，可供临床防病治病使用的单方、复方制剂。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述制剂的剂型具体为：片剂、注射剂、颗粒剂、丸剂、散剂或膏剂。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤a的制剂过程中影响最终制剂质量的因素包括：中药材的产地、复方中中药材的投料配比、中药材粉碎粒度、中药材的提取溶剂、中药材提取的温度、中药材提取的时间、中药材提取次数、所用的助溶剂或所用吸附沉淀剂。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤b中对样品进行处理方法包括：液液萃取、固相萃取和过滤；其中液液萃取溶剂包括正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、苯或正己烷；固相萃取包括各种型号的固相小柱；过滤包括各种型号的滤膜。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤c所述的高分辨质谱仪为同时具有高准确度的离子精确质量数测定功能和离子碎裂功能的各种高分辨质谱仪；其中与之相串联的液相色谱仪包括高效液相色谱仪(HPLC)以及超高效液相色谱仪(UPLC)。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤f中所述的定量分析方法包括依赖于标准品的绝对定量方法和不依赖于标准品的半定量方法，其中不依赖于标准品的半定量方法包括用峰面积或峰高进行定量分析的方法。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤g所述的基于代谢组学技术的多变量统计分析，包括利用各种代谢组学数据处理软件进行的主成份分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、偏最小二乘分析(PLS)、正交偏最小二乘分析(OPLS)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)、非线性映射(Nonlinemapping，NLM)、热图分析(Heat map)或聚类分析(HCA)；其中所述软件具体为SPSS、Metlab或Simca-P。
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| Feng et al. | Stepwise targeted matching strategy from in vitro to in vivo based on ultra–high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry technology to quickly identify and screen pharmacodynamic constituents | |
| Jiang et al. | A high throughput three-step ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method to study metabolites of atractylenolide-III | |
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| Zhai et al. | Discrimination of toxic ingredient between raw and processed Pinellia ternata by UPLC/Q-TOF-MS/MS with principal component analysis and T-test | |
| Yang et al. | UPLC-QTOF-MS with a chemical profiling approach for holistic quality evaluation between a material reference of Wen Dan decoction and its commercial preparations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121024 |