CN105510495A

CN105510495A - 一种揭示药物活性成分及其组合的方法

Info

Publication number: CN105510495A
Application number: CN201510694967.9A
Authority: CN
Inventors: 李萍; 杨华; 宋慧鹏; 邬思琪; 刘鄂湖
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2015-10-22
Publication date: 2016-04-20

Abstract

本发明公开了一种揭示药物活性成分及其组合的方法，包括如下步骤：对药物提取物进行色谱分离和化合物结构鉴定，根据结构相似性将化合物分成不同的化学家族；天然化合物库改造；对改造后的天然化合物库进行筛选并找到活性分子；围绕活性分子所在的化学家族进行组合，标评价化学家族内和家族间的相互作用关系，可发现被传统方法所忽略的微量活性成分及其组合间复杂相互作用，操作简便、经济、绿色、适用性强。

Description

一种揭示药物活性成分及其组合的方法

技术领域

本发明属于制药领域，涉及一种揭示药物活性成分及及其组合，尤其涉及一种从丹七方中发明在抑制凝血酶方面具有联合用药价值的药物组合。

背景技术

中草药发展历史悠久，通过经验相传或古籍记载流传至今。而中药复方，作为配伍规律的具体应用形式，具有丰富奥妙的科学内涵和组合变化规律。近几十年来，随着高通量筛选技术的崛起，很多中外学者把研究兴趣放在从草药中筛选具有潜力的先导结构或新的活性分子。然而，有个不可忽略的事实是中药里成分复杂多样、含量层次不齐，为新药筛选带来了极大的麻烦。因此，从筛选化合物库的角度，在筛选之前对中药提取物进行必要的改造和优化是影响后续活性化合物筛选的重要因素。

而另一方面，西药“单一药物作用于单一靶点”的药物作用模式对中药研究造成了极大的冲击：很多中药研究工作过分关心某一个单体成分，忽视了中药药效是在中医指导下的多成分整合作用的结果。目前专门针对中药多成分组合相互作用的筛选方法或理论少之又少。如何揭示中药尤其是中药复方所包含的多成分组合产生的相互作用，对于中药研究及现代化具有重要意义。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明要解决的问题在于：建立一种基于化学家族分类和天然化合物库优化的既能快速、准确辨识其生物活性小分子，又能全面揭示多成分间相互作用关系的筛选方法。

(二)技术方案

本发明涉及一种揭示药物活性成分及其组合的方法，该方法包括如下步骤：

步骤1：对药物提取物进行色谱分离和化合物结构鉴定，根据结构相似性将化合物分成不同的化学家族。

步骤2：对色谱图进行分解并逐个收集每个色谱峰的馏分，记录其色谱峰面积。

步骤3：从每个化学家族中选择一个容易获取的化合物作为代表，测试记录各代表在同一浓度的色谱峰面积作为标准，每个化学家族中的其他化合物以重新组合的方式向该标准看齐，对天然化合物库改造。

步骤4：应用高通量筛选技术对改造后的天然化合物库进行扫描并找到活性化合物。

步骤5：围绕活性化合物所在的化学家族，选用指标或模型评价家族内和家族间组合的多成分相互作用关系，这种关系可能是拮抗、相加、协同或者无明显相互关系。

本发明的步骤1中的药物提取物的来源包括而不限于：植物提取物、动物提取物、微生物提取物、真菌提取物、矿物提取物等天然产物。

本发明的步骤1中的所述结构相似性为在结构、官能团、药效团、或分子量等方面具有的相似性。

本发明的步骤1中的化合物结构鉴定为基于质谱的化合物分子量和特征碎片离子比对或基于核磁共振技术、红外光谱、紫外光谱的化合物结构解析。

本发明的步骤1中的色谱分离为分析型、半制备型或制备型的高效液相色谱。

本发明的步骤2中的色谱图进行分解为通过色谱图的保留时间设置时间窗，以色谱峰为单位的馏分收集。

本发明的步骤3中的容易获取的化合物为在天然产物中丰度高且易制备纯化的标准品、或者市场上价格便宜的标准品。

本发明的步骤3中的重新组合为按照规则，通过手动移液器或自动化仪器对各个馏分进行混合。

本发明的制备方法，步骤3中的规则是：

本发明的步骤4中的所述高通量筛选技术为多孔道酶标仪检测或基于靶细胞和靶蛋白的亲和色谱筛选。

本发明的步骤5中的指标或模型为CombinationIndex理论、Blissindependence模型、Loeweadditivism模型或者剂量依赖性的相互作用趋势。

