CN103487531A - 一种适用于天然产物高通量筛选的化合物库高效制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种复杂天然产物高通量筛选的化合物库高效制备方法。该方法通过将常规分析型液相色谱与自动组分收集系统联用,在软件的控制下,运行基于优化的分析条件,设置各指纹峰的起始时间和结束时间以及收集位置,组分收集程序自动、精确收集各指纹峰,经简单快速的脱溶剂处理即可获得几十个至上百个微量样品构成的化合物库,所制备的化合物库可用于多种系统的高通量筛选。该组分收集系统还可以同步联接液相色谱-质谱系统,进行收集馏分的纯度检测、结构推测和成分鉴定。本发明的化合物库制备方法具有快速、精确、自动化程度高、操作简便、成本较低、适用性强等优点;所制备样品纯度高,基本仅含单个化合物,极少数含有共洗脱成分。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物中化合物提取分离领域,涉及一种适用于复杂天然产物高通量筛选的化合物库高效制备方法。
背景技术
天然药物是现代创新药物发现的重要来源,据统计,目前上市药物中有近50%的药物与天然产物有关,约60%的抗癌药和75%抗感染药源于天然产物。近年来,国际上利用天然产物作为先导化合物,在抗菌、抗寄生虫、防治心脑血管疾病和抗肿瘤等疾病药物发现方面取得了重大进展,仅2005至2007年就有13个来源于天然产物及其衍生物的新药上市。截至2008年3月,国际上处于不同临床阶段的抗癌药中,来源于陆地植物的24个,来源于微生物的18个,来源于海洋动植物资源的9个。这些数据充分说明天然产物是现代创新药物研发的重要宝库。
从中草药及其复方中发现新的先导化合物为我国的特色和公认的捷径。但传统的主要通过从天然药物中分离鉴定化合物单体进行天然活性物质发现的研究模式费时、费力。提高从天然产物中发现先导化合物的效率,缩短发现时间,降低发现成本,获得效果理想的先导化合物越来越受到重视,进行高通量活性筛选已经成为天然活性物质发现的重要手段。
高通量筛选技术是以分子和细胞水平的实验方法为基础,在微孔板上以自动化操作系统执行实验过程,通过灵敏的检测仪器采集实验数据并对数据进行分析处理(参见:路群,顾觉奋;药物高通量筛选技术应用研究进展,今日药学,2010,20:2-15)。该技术充分整合了计算机控制、自动化操作、高灵敏度检测和数据结果自动采集的优势,适用于以靶点或细胞功能为基础的活性成分筛选,是新药研发技术和方法的一大进步。高通量筛选的必要条件是具备一个大规模的化合物库,化合物库是创新药物开发的源头。目前,化合物库的来源主要包括组合化学的自动化合成和天然药物中分离制备两个方面。从天然产物中分离出来的化合物,由于其母核结构和活性基团由长期的自然选择形成,它们所表现出来的广泛的生物活性在药物发现中具有人工合成化合物所无法比拟的优势;此外,自然界的植物、动物及微生物数量众多,且包含化合物的结构类型多样,仅一味中药就含有几十个甚至上百个成分。所以,天然产物来源的化合物在质量上和数量上都为高通量筛选的理想选择,天然来源的化合物库建设已经或正在成为跨国制药企业及药物研发部门致力于开展的重要内容。
目前,对源于天然产物的化合物库主要通过从自然界的植物、动物、微生物和海洋生物中经多次分离纯化来制备单体化合物,这是目前建立天然产物库的主要途径。因天然药物成分复杂,含量高低差异悬殊,一些难分离成分和微量成分不容易分离得到,且一些不稳定成分在分离过程中易丢失。因此,这种方式投入人力物力大,分离周期长,难以形成规模化制备。这也是目前已建成天然产物库的化合物数量,远远低于自然界中实际存在的天然化合物数量的主要限制性原因。另有报道将天然产物提取物采用制备型高效液相分离,按时间分为若干段收集。