CN105486775B - 一种右归丸中多种成分含量的检测方法 - Google Patents

一种右归丸中多种成分含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种右归丸中多种成分含量的检测方法。所述检测方法包括如下步骤：1)利用甲醇超声提取右归丸，然后进行滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液；2)向所述供试品溶液中加入内标溶液，作为待测样品；3)采用高效液相色谱‑电喷雾串联质谱检测所述待测样品，即得到右归丸中下述任一种成分的含量。本发明建立的LC‑ESI‑MS/MS(high‑performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry)检测方法具有灵敏度高和专属性强的特点，并对20批不同来源的市售右归丸成药中的16种成分进行了定量测定，覆盖范围广，以期建立系统、全面的右归丸质量评定方法。

Description

一种右归丸中多种成分含量的检测方法
技术领域
本发明涉及一种右归丸中多种成分含量的检测方法，属于成分检测领域。
背景技术
右归丸出自《景岳全书》，其组成和制备方法为“大怀熟地八两，山药(炒)四两，山茱萸(微炒)三两，枸杞(微炒)四两，鹿角胶(炒珠)四两，菟丝子(制)四两，杜仲(姜汤炒)四两，当归三两(便溏勿用)，肉桂二两(渐可加至四两)，制附子二两(渐可加至五六两)。上先将熟地蒸烂杵膏，加炼蜜为丸，如梧桐子大”。右归丸被后世广泛应用临床治疗肾阳虚的病证，并具有确切疗效。
目前对右归丸化学成分报道较少，杜丽霞等(杜丽霞，何文智，刘晓阳，王智民，任艳玲.左_右归丸及其拆方中马钱苷的变化规律.中国实验方剂学杂志，2014，20(21)：56-59)采用HPLC法测定了右归丸中马钱苷的含量，为右归丸的质量控制提供了标准；刘加宝(刘加宝.HPLC法测定右归丸中桂皮醛的含量.黑龙江科学，2014，5(8)：15-16)通过HPLC法建立了快速测定右归丸中桂皮醛含量的方法；王丽双(王丽双.中药复方左归丸、右归丸和济生肾气丸的鉴别和质量评价研究：[硕士学位论文]，山东大学，2011年)建立了红外指纹图谱、HPLC指纹图谱鉴定方法，对右归丸的质量进行评价。但以上研究仅选取了右归丸中一个活性成分测定或仅进行定性分析，覆盖范围相对局限，右归丸中其他化学成分尚不清楚，应用于右归丸的质量评价难免相对片面。
发明内容
本发明的目的是提供一种右归丸中多种成分含量的检测方法。
本发明所提供的检测方法，包括如下步骤：
1)利用甲醇超声提取右归丸，然后进行滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液；
2)向所述供试品溶液中加入内标溶液，作为待测样品；
3)采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测所述待测样品，即得到右归丸中下述任一种成分的含量：
a)新乌头原碱、b)山茱萸新苷、c)地黄苷A、d)附子灵、e)宋果灵、f)金丝桃苷、g)苯甲酰次乌头原碱、h)松果菊苷、i)苯甲酰乌头原碱、j)地黄苷D、k)苯甲酰中乌头原碱、l)尼奥灵、m)马钱苷、n)多根乌头碱、o)獐芽菜苷和p)莫诺苷。
上述的检测方法中，步骤1)中，过滤时得到的前几滴滤液作为初滤液，常弃去，取0.1～0.2mL即可，后续所得滤液为续滤液，用于测定。
上述的检测方法中，步骤1)中，所述甲醇的用量可为：0.1g所述右归丸需要添加1～5mL甲醇。
上述的检测方法中，步骤1)中，所述超声提取的频率可为20～80KHz，具体可为45KHz，所述超声提取的时间可为30～60min，具体可为30min；
所述滤膜可为尼龙66膜，所述滤膜的孔径可为0.22μm或0.45μm。
上述的检测方法中，步骤2)中，
所述内标溶液为丁螺环酮的甲醇水溶液；
所述丁螺环酮的用量为：1～5ng/mL所述待测样品。
上述的检测方法中，步骤3)中，所述高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测方法中的色谱条件如下：
流动相A：体积分数为0.05％～0.2％的甲酸的乙腈溶液，具体可为0.1％；
流动相B：体积分数为0.05％～0.2％的甲酸的水溶液，具体可为0.1％；