本发明涉及一种药物活性成分的重新组合方法；该方法包括如下步骤：

步骤2：对色谱图进行分解并逐个收集每个色谱峰的馏分，记录其色谱峰面积

步骤3：从每个化学家族中选择一个容易获取的化合物作为代表，测试记录各代表在同一浓度的色谱峰面积作为标准，每个化学家族中的其他化合物以重新组合的方式向该标准看齐，对天然化合物库进行改造。

重新组合的具体步骤：

假设某提取物中含有X个成分(例如18个成分)，这18个成分对应的……峰面积为A₁、A₂、A₃……A₁₈，

根据化学结构相似性被分为L、M、N三个化学家族：

L = {A_{1}^{L}, A_{2}^{L}, A_{3}^{L}, A_{4}^{L}, A_{5}^{L}, A_{6}^{L}, A_{7}^{L}, A_{8}^{L}, A_{10}^{L}, A_{11}^{L}}

M = {A_{9}^{M}, A_{12}^{M}, A_{13}^{M}, A_{14}^{M}}

N = {A_{15}^{N}, A_{16}^{N}, A_{17}^{N}, A_{18}^{N}}

从L、M、N中各选一个易于获得标准品的化合物作为代表。测试其在某一浓度的峰面积分别记为例如在酶活性测试时通常会选用100μM作为先导浓度以初步判断化合物是否具有值得深入研究的价值。即为各自家族成员所需用于测试活性的量。用峰面积作为同一化学家族重新组合的标准，依据为记录在中国药典和美国药典的一测多评方法(如下)：

假设某一个样品含有i个组分

C_i/A_i＝f_i(i＝1，2，...，s...，k)①

式中A_i为组分峰面积，C_i为组分浓度。选取其中一组分s为内标，建立组分s与其他组分间的相对校正因子：

f_sk＝f_s/f_k＝(C_s×A_k)/(C_k×A_s)②

C_k＝(C_s×A_k)/(f_sk×A_s)③

式子中A_s为内标物峰面积，C_s为内标物浓度。A_k为其他组分k的峰面积；C_k为其他组分k的浓度。当分析物具有相似的化学结构、吸收特性时，相对校正因子可以视为1。因此，上述公式在同系物中可以简化为：C_k＝(C_s×A_k)/A_s。当代表性化合物S在某一浓度(e.g.C_s＝100μM)的峰面积(A_s)已知，且化合物k的峰面积(A_k)与化合物s的峰面积(A_s)相等，化合物k的浓度(C_k)即等于代表化合物的浓度(C_s)。

计算每个家族中每个色谱峰重构所需的比例。

\begin{matrix} L_{R a t i o} = {(A_{S}^{L} / A_{1}^{L}) : (A_{S}^{L} / A_{2}^{L}) : (A_{S}^{L} / A_{3}^{L}) : (A_{S}^{L} / A_{4}^{L}) : (A_{S}^{L} / A_{5}^{L}) : (A_{S}^{L} / A_{6}^{L}) : (A_{S}^{L} / A_{7}^{L}) : \\ (A_{S}^{L} / A_{8}^{L}) : (A_{S}^{L} / A_{10}^{L}) : (A_{S}^{L} / A_{11}^{L})} \end{matrix}

M_{R a t i o} = {(A_{S}^{M} / A_{9}^{M}) : (A_{S}^{M} / A_{12}^{M}) : (A_{S}^{M} / A_{13}^{M}) : (A_{S}^{M} / A_{14}^{M})}

N_{R a t i o} = {(A_{S}^{N} / A_{15}^{N}) : (A_{S}^{N} / A_{16}^{N}) : (A_{S}^{N} / A_{17}^{N}) : (A_{S}^{N} / A_{18}^{N})}

用手动移液器或者自动化仪器按步骤3的比例对各个色谱峰进行组合，从而完成对提取物的改造。

步骤5：对步骤1中药物的制备方法进行改进，使得步骤1中提取物中含量过少的活性化合物的含量增加，使得骤1中提取物中因含量过大的活性化合物的含量减少，从而得到重新组合的药物提取物。