一般情况下,每隔3min或5min收集一个馏分,近年来,也有文献报道更精细地每隔1min收集单个馏分(参见:Tyler A.Johnson,Johann Sohn,Wayne D.Inman,et al.Natural Product Libraries to Accelerate theHigh-Throughput Discovery of Therapeutic Leads.Journal of Natural Products.2011,74:2545-2555.Tim S.Bugni,Mary Kay Harper,Malcolm W.B.McCulloch,Jason Reppart and Chris M.Ireland.Fractionated Marine Invertebrate ExtractLibraries for Drug Discovery.Molecules.2008,13,1372-1383)。采用制备型液相分离,假设采用直径20mm,长250mm色谱柱,色谱分离时间为60min,流速以20ml/min计算,每隔1min收集一个样品,可收集60个馏分,每个馏分体积为20ml。由于天然药物成分复杂,流动相中大多含水,通常至少需花费48h或更长时间才能去除各馏分的溶剂,得到干燥粉末用于活性测定和液质分析。因天然药物中含有众多成分且结构复杂多样,按时间分段收集的馏分往往一个馏分中就包含3个以上甚至更多化合物,经初次活性测定后,还需要对显示有活性的馏分进一步分离纯化制备出单体化合物,即需再次重复进行样品富集、分离纯化、馏分收集、溶剂去除、样品干燥、活性测试和结构鉴定等繁琐的操作步骤,来确定活性馏分中的活性成分。这样重复进样收集,整个制备周期需要花费几个月甚至更长的时间,大大降低了高通量筛选的效率。
CN1287109A公开了一种用于制备大量相关化合物组合库的HPLC方法,但是该方法所制备的化合物必须具有类似的洗脱条件,而且采用HPLC分离后的组分纯度不够高,还需要TLC等方法进一步辅助分离。CN1044339A公开了一种具有多个自动收集装置的液相色谱系统,该系统具有使混合物样品中的大量组分可被分别收集的优点,以及可使任意被收集的组分有选择地和自动地进行重新分离的优点,但是该系统所得到的组分纯度也不够高。
CN101294975A公开了一种成组毒理学分析仪,该装置由组分分离模块、组分收集模块、自动机械臂、溶液处理平台、化合物测定模块、数据处理与控制系统六大模块组成,能够在线高通量完成样品分离、组分分析与生物活性分析等三部分相对繁杂的工作,其所分离的组分仍以混合物为主。
现有技术中对天然产物高通量化合物库的制备方法做了众多的尝试,张晓哲(基于构库思想的中药分离与表征方法研究,中国科学院研究生院(大连化学物理研究所)博士论文,2004年,113-129)提出样品先进行粗分离,然后先用分析型高效液相色谱优化条件,然后再用制备型高效液相色谱线性放大,来进行天然产物高通量化合物库的HPLC制备。褚洪标;等(天然产物样品的高通量制备技术,《云南化工》,第30卷第3期,2003年12月31日,58-60页)和黄麟;等(高通量分离纯化技术在天然产物化学中的应用,《国外医学药学分册》,第30卷第3期,2006年12月31日,354-357)都提出采用在HPLC色谱后联用固相萃取技术(SPE),来解决经典的色谱不能完全分离天然产物复杂多样的样品的问题。此外,现有技术中还有人采用在制备高效液相后,连接多个色谱柱进行进一步的分离提取的方法来制备天然产物化合物库。
综上所述,现有技术中虽然已经有了采用HPLC来进行天然产物高通量化合物库制备的尝试,但是主要采用制备型HPLC,并且还要结合其他后继的分离纯化技术手段,或者再次进行多通道的制备纯化,方法仍然较繁琐,不能通过一次HPLC分离即得到以单体化合物为主的化合物库,并不能直接用于高通量筛选,因此,这些方法仍需要进一步的改进。
发明内容
本发明建立了一种适用于天然产物高通量筛选的化合物库高效制备方法。
本发明的具体工艺如下:
一种适用于天然产物高通量筛选的化合物库高效制备方法,该方法包括下述步骤:
a)选取一种天然产物作为分析对象;
b)采用常规分析型液相色谱系统与自动组分收集系统联用,建立上述分析对象的全成分色谱指纹图谱分析方法;
c)运行步骤b)中的色谱指纹图谱分析条件,通过软件设置各指纹峰的起始时间和结束时间以及收集位置,编辑组分收集系统的程序,自动、精确收集各指纹峰;
d)针对每个指纹峰,分别运行1~2次馏分收集程序;
e)将每个馏分经简单的脱溶剂处理获得微量样品;
f)从分析对象制备所得的所有微量样品即构成了一个供高通量筛选的化合物库。
本发明的制备方法,步骤a)中的天然产物是天然来源的植物、动物、微生物、海洋生物、中药复方的提取物或由其活性导向分离得到的提取物部位。所述的提取物选自是采用高、中、低极性或不同酸碱性溶剂分别提取天然产物或所得到的提取物。优选地,高、中、低极性溶剂是选自水、醇、醚、酮、二醇衍生物、酯、芳香烃类、卤代烃类、脂肪烃类、吡啶、苯酚、乙腈中的一种或几种,酸碱性溶剂是选自有机酸、无机酸、无机碱、氨水中的一种或几种。更优选地,高、中、低极性溶剂是选自水、乙醇、甲醇、正丁醇、氯仿、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、苯、正己烷、石油醚中的一种或几种,酸碱性溶剂是选自盐酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的一种或几种。
本发明的制备方法,步骤b)中的液相色谱系统的色谱条件可以是:色谱条件可以是:分离采用的色谱柱内径≤10mm、粒径≤5μm;流速为0.5-5mL/min,分析时间≤3h;优选的,色谱条件可以是:分离采用的色谱柱内径≤10mm、粒径≤5μm;流速为1~2mL/min,分析时间≤2h;更优选的,色谱条件可以是:分离采用的色谱柱内径≤5mm、粒径≤5μm;流速为1~2mL/min,分析时间≤2h。
本发明的制备方法,步骤b)中的自动组分收集器包括自动进样系统、自动馏分收集系统和LEAP Shell-PAL软件操作系统三个部分。
本发明的制备方法,步骤b)中的色谱指纹图谱重现性良好,各色谱峰的保留时间前后一致,其中大部分色谱峰的分离度大于1.5。
本发明的制备方法,步骤c)中的软件用来联结并控制常规分析型液相色谱系统和自动组分收集系统,使得两个系统之间信号传递与进样器同步,并控制组分收集器,实现按单个色谱峰分别进行收集;该系统中所使用的检测器为紫外检测器、示差折光检测器或分流串接的蒸发光散射检测器、质谱检测器。
本发明的制备方法,步骤c)中是根据确定的色谱条件在液相工作站输入流动相洗脱程序;然后,根据确定的指纹图谱中各指纹峰的保留时间,在组分收集控制系统编辑各指纹峰的收集程序。即按出峰顺序给每个色谱峰编号,输入每个色谱峰的收集时间和收集位置,“start”为色谱峰起始时间,“stop”为色谱峰结束时间,“location”为馏分收集的相应位置,可根据馏分的体积适当调整收集容器的大小。考虑到液相色谱检测系统和馏分收集系统之间连接管线引起的时间延迟,可根据管线长度、管线直径和溶液流速计算延迟时间,并根据实际谱图对各个色谱峰的收集时间进行相应调整,提高馏分收集的精确性。设置好液相洗脱程序和馏分收集时间程序后,保存各自方法至特定路径,下次制备相同的样品时只需要运行相同方法即可。
本发明的制备方法,步骤c)中的软件设置是以指纹图谱的每个指纹峰的实际出峰时间为依据,单个色谱峰的收集是通过编辑馏分收集端的该指纹峰的起始时间和结束时间。
本发明的制备方法,步骤d)中的每次采用常规分析型高效液相色谱系统进样1~20μl提取液,运行次数视所接收馏分的浓度和含量高低而定。
本发明的制备方法,将步骤e)中收集得到的馏分(1次进样制备的每个馏分体积≤2ml)采用氮吹、加热或真空离心干燥等方式进行快速脱溶剂处理;步骤e)中的每个馏分的纯度高,以含有单个化合物为主,极少数含有共洗脱成分,大多数色谱峰纯度高于95%;能用于设计高、中、低三个给药浓度进行给药,大大减少了假阳性的结果。