色谱柱：Agilent Eclipse Plus-C18色谱柱，柱长为100mm、柱径为2.1mm和填料粒径为3.5μm；
柱温：20～30℃，具体可为25℃；
流速：0.45mL/min；
进样体积：10或20μL；
每个样品的运行时间：12.0min；
洗脱梯度如下：
0-1.5min：流动相A体积分数为98％，流动相B体积分数为2％；
1.5-4min：流动相A体积分数从98％降至55％，流动相B体积分数从2％升至45％；
4-8min：流动相A体积分数从55％降至15％，流动相B体积分数从45％升至85％；
8-9min：流动相A体积分数为15％，流动相B体积分数为85％；
9-9.01min：流动相A体积分数从15％升至98％，流动相B体积分数从85％降至2％；
9-12min：流动相A体积分数为98％，流动相B体积分数为2％。
所述高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测步骤中的质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子化源；
质谱工作模式：正离子扫描的MRM检测模式；
气帘气、雾化气和涡流加热气均使用氮气，其设定值分别为20～30psi、50～60psi和50～60psi，具体可为20psi、55psi和55psi；
离子源温度为350～500℃，具体可为500℃；
离子源喷射电压为4500～5500V，具体可为5500V。
所述右归丸中的16种化合物按编号1-编号16依次为新乌头原碱、山茱萸新苷、地黄苷A、附子灵、宋果灵、金丝桃苷、苯甲酰次乌头原碱、松果菊苷、苯甲酰乌头原碱、地黄苷D、苯甲酰中乌头原碱、尼奥灵、马钱苷、多根乌头碱、獐芽菜苷和莫诺苷，此16种化合物均具有很强的正离子信号。
其中，编号为1的新乌头原碱的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为486.2；产品离子定量值(m/z)为436.2；产品离子定性值(m/z)为454.2448，404.2079；去簇电压为250V；碰撞电压为44eV；碰撞室射出电压为25V。
编号为2的山茱萸新苷的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为565.1；产品离子定量值(m/z)为163.3；产品离子定性值(m/z)为403.1011，255.0845；去簇电压为250V；碰撞电压为39eV；碰撞室射出电压为12V。
编号为3的地黄苷A的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为547.1；产品离子定量值(m/z)为203.1；产品离子定性值(m/z)为385.1115，203.0532；去簇电压为151V；碰撞电压为44eV；碰撞室射出电压为15V。
编号为4的附子灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为454.1；产品离子定量值(m/z)为436.2；产品离子定性值(m/z)为436.2707，418.2600；去簇电压为89V；碰撞电压为41eV；碰撞室射出电压为25V。
编号为5的宋果灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为358.2；产品离子定量值(m/z)为340.2；产品离子定性值(m/z)为340.2280；去簇电压为98V；碰撞电压为35eV；碰撞室射出电压为20V。
编号为6的金丝桃苷的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为487.1；产品离子定量值(m/z)为185.1；产品离子定性值(m/z)为325.0329，185.0425；去簇电压为100V；碰撞电压为33eV；碰撞室射出电压为10V。
编号为7的苯甲酰次乌头原碱的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为574.2；产品离子定量值(m/z)为542.2；产品离子定性值(m/z)为542.2766，510.2499；去簇电压为150V；碰撞电压为41eV；碰撞室射出电压为15V。