本发明的效果包括：全面筛选药物提取物中的活性成分，避免活性成分在原提取物中含量过少而导致的漏筛和无活性成分因含量过大而导致的假阳性结果，使成分未知、含量未知且参差不齐、响应有高有低的中药原提取物转变为成分清楚、含量相对已知并且均匀、响应良好的筛选化合物库，从而可以更好的与高通量筛选技术兼容。更重要的是，该方法可以全面揭示化学家族内和家族间组合的多成分相互作用关系，是对现代中药活性成分筛选体系的重要补充。

通过本发明得到重新组合的药物提取物，也就是如下具有活性的新的药物组合物。

本发明涉及一种抑制凝血酶活性的药物组合物，由如下丹参酮类化合物中的一种、两种、或多种组成；丹参酮类化合物为：15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA；

本发明涉及一种促进凝血酶活性的药物组合物，由如下人参皂苷类化合物中的一种、两种、或多种组成；人参皂苷类化合物为：人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb。

本发明涉及一种调控凝血酶活性的药物组合物，其中包含：丹参酮类化合物、人参皂苷类化合物；丹参酮类化合物由以下的一种、两种、或多种组成：15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA；人参皂苷类化合物由以下的一种、两种、或多种组成：人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb。

本发明涉及一种调控凝血酶活性的药物组合物，其中包含：丹酚酸A、丹参酮类化合物、人参皂苷类化合物；丹参酮类化合物由如下一种、两种、或多种组成：15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA；人参皂苷类化合物由如下一种、两种、或多种组成：人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb。

本发明涉及一种抑制凝血酶活性的药物组合物，由丹参酮类化合物中的一种、两种、或多种组成；丹参酮类化合物为：15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA；高效液相检测到峰面积：各丹参酮类化合物面积分别为721-783。

本发明涉及一种抑制凝血酶活性的药物组合物，其中包含：丹参酮类化合物；由丹参酮类化合物中的一种、两种、或多种组成；15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA；浓度范围表示91.61-99.49μM。

本发明涉及一种促进凝血酶活性的药物组合物，由人参皂苷类化合物中的一种、两种、或多种组成；人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb；高效液相检测到峰面积：各皂苷类化合物面积分别为218-284。

本发明涉及一种促进凝血酶活性的药物组合物，由人参皂苷类化合物中的一种、两种、或多种组成；人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb；以浓度范围表示81.04-105.58μM。

本发明所记载的调控包括：抑制、或、促进、先抑制后拮抗、先拮抗后抑制等多种方式。

本发明涉及一种调控凝血酶活性的药物组合物，其中包含：丹参酮类化合物、人参皂苷类化合物；

由丹参酮类化合物中的一种、两种、或多种组成；15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA；高效液相检测到峰面积：各丹参酮类化合物面积分别为721-783；

由人参皂苷类化合物中的一种、两种、或多种组成；人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb；高效液相检测到峰面积：各皂苷类化合物面积分别为218-284。

由丹参酮类化合物中的一种、两种、或多种组成；15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA；以浓度范围表示91.61-99.49μM。

由人参皂苷类化合物中的一种、两种、或多种组成；人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb；以浓度范围表示81.04-105.58μM。

本发明涉及一种调控凝血酶活性的药物组合物，其中包含：丹参酮类化合物、人参皂苷类化合物、丹酚酸A；

丹酚酸A的面积分别为2534。

丹参酮类化合物由如下一种、两种、或多种组成；15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA；浓度范围表示91.61-99.49μM。

人参皂苷类化合物由如下一种、两种、或多种组成；人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb；以浓度范围表示81.04-105.58μM。

丹酚酸A，以浓度表示为110.08μM。

本发明涉及一种具备凝血酶抑制活性的丹酚酸A的组合物，其组成是：丹酚酸A、磷酸缓冲液。

本发明涉及一种具备凝血酶抑制活性的丹酚酸A的组合物，由丹酚酸A、磷酸缓冲液组成。

丹酚酸A被溶解于磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液的制备方法是：精密称取1.9120g磷酸二氢钾、13.8920g磷酸氢二钾(三水)及乙二胺四乙酸(EDTA)37.24mg，加入超纯水约960mL超声促溶，取出，定容至1000mL即得含75mmol/L磷酸根离子、200μmol/LEDTA，pH7.4的磷酸盐缓冲液。