本发明的制备方法,步骤f)的供高通量筛选的化合物库适用于细胞、细胞器、蛋白质水平的快速活性筛选;其中化合物库含有几十个至上百个微量样品。
本发明的制备方法中,该常规分析型液相色谱–组分收集系统同步联接质谱检测器,同时将液相流出液在线按比例分流进入质谱检测器,对收集得到的各馏分进行纯度检测、结构推测和成分鉴定。
其中,申请人以该方法进行了丹参高通量筛选的化合物库的制备,其具体制备方法包括如下步骤:
(1)粉碎丹参,用乙酸乙酯提取丹参,提取液低温冷冻干燥,制得丹参乙酸乙酯提取物;
(2)采用常规分析型液相色谱系统与自动组分收集系统联用,建立丹参乙酸乙酯提取物的全成分色谱指纹图谱分析方法;
高效液相色谱条件:
半制备型色谱柱:Agilent ZorBax SB-C18 column(9.4mm×250mm,5μm)流速:2ml/min,进样量为20μl;或分析型色谱柱:Agilent ZorBax SB-C18column(4.6mm×250mm,5μm),流速:0.5ml/min,进样量为2μl;
柱温:30℃;流动相:A相为0.1%甲酸水,B相为乙腈;梯度洗脱程序:0-10min,7-17%B;10-12min,17-20%B;12-14min,20%B;14-18min,20-21%B;18-34min,21%B;34-40min,21-29%B;40-57min,29-35%B;57-67min,35-65%B;67-87min,65-70%B;87-93min,70-80%B;93-102min,80-90%B;102-110min,90-100%B;检测波长281nm;
(3)运行步骤(2)中的色谱指纹图谱分析条件,进样系统和收集系统均由软件控制,通过软件设置各指纹峰的起始时间和结束时间以及收集位置,编辑组分收集系统的程序,自动、精确收集各指纹峰;
(4)用容器共收集到75个不同色谱峰馏分,针对每个指纹峰,分别运行1~2次馏分收集程序;
(5)所有馏分将由程序按编号收集于特定的位置中,使收集完毕后用真空离心干燥浓缩装置进行低温离心干燥处理,离心时间为3h;
(6)丹参乙酸乙酯提取物所得的75个微量样品干燥后构成了一个供高通量筛选的化合物库。该化合物库能用于不同系统的活性测试,例如:细胞、细胞器、蛋白质水平的快速活性筛选。
相比于传统制备方法,本发明具有以下优点:
1、本发明的制备方法快速、简便。
本方法通过采用常规分析型液相色谱系统进行1~2次进样收集(每次分析通常可在2h内完成),即可获得高通量筛选所需的样品量,不同于已往采用制备型高效液相系统分离制备天然药物馏分的方法,不需要进行反复多次的样品累积制备,缩短了构建化合物库的时间。本方法克服了不能使用分析型液相色谱系统进行高通量化合物库制备的技术偏见。
2、本发明的制备方法精密度、重复性良好。
对于成分复杂的天然来源样品,基于常规分析型高效液相色谱的分离度和精细程度,明显优于制备型高效液相色谱。并且经过方法学考察,即通过测定日内精密度、日间精密度和不同批次提取样品的重复性,也证明该方法精密度、重复性良好。
3、本发明的制备方法对所要组分收集更有针对性和普适性。
本方法通过相关软件能编辑每个色谱峰的起止时间,因此即使对微量成分、指定成分和未达到基线分离成分也能很好的收集。而现有技术中按设定阈值收集色谱峰的方法,因其无法收集低于阈值的部分,最大缺陷就是对微量成分的收集不完全,不适用于复杂体系中成分含量差异悬殊的样品制备。
4、本发明的制备方法无须经方法转化,即可与其他分析检测系统同步联结,直接对每个馏分的纯度检测、质谱鉴定等操作。
本方法建立的常规分析型液相色谱-组分收集系统,可通过在线分流到质谱检测器,同步联接液相色谱-质谱系统,进行天然化合物库的成分快速检出和成分分析,并可通过相关信息指导进一步的活性导向分离纯化,制备活性单体。
5、本发明的制备方法的产物纯度高、纯化容易。