编号为8的松果菊苷的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为809.2；产品离子定量值(m/z)为663.2；产品离子定性值(m/z)为663.1917，501.1384；去簇电压为50V；碰撞电压为62eV；碰撞室射出电压为15V。
编号为9的苯甲酰乌头原碱的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为604.3；产品离子定量值(m/z)为572.3；产品离子定性值(m/z)为572.2868，554.2764；去簇电压为150V；碰撞电压为49eV；碰撞室射出电压为15V。
编号为10的地黄苷D的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为709.2；产品离子定量值(m/z)为365.2；产品离子定性值(m/z)为501.1592，365.1068；去簇电压为90V；碰撞电压为53eV；碰撞室射出电压为25V。
编号为11的苯甲酰中乌头原碱的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为590.2；产品离子定量值(m/z)为540.2；产品离子定性值(m/z)为540.2610，508.2345；去簇电压为70V；碰撞电压为47eV；碰撞室射出电压为30V。
编号为12的尼奥灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为438.2；产品离子定量值(m/z)为420.2；产品离子定性值(m/z)为420.2761，388.2498；去簇电压为60V；碰撞电压为40eV；碰撞室射出电压为31V。
编号为13的马钱苷的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为413.2；产品离子定量值(m/z)为219.0；产品离子定性值(m/z)为395.1322，251.0896；去簇电压为110V；碰撞电压为30eV；碰撞室射出电压为12V。
编号为14的多根乌头碱的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为378.2；产品离子定量值(m/z)为360.2；产品离子定性值(m/z)为360.2546，328.2280；去簇电压为60V；碰撞电压为42eV；碰撞室射出电压为25V。
编号为15的獐芽菜苷的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为381.1；产品离子定量值(m/z)为219.2；产品离子定性值(m/z)为255.0845，219.0633；去簇电压为130V；碰撞电压为25eV；碰撞室射出电压为15V。
编号为16的莫诺苷的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为429.1；产品离子定量值(m/z)为185.0；产品离子定性值(m/z)为273.0947，267.0842；去簇电压为160V；碰撞电压为35eV；碰撞室射出电压为15V。
上述检测方法中，步骤3)中，所述高效液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)检测方法具体可通过API 5000Qtrap液相质谱联用系统(含2台岛津LC-20AD泵，SIL-20AC恒温自动进样器，CTO-20A柱温箱，CBM-20A控制器，ESI和APCI接口离子源，Analyst Software1.5.2色谱工作站)来实施，该设备购自美国应用生物系统公司。
本发明检测方法是通过如下实现对各种成分的定量检测的：首先配制含有各种成分的标准品系列溶液，然后加入内标溶液作为供试品，输入至高效液相色谱-电喷雾串联质谱中，按照所述检测条件进行检测，得到每种成分与内标的峰面积，然后以每种成分与内标的峰面积的比值作为纵坐标，以每种成分的浓度作为横坐标，制作标准曲线。测定待测样品时，按照上述方法得到每种成分与内标的峰面积的比值，然后根据所得到的标准曲线就能得到每种成分的浓度，经换算即得到待测样品中每种成分的含量。
本发明建立的LC-ESI-MS/MS(high-performance liquid chromatographycoupled with mass spectrometry)检测方法具有灵敏度高和专属性强的特点，并对20批不同来源的市售右归丸成药中的16种成分进行了定量测定，覆盖范围广，以期建立系统、全面的右归丸质量评定方法。