根据本发明的一个具体实施例，本发明从中药经典名方丹七方(包含丹参和三七)中发现了具有药用价值的活性成分及多成分组合相互作用关系。该三类成分间组合的多成分相互作用关系被清楚揭示。

结果显示丹参酮类可以抑制凝血酶，人参皂苷类可以稳定促进凝血酶，而酚酸类几乎对凝血酶活性无影响。

其中的人参皂苷类可以拮抗丹参酮类引起凝血酶抑制：PPT型人参皂苷(Rg和Rh)剂量依赖性的拮抗丹参酮引起的凝血酶抑制；PPD型人参皂苷(Rb和Rd)具有更强的拮抗作用，可以中和甚至反转丹参酮引起的凝血酶抑制。人参皂苷的拮抗作用为控制丹参酮药效和降低其副作用提供了一种新的方式，尤其是在多靶点疗法中会扮演重要角色。

丹参酮内部成员间为加和作用，其中的三对组合，丹参酮IIA和15，16-二氢丹参酮，丹参酮IIA和隐丹参酮，15，16-二氢丹参酮和丹参酮，具有较低的IC₅₀值和稳定的加和作用，在联合用药和降低受体耐药性方面具有潜在的应用价值。

附图说明

图1：丹七方提取物的色谱图(a)和改造后化合物库的色谱图(b)。

图2：丹七方中酚酸类、皂苷类、丹参酮类代表性化合物和结构特征。

图3：丹七方半制备液相色谱图。

图4：丹七方提取物色谱对应的活性分布图(a)和和改造后化合物库色谱对应的活性分布图(b)。

图5：丹参酮类内部三种组合在不同组合比例下的CI值分布。

图6：丹酚酸A的活性与其在磷酸缓冲液中放置时间的关系图。

具体实施方式

实施例1

背景：丹七方具有活血化瘀的功效，临床上常用于冠心病、心绞痛及气滞血瘀所致的胸痹、心悸气短、胸闷气短等的治疗。丹七方由丹参(RadixSalviamiltiorrhiza)和三七(RadixPanaxnotoginseng)两味中药组成。因其含有多种成分，作用于多种靶点，潜在的多成分相互作用非常复杂。现代研究表明，中医中的“瘀”证与血栓症密切相关。血栓形成是血浆中的凝血酶酶原受到一些血小板和血浆因子激活而生成凝血酶，进而生成纤维蛋白凝块。凝血酶作为其中的关键靶点发挥了重要的作用。目前针对凝血酶的治疗药物有阿加曲班、达比加群和美拉加群等。本实施例将围绕凝血酶揭示丹七方中的活性分子和多成分组合的相互作用。

试剂与耗材：乙腈、甲酸(HPLC级，德国Merck公司)；AglilentZorbaxSB-C18半制备柱，规格为250×9.4mm，5μm(美国Agilent公司)；AglilentExtend-C18分析柱，规格为250×4.6mm，5μm(美国Agilent公司)；凝血酶(沈阳拜英生物技术有限公司)、凝血酶底物S-2238(北京艾德豪克仪器技术有限公司)、DMSO(美国Sigma公司)、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙二胺四乙酸(江苏南京化学试剂有限公司)

步骤1：对丹七方的提取物进行色谱分离和化合物结构鉴定，根据结构相似性将化合物分成不同的化学家族。

丹七方提取物的纯水溶液用于高效液相色谱分析和分离条件优化。

高效液相色谱分析在Agilent1260液相系统偶联6530四极杆-飞行时间串联质谱系统(美国Agilent公司)中进行。

分离色谱柱分别为AglilentExtend-C18分析柱(250×4.6mm，5μm)和AglilentZorbaxSB-C18半制备柱(250×9.4mm，5μm)。