该方法通过建立常规分析型液相色谱–自动组分收集系统,通过软件设置各指纹峰的起始时间和结束时间,编辑程序自动、精确收集各指纹峰,运行1~2次馏分收集程序,再进行简单的脱溶剂即可得到产物,每个馏分的纯度较高;经液质联用分析鉴定,该方法收集的馏分中大多只含有单个化合物,大多数色谱峰纯度高于95%,其纯度远远高于现今按时间段收集馏分的方法,与已有的按设定阈值收集色谱峰的样品制备方法也有所不同。
6、本发明的制备方法的产物可以实现量效关系的考察,筛选准确度和可靠性更高。
基于该方法制备的高纯度馏分,按不同比例稀释,制备得到高、中、低不同浓度样品,可进行高通量活性测试和量效关系的考察,进一步排除假阳性的筛选结果,提高筛选准确度和可靠性,这是目前通过制备型HPLC收集以混合物为主的馏分,以单个浓度给药测定所无法实现的。
附图说明
图1是四种不同类型色谱柱分离丹参提取物在281nm下检测的色谱图比较,其中图1中的图谱的HPLC条件如下:
A:Agilent1100制备液相,Shim-pack PREP-ODS(20.0mmID×250mm,填料粒径:15μm),进样量:120μl,流速:9.5ml/min;
B:Agilent1100制备液相,YMC-Pack ODS-C18(20.0mm ID×250mm,填料粒径:5μm),进样量:100μl,流速:9.0ml/min;
C:Agilent1100分析液相,半制备型色谱柱:Agilent ZorBax SB-C18column(9.4mm×250mm,填料粒径:5μm),进样量:20μl,流速:2.0ml/min;
D:Agilent1100分析液相,分析型色谱柱:Agilent ZorBax SB-C18column(4.6mm×250mm,填料粒径:5μm),进样量:2μl,流速:0.5ml/min。
图2为常规分析型液相色谱-组分收集系统对丹参提取物按单个色谱峰收集馏分的方法制备得到的样品纯度,图2和图3中两种不同制备方法均选取不同时间点分布的7个色谱峰馏分,在经过相同的样品浓缩处理之后进样分析,两者所用的分析条件一致。
图3为制备液相色谱-组分收集系统对丹参提取物按时间段收集馏分(0.5min/fraction)的方法制备得到的样品纯度,图2和图3中两种不同制备方法均选取不同时间点分布的7个色谱峰馏分,在经过相同的样品浓缩处理之后进样分析,两者所用的分析条件一致。
图4是常规分析型液相色谱–组分收集系统对丹参提取物进行多次馏分收集的色谱图和相似度分析。
图5是收集丹参提取物中得到的不同馏分基于Nrf2-ARE通路的报告基因活性检测数据。
具体实施方式
下述实施例是采用本发明制备方法制备复杂天然产物化合物库并进行高通量筛选的示例,本文所述的实施方案仅是示例性的而不是意图限制本发明的范围。因此,应当清楚地理解,本领域技术人员应当理解本发明的技术方案可以进行许多和各种变化而不偏离本发明的精神,例如,可以用于其他各种类型的天然产物的化合物库的建立并进行相应化合物库中的药理活性成分的高通量筛选。
实施例1:丹参提取物中激活Nrf2-ARE通路的活性成分快速筛选
1.实验材料和试剂
丹参药材:陕西商洛;试剂:色谱纯乙腈(Merck,德国),色谱纯甲酸(96%;Fairfield,美国),超纯水(Millipore,美国),分析纯甲醇(汉邦科技公司,中国南京),分析纯乙酸乙酯(汉邦科技公司,中国南京)。
2.实验仪器
美国Agilent1100高效液相色谱仪,配有自动进样器、二元泵和紫外检测器;CTC组分收集器,美国CTC通用集团(上海);低温冷冻离心干燥机(赛默飞世尔科技公司Thermo Fisher Scientific);旋转薄膜蒸发仪(Büchi,瑞士);LABCONCO冷冻干燥仪;Sovall Evolution RC型高速冷冻离心机(KENDRO,美国);数显恒温水浴锅(HH-2);BP211D十万分之一电子天平(Sartorius);真空离心干燥浓缩装置(Thermo savant SPD2010)。