说明书附图
图1为采用LC-ESI-MS/MS法同时测定右归丸样品中16种活性成分的代表性色谱图，其中图1A为16种活性分色谱图全图，图1B为16种活性成分5.5-7.5min局部放大色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所用的仪器设备如下：API 5000Qtrap液相质谱联用系统(含2台岛津LC-20AD泵，SIL-20AC恒温自动进样器，CTO-20A柱温箱，CBM-20A控制器，ESI和APCI接口离子源，Analyst Software 1.5.2色谱工作站)，购自美国应用生物系统公司；Biofuge15R低温离心机，购自德国Heraeus sepatech公司；Agilent Eclipse Plus-C18色谱柱(100×2.1mm，3.5μm)，购自美国安捷伦科技公司。
下述实施例中所用的药物与试剂如下：
1)20批右归丸样品购自北京市各大药店，厂家批号信息见下表1所示：
表1. 20批右归丸药材的相关信息
2)右归丸中16种测定成分所对应的标准品及其相应编号：
新乌头原碱(Mesaconine，成都曼思特生物科技有限公司，四川，中国，批号：A0642，纯度99.08％)，编号为1，结构式如下：
山茱萸新苷(Cor-nuside I陕西华昱生物科技有限公司，陕西，中国，批号：HY0428，纯度98.00％)，编号为2，结构式如下：
地黄苷A(Rhmannioside A，陕西华昱生物科技有限公司，陕西，中国，批号：HY0524，纯度98.00％)，编号为3，结构式如下：
附子灵(Fuziline，陕西华昱生物科技有限公司，陕西，中国，批号：HO051，纯度98.00％)，编号为4，结构式如下：
宋果灵(Songorine，陕西华昱生物科技有限公司，陕西，中国，批号：H00125，纯度98.00％)，编号为5，结构式如下：
金丝桃苷(Hyperoside，陕西华昱生物科技有限公司，陕西，中国，批号：HA0410，纯度98.00％)，编号为6，结构式如下：
苯甲酰次乌头原碱(Benzoylhypaconitine，陕西华昱生物科技有限公司，陕西，中国，批号：HY040，纯度98.00％)，编号为7，结构式如下：
松果菊苷(Echinacoside，上海永恒生物科技有限公司，上海，中国，批号：20140521，纯度99.08％)，编号为8，结构式如下：
苯甲酰乌头原碱(Benzoylaconitine，陕西华昱生物科技有限公司，陕西，中国，批号：HY039，纯度98.00％)，编号为9，结构式如下：
地黄苷D(Rhmannioside D，陕西华昱生物科技有限公司，陕西，中国，批号：HY0255，纯度98.00％)，编号为10，结构式如下：
苯甲酰中乌头原碱(Benzoylmesaconitine，陕西华昱生物科技有限公司，陕西，中国，批号：HY038，纯度98.00％)，编号为11，结构式如下：
尼奥灵(Neoline，陕西华昱生物科技有限公司，陕西，中国，批号：HB055，纯度98.00％)，编号为12，结构式如下：
马钱苷(Loganin，陕西华昱生物科技有限公司，陕西，中国，批号：HY0613，纯度98.00％)，编号为13，结构式如下：
多根乌头碱(Karacoline，陕西华昱生物科技有限公司，陕西，中国，批号：HB050，纯度98.00％)，编号为14，结构式如下：
獐芽菜苷(Sweroside，陕西华昱生物科技有限公司，陕西，中国，批号：HB0657，纯度98.00％)，编号为15，结构式如下：
莫诺苷(Morroniside，陕西华昱生物科技有限公司，陕西，中国，批号：HB0428，纯度98.00％)，编号为16，结构式如下：
色谱级乙腈和甲醇均购自赛默飞世尔公司；
色谱级甲酸购自德国默克公司。
实施例1、测定右归丸中16种测定成分
1)配制标准品溶液：精密称取16种标准品适量，分别以二甲基亚砜(DMSO)溶解，均配制成浓度为1.00mg/mL的单独标准储备液；