其中分析色谱柱用于与质谱串联而进行结构鉴定。

半制备色谱柱用于后续的色谱峰收集。

分析色谱柱的流动相为0.02％甲酸水溶液和0.02％甲酸乙腈溶液。

分析色谱柱的洗脱梯度为：

0min，10％；

9min，21％；

18min，22％；

23min，24％；

33min，27％；

40min，33％；

52min，41％；

64min，70％；

72min，72％；

80min，100％；

90min，100％。

紫外检测波长0-56.5min为203nm，56.5-90min为281nm。

分析色谱柱流速0.5mL/min。

柱温25℃。

半制备色谱柱的流动相为0.2％甲酸水溶液和乙腈溶液。

半制备色谱柱的洗脱梯度为：

0min，10％；

10min，22％；

18min，23％；

23min，24％；

33min，27％；

40min，33％；

52min，41％；

54min，70％；

62min，72％；

70min，100％；

77min，100％。

紫外检测波长0-60min为203nm，60-77min为281nm。

半制备色谱柱流速2mL/min。

柱温25℃。

质谱检测条件如下：电喷雾正离子模式下采集数据，质量扫描范围为m/z100～1000，毛细管电压3.5kV，雾化气压力35psig，干燥气体积流量10L/min，干燥气温度325℃，Skimmer65V，二级碰撞能量为20、40、80eV。

测定样品前采用混标调谐液校准质量轴。

18个色谱峰的确定是与购自中国药品生物制品检定所的标准品进行质谱数据比对(见表1)，色谱峰所在的位置请见图1a。

通过分析对比化学结构的相似性，丹七方中的化合物可以归属为3个化学家族，即酚酸类、皂苷类、丹参酮类(见图2)。

每个家族都具有各自特征性的化学基团：

酚酸类多是咖啡酸(C₉H₈O₄)和丹参素(C₉H₁₀O₅)的聚合物，羧基和酚羟基是其特征性基团；

人参皂苷的疏水性母核由17碳原子围绕成4个环，母核上连有亲水性的糖基；

丹参酮的基本结构也是由17碳原子围绕成4个环，不同的是母核上具有众多的共轭双键和C环上具有醌基。

基于化学结构相似性进行分类对于后续的化合物库改造、多成分组合相互作用的发现必不可少。

步骤2：对色谱图进行分解并逐个收集每个色谱峰的馏分，记录其色谱峰面积。取丹七方提取物用纯水配成200mg/mL的溶液，进样100微升，半制备色谱见图3。通过保留时间设置时间窗，对各个峰进行收集，收集程序见表2。

步骤3：选择丹酚酸A、人参皂苷Rh1、丹参酮IIA分别作为丹酚酸、人参皂苷、丹参酮家族的代表化合物，并测试记录其在100μM浓度下的色谱峰面积，分别为2302、269、787。每个化学家族中的其他化合物以重新组合的方式向该标准看齐，从而获得新的天然产物化合物库。

原来药材提取物与改造后的天然化合物库的色谱对比见图1。

在原提取物图1的a中，各个成分含量未知且参差不齐，色谱峰响应有高有低。

而在改造后的天然化合物库图1的b中，同一家族的色谱峰响应相近，同一化学家族的化合物面积处于同一数量级(表3)：酚酸类面积为2044-2601，皂苷类面积为218-284，丹参酮类面积为721-783.

根据收录在中国药典中的一测多评方法，即对于结构具有高度相似性的化合物群可以用一个标准品来评定其他多个化合物，新化合物库中的各个化合物的含量接近标准100μM。从而完成了从中药粗提物到适用于筛选的化合物库的改造。

步骤4：高通量筛选技术采用多孔道酶标仪对中药提取物进行活性成分扫描。如图4所示，在原提取物中，色谱峰11显示出较好的活性；而在新的化合物库中，色谱峰11、15、16、17、18具有明显的活性。通过对比化合物鉴定结果，色谱峰11、15、16、17、18分别为丹酚酸A、15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA。通过改造化合物库，原提取物中的微量成分丹参酮家族被筛选出来。为了最终确定筛选结果的准确性，我们从中检所购买了对应的标准品进行验证。结果如表4所示，15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA具有较强的凝血酶抑制活性，IC₅₀分别为92.46、101.59、332.65、39.26μM。这结果表明改造后的天然化合物库对于筛选微量活性成分具有明显优势。丹酚酸A的活性并不好，在125μM时的活性值仅为-0.82％。

考虑到丹酚酸A著名的不稳定性，可以推断丹酚酸A本身可能不具有抑制凝血酶的活性，而它在缓冲液中的转化产物具有抑制凝血酶的活性。因此，我们将丹酚酸A放置于磷酸缓冲液中分别放置1、2、3、4小时后进行活性测试，发现其抑制凝血酶的活性呈递增趋势(图5)，从而证明了丹酚酸A通过转化为其他成分而间接发挥作用。