3.实验方法
3.1提取物制备
称取250g丹参粉末,放入圆底烧瓶,加2000ml乙酸乙酯于水浴锅中加热回流提取两次,每次30min。合并两次滤液,50℃下旋转蒸发浓缩,再经冷冻干燥,制备得到提取物冻干粉,保存于密闭的干燥器中。每次使用时取适当样品用纯甲醇溶解,离心后取上清液,即得分析样品。
3.2色谱分析条件
HPLC-UV条件:制备型色谱柱1:Shim-pack PREP-ODS(20.0mm ID×250mm,15μm);制备型色谱柱2:YMC-Pack ODS-C18(20.0mm ID×250mm,5μm);半制备型色谱柱:Agilent ZorBax SB-C18column(9.4mm×250mm,5μm);分析型色谱柱:Agilent ZorBax SB-C18column(4.6mm×250mm,5μm)。柱温:30℃;流动相:A相为0.1%甲酸水,B相为乙腈;梯度洗脱程序:0-10min,7-17%B;10-12min,17-20%B;12-14min,20%B;14-18min,20-21%B;18-34min,21%B;34-40min,21-29%B;40-57min,29-35%B;57-67min,35–65%B;67-87min,65-70%B;87-93min,70–80%B;93-102min,80-90%B;102-110min,90-100%B。流速依次分别为:9.5ml/min、9.0ml/min、2ml/min和0.5ml/min和进样量依次分别为120μl、100μl、20μl和2μl,检测波长281nm。
3.3质谱条件
TOF/MS条件:电喷雾离子源参数:干燥气流速(N2Drying gas flow-rate):10.0L/min;干燥气温度(Drying gas temperature):330℃;雾化气压力(Nebulizer):241kPa(35psig);毛细管电压(Capillary voltage):3000V;裂解电压(Fragmentor):120~420V;skimmer voltage,60V;octapole DC 1,37V;octapole radio frequency,250V。数据采集和分析分别由AgilentMassHunter Acquisition软件(Agilent,美国)和Applied Biosystems/MDS-SciexAnalyst QS软件(Frankfurt,德国)完成。
3.4馏分收集及脱溶剂处理
自动组分收集器包括自动进样系统、自动馏分收集系统和LEAPShell-PAL软件操作系统三个部分,进样系统和收集系统均由软件控制。实验中编辑色谱峰的前后出峰时间,所有馏分将按编号收集于特定的位置中,收集的容器包括试管和96孔板,其中试管的型号有:2ml、8ml和20ml,96孔板可以是深孔板和微孔板等。本实验使用8ml的试管共收集75个不同色谱峰馏分,收集完毕后用真空离心干燥浓缩装置进行低温离心干燥处理,离心时间为3h。干燥后的样品即可用于不同系统的活性测试。
3.5Nrf2报告基因检测
将抗氧化反应元件插入萤火虫荧光素酶载体pGL4.26,构建重组质粒pGL4-ARE,与海肾荧光素酶载体pRL-TK共同转染293T细胞。待96孔板中细胞密度达到70%-90%时进行瞬时转染,转染方法如下(详见Lipofectamin2000转染试剂说明书)。对于每孔细胞,使用25μl opti-MEM培养基稀释0.2μgDNA,多孔操作可以批量制备,室温放置5min。使用25μl opti-MEM培养基稀释0.5μl Lipofectamine2000试剂,室温静置5min。以1∶1的比例混合稀释的DNA和稀释的Lipofectamine2000,室温静置20min。直接将两者的复合物缓慢滴加到每孔的细胞中,在37℃,5%CO2孵箱中培养24h。293T细胞转染24h后,吸弃细胞上清液,将配制好的不同浓度的受试药物以100μl/孔缓慢加入孔内,每组3孔重复。培养24h后,收取细胞样品,对其进行报告基因检测,即用酶标仪测定荧光素酶活性和β-半乳糖苷酶活性。数据处理:荧光强度值/β-gal吸收值(减去空白),得到相对荧光素酶活性,即相对发光值(Relative Light Unit,RLU)。用各个给药的相对发光值除以对照组的相对发光值,得到各个组的荧光诱导表达倍数。