分别精密量取上述标准储备液适量(量取体积取决于各化合物的质谱响应)，置于同一个1.5mL EP管中，加甲醇稀释，获得混合标准储备液，其中，含各化合物的浓度如下：新乌头原碱200ng/mL、山茱萸新苷500ng/mL、地黄苷A 200ng/mL、附子灵200ng/mL、宋果灵200ng/mL、金丝桃苷500ng/mL、苯甲酰次乌头原碱200ng/mL、莫诺苷1000ng/mL、苯甲酰乌头原碱200ng/mL、地黄苷D 500ng/mL、苯甲酰中乌头原碱500ng/mL、尼奥灵500ng/mL、马钱苷1000ng/mL、多根乌头碱100ng/mL、獐芽菜苷200ng/mL、莫诺苷2000ng/mL。再取上述混合标准储备液，以甲醇进行系列稀释，配制成同时含有16种活性成分的混合标准系列溶液。
内标溶液(5ng/mL丁螺环酮)：精密称取盐酸丁螺环酮对照品适量，以甲醇溶解并稀释，配制成浓度为0.1mg/mL的贮备液(以游离型药物计)。精密量取丁螺环酮内标储备液10μL，置于一玻璃容器中，加50％甲醇溶液稀释至200mL，即获得含丁螺环酮5ng/mL的内标溶液。
2)待测右归丸样品处理：分别取表1中的20批不同来源的右归丸样品，各精密称取100mg，加甲醇溶液1mL，超声提取两次，每次30min，冷却至室温，补加甲醇溶液至1mL，0.45μm微孔滤膜过滤，弃去0.1mL滤液作为初滤液，取续滤液，即得供试品溶液。取150μL上述供试品溶液，准确加入150μL内标溶液(5ng/mL丁螺环酮)，涡旋混匀，即得到待测右归丸溶液样品。
3)对待测右归丸溶液样品进行检测：
(a)色谱检测条件如下：流动相A为含0.1％甲酸的乙腈溶液，流动相B为0.1％甲酸水溶液，洗脱梯度参见表2。色谱柱为Agilent Eclipse Plus-C18色谱柱(2.1×100mm，3.5μm)，柱温为室温，流速为0.45mL/min；进样体积为10μL。每个样品的运行时间为12.0min。
表2 HPLC分离所用流动相的洗脱梯度
(b)质谱检测条件如下：经考察，16种化合物均具有很强的正离子信号。最终采用电喷雾离子化源(ESI离子化源)，正离子扫描的MRM检测模式(多反应检测扫描，multireaction monitoring)，16种待测化合物和内标的相应质谱参数如表3所示。
ESI源在正离子模式下进行扫描，气帘气(CUR)、雾化气(NEB)和涡流加热气均使用氮气，其设定值分别为20、55和55psi。离子源温度(TEM)设定为500℃，正离子模式下的源喷射电压设定为5500V。MRM模式下每个通道的滞留时间设定为150ms。
表3.右归丸样品中16种活性成分以及内标丁螺环酮测定的质谱工作参数
NA：未检测到.
*：分子离子峰为[M+Na]+.
IS(internal standard)表示内标物.
按照上述的色谱条件和质谱条件检测利用表1中的20批不同来源的右归丸样品所制备的待测右归丸溶液样品。
4)检测结果如下：
(a)选择性：取20批待测右归丸溶液样品中的第14批，按照步骤3)中的检测条件分别进样测定，结果见图1。结果表明：基质中的共存成分均不干扰16种活性成分的测定，并且16种活性成分彼此之间互不干扰，证明该检测方法的选择性良好。
图1为采用LC-ESI-MS/MS法同时测定右归丸样品中16种活性成分的代表性色谱图，其中图1A为16种活性分色谱图全图，图1B为16种活性成分5.5-7.5min局部放大色谱图，1-地黄苷D，2-地黄苷A，3-新乌头原碱，4-多根乌头碱，5-莫诺苷，6-附子灵，7-宋果灵，8-松果菊苷，9-尼奥灵，10-马钱苷，11-獐牙菜苷，12-金丝桃苷，13-山茱萸新苷，14-苯甲酰中乌头原碱，15-苯甲酰乌头原碱，16-苯甲酰次乌头原碱。
(b)线性范围、检测限和定量限：取步骤1)中的混合标准系列溶液，按步骤2)中的样品处理方法处理后，按照步骤3)中的检测条件进样测定，分别以每种成分与内标峰面积的比值对其浓度作线性回归，权重因子为1/x2，得到相应的回归方程。16种活性成分的回归方程和线性范围如下表4所示：
分别量取步骤1)中的16种混合标准储备液适量，以甲醇：水(1:1，v/v)溶解并稀释，按照步骤3)中的检测条件进样测定，记录色谱图。以峰响应值为基线噪音的10倍(信噪比的10倍)时的进样浓度为定量限(LOQ)；以峰响应值为基线噪音的3倍(信噪比的3倍)时的进样浓度为检测限(LOD)。具体结果如下表4所示：
表4.右归丸样品中16种化合物的回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限
y:各对照品峰面积与内标峰面积的比值.