磷酸缓冲液的配制方法：

步骤5：上述实验结果表明，丹参酮类成分是丹七方中具有凝血酶抑制活性的化学家族。因此，围绕该家族展开了家族内和家族间的多成分相互作用联系。在丹参酮内部，考虑到15，16-二氢丹参酮(92.46μM)、隐丹参酮(101.59μM)、丹参酮IIA(39.26μM)的IC₅₀值较为接近，有潜在的组合应用的价值；而丹参酮I(332.65μM)的IC₅₀明显高于上述三个化合物，在本实验中暂不与其他化合物组合应用。应用CombinationIndex作为指标(当CI＝1，加和作用；CI＞1，拮抗作用；CI＜1，协同作用)，我们设计了7种不同组合比例如1∶10、1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1用来测试丹参酮IIA和15，16-二氢丹参酮I(表5)，15，16-二氢丹参酮I和隐丹参酮(表6)，丹参酮IIA和隐丹参酮(表7)的IC₅₀值。这些数值用于计算CI指数，如图所示，几乎所有组合的CI指数位于0.9-1.1之间，表明这些丹参酮内部为加和作用。

对于丹参酮类与酚酸类、皂苷类的家族间的相互作用，因为涉及的组别过多，我们采用是否具有“浓度依赖性的相互作用”作为指标用于判断其作用关系，即用低、中、高三个浓度的酚酸类或皂苷类化合物对丹参酮抗凝血酶活性的干扰是否具有浓度依赖性作为判断标准。结果表明，PPT型的人参皂苷可以浓度依赖性的拮抗丹参酮(表8)。PPD型的人参皂苷则具有更强的拮抗作用，当PPD型人参皂苷与丹参酮的比例为1∶1时，Rd可以使丹参酮的抑制率降为0-10％(表9)，几乎抵消了丹参酮对凝血酶的抑制作用；而Rb1则甚至反转了丹参酮的抑制作用，表现为促进(表9)。酚酸类则没有表现出浓度依赖性的干预作用(表10)，这可能与酚酸类本身对凝血酶就没有明显活性有关。

实施例2

本发明涉及一种丹七方的药物活性成分的重新组合方法；该方法的步骤1-4同实施例1；

步骤5：对步骤1中药物的制备方法进行改进，使得步骤1中提取物中含量过少的活性化合物的含量增加，使得步骤1中提取物中因含量过大的化合物的含量减少，从而得到重新组合的药物提取物。

实施例3

一种抑制凝血酶活性的药物组合物，由丹参酮类化合物中的一种、两种、或多种组成；丹参酮类化合物为：15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA；高效液相检测到峰面积：各丹参酮类化合物面积分别为721-783。

实施例4

一种抑制凝血酶活性的药物组合物，其中包含：丹参酮类化合物；由丹参酮类化合物中的一种、两种、或多种组成；15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA；浓度范围表示91.61-99.49μM。

实施例5

一种促进凝血酶活性的药物组合物，由人参皂苷类化合物中的一种、两种、或多种组成；人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb；高效液相检测到峰面积：各皂苷类化合物面积分别为218-284。

实施例6

一种促进凝血酶活性的药物组合物，由人参皂苷类化合物中的一种、两种、或多种组成；人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb；以浓度范围表示81.04-105.58μM。

实施例7

一种调控凝血酶活性的药物组合物，其中包含：丹参酮类化合物、人参皂苷类化合物；

实施例8

实施例9

一种调控凝血酶活性的药物组合物，其中包含：丹参酮类化合物、人参皂苷类化合物、丹酚酸A；

丹酚酸A的面积分别为2534。

实施例10.

丹酚酸A，以浓度表示为110.08μM。

实施例11.

一种具备抑制凝血酶活性的丹酚酸A，其丹酚酸A被溶解于磷酸缓冲液中。磷酸缓冲液的制备方法是：精密称取1.9120g磷酸二氢钾、13.8920g磷酸氢二钾(三水)及乙二胺四乙酸(EDTA)37.24mg，加入超纯水约960mL超声促溶，取出，定容至1000mL即得含75mmol/L磷酸根离子、200μmol/LEDTA，pH7.4的磷酸盐缓冲液。