4.实验结果
4.1丹参药材提取物的色谱表征
因天然药物所含成分较多,化合物性质差别较大,要对全成分进行分离,通常采用250mm长的常规分析型色谱柱进行分析,且需要采用梯度程序洗脱和花费一定的分离时间才能得到比较满意的指纹图谱。实验分别比较了四种不同规格色谱柱(见3.2分析条件部分)的分离效果及不同色谱参数。通常使用的制备型色谱柱填料粒径一般大于分析型色谱柱填料粒径,在一定程度上会降低分离度,如图1A所示,对于成分极为复杂的天然药物提取物,使用制备液相常用的制备型色谱柱(20.0×250mm,粒径15μm)获得的分离效果(图1A)远不如采用5μm粒径填料色谱柱(包括制备型、半制备型和分析型)的分离效果(图1B、图1C和图1D),但是考虑到用5μm粒径的填料来装填制备型的色谱柱,其成本较高,使用寿命较短,并非经济实用型,且使用过程中因流速较大,流动相浪费,微量样品损失比较严重。而在图1C和图1D中,两根色谱柱分离效果无明显差别,但采用直径9.4mm的半制备型色谱柱比直径4.6mm的分析型色谱柱,上样量可提高10倍以上,一次性收集得到的馏分样品足以用于细胞或蛋白水平的活性筛选,故建议使用相同粒径填料的半制备型色谱柱。为更客观地比较本发明方法与常规按时间段收集组分方法在复杂样品收集制备方面的优势,我们用两种不同制备方法(相同色谱柱)以选取不同时间点分布的7个色谱峰馏分在经过相同的样品浓缩处理之后进样纯度验证,比较常规分析型液相色谱-组分收集系统按单个色谱峰收集馏分方法(图2)和制备液相色谱-组分收集系统按时间段收集馏分(0.5min/fraction)(图3)的纯度验证结果。从图2和图3中可以发现,基于单个色谱峰收集的馏分都只含有单个化合物,而用常规按时间段收集的方法,虽然收集时间只设定在每个馏分0.5min,但每个馏分中还是含有多个成分,尤其不利于微量成分的分离和制备,收集得到的馏分纯度较低。可见,本发明方法的馏分收集纯度远远超过常规的馏分收集方法。此外,常规制备型液相组分收集方法因使用较高的流速,得到的馏分溶剂量大,溶剂挥发费时耗力。而在分析型液相色谱系统上,采用直径≤10mm的色谱柱(粒径5μm),可对复杂组分获得较为理想的分离效果,且得到的馏分溶剂量相对较小,溶剂挥发或去除较容易。丹参中的主要化学成分包括水溶性成分和脂溶性成分,通过改变流动相洗脱梯度,图1C中的各色谱峰基本达到基线分离,为下一步指纹峰收集时间的确定提供了依据。
4.2馏分的收集及质谱验证
馏分收集软件是基于LEAP Shell-PAL软件改进而来,编辑每个色谱峰的名称(Sample ID)、收集时间(Start和Stop)、收集位置(Sample Vial),列入方法表中并保存。根据图1的色谱图共收集75个馏分,馏分收集时间最短的为0.6min,时间最长的为2min。收集的馏分需进行色谱和质谱验证,实验中挑选7个不同时间的馏分,洗脱程序与指纹图谱的洗脱梯度一致。色谱验证结果见图2和图3,收集到的馏分基本上仅为单个色谱峰。再经飞行时间质谱(TOF)验证,通过精确分子量和色谱峰的保留时间可以确定大部分馏分均为纯度较高的单一成分。
4.3方法的重现性考察
为了考察该制备方法的稳定性,通过重复进样实验进行了馏分收集的重现性考察,利用相似度软件评价了指纹色谱的相似度(图4)。如图所示,相似度值均在95%以上,保留时间偏移为正负0.05s(tR±0.05s),可以满足不同阶段活性筛选样品制备和质谱鉴定的需要。
4.4基于报告基因方法的活性成分筛选