x:对照品浓度
(c)精密度和准确度
基于各化合物的线性范围，分别选定低、中和高3个水平的步骤1)中的混合标准系列溶液(混标溶液)，于24小时内按照步骤3)中的检测条件进样测定6次，计算各化合物的日内精密度；取同样的步骤1)中的混合标准系列溶液(混标溶液)，每天按照步骤3)中的检测条件进样测定6次，连续测定3天，计算各化合物的日间精密度。精密度与准确度测定结果如表5所示。由表5可知：各化合物的日内和日间精密度(以RSD值表示)均不超过15％，准确度(以RE值表示)均不超过±15％，符合方法学验证的相关指导原则要求。
表5.采用LC-ESI-MS/MS法测定右归丸中16种活性成分的日内和日间精密度及准确度结果(n＝6)
(d)重复性：取适当浓度的步骤1)中的混合标准系列溶液(混标溶液)，按照步骤3)中的检测条件连续进样6次，测得各化合物的峰面积，并计算相应的RSD值。结果表明：各化合物的RSD值均不超过5％，表明此方法重复性好，符合方法学验证的相关指导原则要求，结果见表6。
表6采用LC-ESI-MS/MS法测定右归丸中16种活性成分的重复性实验结果(n＝6)
(e)稳定性：取适当浓度的步骤1)中的混合标准系列溶液(混标溶液)，于室温条件下放置，分别于0、2、4、8、12、24、48、72h按照步骤3)中的检测条件取样测定，并计算相应RSD值。结果表明：各化合物的RSD值值均不超过5％，表明16种化合物在当前检测条件下均具有良好的稳定性，结果见表7。
表7采用LC-ESI-MS/MS法测定右归丸中16种活性成分的稳定性实验结果
(f)回收率：取各化合物含量已知的实际样品(样品-09)，分别精密加入低(加入的相应化合物的量为样品-09中相应化合物质量的80％)、中(加入的相应化合物的量为样品-09中相应化合物质量的100％)、高(加入的相应化合物的量为样品-09中相应化合物质量的120％)3个水平的步骤1)中相应的单独标准储备液，按步骤2)中的样品处理方法处理后按照步骤3)中的检测条件进样测定，并求出相应回收率及RSD值。测试结果如表8所示，从表8可得知：各化合物的回收率介于85-115％范围内，各化合物的RSD值均不超过15％，符合方法学验证的相关指导原则要求。
表8.采用LC-ESI-MS/MS法测定右归丸中15种活性成分的加样回收率结果(n＝6)
(g)表1中的20批不同来源的右归丸样品的分析：按步骤2)中的样品处理方法处理，并按步骤3)中的色谱条件和质谱条件利用表1中的20批不同来源的右归丸样品所制备的待测右归丸溶液样品进样测定，测定结果如表9所示：
表9. 20批右归丸样品中16种化合物的实测浓度(mg/g)

Claims (2)

1.一种右归丸中多种成分含量的检测方法，包括如下步骤：
1)利用甲醇超声提取右归丸，然后进行滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液；
所述甲醇的用量为：0.1g所述右归丸需要添加1～5mL甲醇；
所述超声提取的频率为20～80KHz，所述超声提取的时间为30～60min；
所述滤膜为尼龙66膜，所述滤膜的孔径为0.22μm或0.45μm；
2)向所述供试品溶液中加入内标溶液，作为待测样品；
所述内标溶液为丁螺环酮的甲醇水溶液；
所述丁螺环酮的用量为：1～5ng/mL所述待测样品；
3)采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测所述待测样品，即同时得到右归丸中下述16种成分的含量：
a)新乌头原碱、b)山茱萸新苷、c)地黄苷A、d)附子灵、e)宋果灵、f)金丝桃苷、g)苯甲酰次乌头原碱、h)松果菊苷、i)苯甲酰乌头原碱、j)地黄苷D、k)苯甲酰中乌头原碱、l)尼奥灵、m)马钱苷、n)多根乌头碱、o)獐芽菜苷和p)莫诺苷；
所述高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测步骤中的色谱条件如下：
流动相A：体积分数为0.05％～0.2％的甲酸的乙腈溶液；
流动相B：体积分数为0.05％～0.2％的甲酸的水溶液；
色谱柱：Agilent Eclipse Plus-C18色谱柱，柱长为100mm、柱径为2.1mm和填料粒径为3.5μm；
柱温：20～30℃；
流速：0.45mL/min；
进样体积：10或20μL；
每个样品的运行时间：12.0min；
洗脱梯度如下：
0-1.5min：流动相A体积分数为98％，流动相B体积分数为2％；
1.5-4min：流动相A体积分数从98％降至55％，流动相B体积分数从2％升至45％；
4-8min：流动相A体积分数从55％降至15％，流动相B体积分数从45％升至85％；
8-9min：流动相A体积分数为15％，流动相B体积分数为85％；
9-9.01min：流动相A体积分数从15％升至98％，流动相B体积分数从85％降至2％；
9-12min：流动相A体积分数为98％，流动相B体积分数为2％；
所述高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测步骤中的质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子化源；
质谱工作模式：正离子扫描的MRM检测模式；
气帘气、雾化气和涡流加热气均使用氮气，其设定值分别为20～30psi、50～60psi和50～60psi；
离子源温度为350～500℃；
离子源喷射电压为4500～5500V。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤3)中，所述高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测步骤中，各成分的质谱条件如下：