表1丹七方中的化合物结构鉴定

^a：没有检测到该化合物母离子。

表2丹七方中的18个化合物在半制备柱上的保留时间、收集时间窗、收集体积以及峰面积

表3丹七方提取物与改造后化合物库的峰面积比较

表4丹七方中化合物的凝血酶抑制活性

^a检测浓度为125μM。

^b没有检测到IC₅₀。

表5丹参酮IIA和15，16-二氢丹参酮I抗凝血酶的加和作用

表615，16-二氢丹参酮I和隐丹参酮抗凝血酶的加和作用

表7丹参酮IIA和隐丹参酮抗凝血酶的加和作用

表8PPT型人参皂苷对丹参酮抑制凝血酶活性的拮抗作用

表9PPD型人参皂苷对丹参酮抑制凝血酶活性的中和及反转作用

^a当皂苷和丹参酮的比例为1∶1(1皂苷+1丹参酮)时，混合物的凝血酶抑制率为0％-10％。即皂苷的促进作用中和了丹参酮的抑制作用。

^b当皂苷和丹参酮的比例为1∶1(1皂苷+1丹参酮)时，混合物的凝血酶抑制率为负数。即皂苷的促进作用反转了丹参酮的抑制作用。

表10a丹酚酸(丹参素和原儿茶醛)对丹参酮抑制凝血酶活性无浓度依赖性的相互作用

表10b丹酚酸(迷迭香酸和紫草酸)对丹参酮抑制凝血酶活性无浓度依赖性的相互作用

表10c丹酚酸(丹酚酸B和丹酚酸A)对丹参酮抑制凝血酶活性无浓度依赖性的相互作用

Claims

1.一种揭示药物活性成分及其组合的方法，包括下述步骤：

步骤1：对药物提取物进行色谱分离和化合物结构鉴定，根据结构相似性将化合物归属于不同的化学家族；

步骤2：对色谱图进行分解并逐个收集每个色谱峰的馏分，记录其色谱峰面积；

步骤3：从每个化学家族中选择一个容易获取的化合物作为代表，测试记录各代表在同一浓度的色谱峰面积作为标准，每个化学家族中的其他化合物以重新组合的方式向该标准看齐，对天然化合物库进行改造；

步骤4：应用高通量筛选技术对改造后的天然化合物库进行扫描并找到活性化合物；

步骤5：围绕活性化合物所在的化学家族进行组合，选用指标或模型评价家族内和家族间组合的相互作用关系，这种关系可能是拮抗、相加、协同或者无明显相互关系。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述结构相似性为在官能团、药效团、分子量等方面具有的相似性；

所述药物提取物的来源包括而不限于：植物提取物、动物提取物、微生物提取物、真菌提取物、矿物提取物等天然产物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化合物结构鉴定为基于质谱的化合物分子量和特征碎片离子比对或基于核磁共振技术、红外光谱、紫外光谱的化合物结构解析；所述色谱分离为分析型、半制备型或制备型的高效液相色谱。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱图进行分解为通过色谱图的保留时间设置时间窗，以色谱峰为单位的馏分收集。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述容易获取的化合物为在天然产物中丰度高且易制备纯化的或者市场上价格便宜的标准品。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重新组合为按照规则，通过手动移液器或自动化仪器对各个馏分进行混合。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高通量筛选技术为多孔道酶标仪检测或基于靶细胞和靶蛋白的亲和色谱筛选；所述指标或模型为CombinationIndex理论、Blissindependence模型、Loeweadditivism模型或者剂量依赖性的相互作用趋势。

8.根据权利要求1所述一种揭示药物活性成分及其组合的方法，其特征在于，所揭示的丹七方中有联合用药价值的组合关系包括丹参酮类化合物对凝血酶抑制的加和作用和人参皂苷类对丹参酮类抗凝血酶活性的拮抗作用。

9.一种抑制凝血酶活性的药物组合物，由丹参酮类化合物中的一种、两种、或多种组成；丹参酮类化合物为：15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA；或；

一种促进凝血酶活性的药物组合物，由人参皂苷类化合物中的一种、两种、或多种组成；人参皂苷类化合物为：人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb；或；

由丹参酮类化合物中的一种、两种、或多种组成；丹参酮类化合物为：15，16-二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA；

由人参皂苷类化合物中的一种、两种、或多种组成；人参皂苷类化合物为：人参皂苷Rg1、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb。

10.一种具备凝血酶抑制活性的丹酚酸A的组合物，其组成是：丹酚酸A、磷酸缓冲液。