1)所述新乌头原碱的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为486.2；产品离子定量值(m/z)为436.2；产品离子定性值(m/z)为454.2448，404.2079；去簇电压为250V；碰撞电压为44eV；碰撞室射出电压为25V；
2)所述山茱萸新苷的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为565.1；产品离子定量值(m/z)为163.3；产品离子定性值(m/z)为403.1011，255.0845；去簇电压为250V；碰撞电压为39eV；碰撞室射出电压为12V；
3)所述地黄苷A的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为547.1；产品离子定量值(m/z)为203.1；产品离子定性值(m/z)为385.1115，203.0532；去簇电压为151V；碰撞电压为44eV；碰撞室射出电压为15V；
4)所述附子灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为454.1；产品离子定量值(m/z)为436.2；产品离子定性值(m/z)为436.2707，418.2600；去簇电压为89V；碰撞电压为41eV；碰撞室射出电压为25V；
5)所述宋果灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为358.2；产品离子定量值(m/z)为340.2；产品离子定性值(m/z)为340.2280；去簇电压为98V；碰撞电压为35eV；碰撞室射出电压为20V；
6)所述金丝桃苷的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为487.1；产品离子定量值(m/z)为185.1；产品离子定性值(m/z)为325.0329，185.0425；去簇电压为100V；碰撞电压为33eV；碰撞室射出电压为10V；
7)所述苯甲酰次乌头原碱的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为574.2；产品离子定量值(m/z)为542.2；产品离子定性值(m/z)为542.2766，510.2499；去簇电压为150V；碰撞电压为41eV；碰撞室射出电压为15V；
8)所述松果菊苷的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为809.2；产品离子定量值(m/z)为663.2；产品离子定性值(m/z)为663.1917，501.1384；去簇电压为50V；碰撞电压为62eV；碰撞室射出电压为15V；
9)所述苯甲酰乌头原碱的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为604.3；产品离子定量值(m/z)为572.3；产品离子定性值(m/z)为572.2868，554.2764；去簇电压为150V；碰撞电压为49eV；碰撞室射出电压为15V；
10)所述地黄苷D的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为709.2；产品离子定量值(m/z)为365.2；产品离子定性值(m/z)为501.1592，365.1068；去簇电压为90V；碰撞电压为53eV；碰撞室射出电压为25V；
11)所述苯甲酰中乌头原碱的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为590.2；产品离子定量值(m/z)为540.2；产品离子定性值(m/z)为540.2610，508.2345；去簇电压为70V；碰撞电压为47eV；碰撞室射出电压为30V；
12)所述尼奥灵的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为438.2；产品离子定量值(m/z)为420.2；产品离子定性值(m/z)为420.2761，388.2498；去簇电压为60V；碰撞电压为40eV；碰撞室射出电压为31V；
13)所述马钱苷的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为413.2；产品离子定量值(m/z)为219.0；产品离子定性值(m/z)为395.1322，251.0896；去簇电压为110V；碰撞电压为30eV；碰撞室射出电压为12V；
14)所述多根乌头碱的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为378.2；产品离子定量值(m/z)为360.2；产品离子定性值(m/z)为360.2546，328.2280；去簇电压为60V；碰撞电压为42eV；碰撞室射出电压为25V；
15)所述獐芽菜苷的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为381.1；产品离子定量值(m/z)为219.2；产品离子定性值(m/z)为255.0845，219.0633；去簇电压为130V；碰撞电压为25eV；碰撞室射出电压为15V；
16)所述莫诺苷的质谱工作参数如下：母离子(m/z)为429.1；产品离子定量值(m/z)为185.0；产品离子定性值(m/z)为273.0947，267.0842；去簇电压为160V；碰撞电压为35eV；碰撞室射出电压为15V。
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