构建以Nrf2为分子靶标报告基因系统,通过检测荧光素酶活力来评价化合物激活Nrf2-ARE通路的活性。将收集到的馏分溶解在200ul含1%DMSO的无血清培养基中,稀释成高、中、低三个浓度后,加入到转染好质粒的293T细胞中,经药物孵育20h后,提取蛋白测定其吸光值,并计算得到相对荧光素酶活力,荧光倍数值超过对照组两倍以上的化合物为活性成分。通过初步筛选(见图5),从丹参提取物的75个馏分中共筛选出20个馏分,经LC-MS鉴定为20个活性成分,其中,除丹参酮IIA有相关活性报道外,另外19个化合物均没有该通路活性的报道,各馏分活性测试结果列于表1,其作用机制有待进一步研究。
表1相对荧光素酶活力>2.5的活性馏分测试结果
馏分 | 相对荧光素酶活 |
8号 | 2.72 |
22号 | 4.27 |
24号 | 2.74 |
25号 | 7.80 |
30号 | 3.97 |
31号 | 3.67 |
35号 | 5.07 |
36号 | 6.45 |
39号 | 6.46 |
40号 | 3.14 |
41号 | 5.34 |
42号 | 7.27 |
43号 | 6.01 |
44号 | 5.65 |
49号 | 3.20 |
50号 | 2.99 |
56号 | 2.64 |
62号 | 3.63 |
63号 | 4.67 |
65号 | 3.14 |
Claims (8)
1.一种适用于天然产物高通量筛选的化合物库高效制备方法,其特征在于,包括下述步骤:
a)选取一种天然产物作为分析对象;
b)采用常规分析型液相色谱系统与自动组分收集系统联用,建立上述分析对象的全成分色谱指纹图谱分析条件;
c)运行步骤b)中的色谱指纹图谱分析条件,通过软件设置各指纹峰的起始时间和结束时间以及收集位置,使组分收集系统的程序根据上述设置,自动、精确地收集各指纹峰;
d)针对每个指纹峰,分别运行1~2次馏分收集程序;
e)将每个馏分经简单的脱溶剂处理获得微量样品;以及
f)从分析对象制备所得的所有微量样品即构成了一个供高通量筛选的化合物库。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤a)中的天然产物是天然来源的植物、动物、微生物、海洋生物、中药复方的提取物或由其活性导向分离得到的提取物部位。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤b)中的常规分析型液相色谱系统的色谱条件如下:分离采用的色谱柱内径≤10mm、粒径≤5μm;流速为0.5-5mL/min,分析时间≤3h。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤b)中的色谱指纹图谱重现性好,各色谱峰的保留时间前后一致,其中大部分色谱峰的分离度大于1.5。
5.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤c)中的软件用来联结并控制常规分析型液相色谱系统和自动组分收集系统,使得两个系统之间信号传递与进样器同步,并控制组分收集器,实现按单个色谱峰分别进行收集;该步骤中所使用的检测器为紫外检测器、示差折光检测器或分流串接的蒸发光散射检测器、质谱检测器。
6.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤c)中的软件设置是以指纹图谱的每个指纹峰的实际出峰时间为依据,单个色谱峰的收集是通过编辑馏分收集端的该指纹峰的起始时间和结束时间实现的。
7.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤e)中的每个馏分的纯度高,以含有单个化合物为主,大多数色谱峰纯度高于95%。
8.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤f)的供高通量筛选的化合物库适用于细胞、细胞器、蛋白质水平的快速活性筛选;其中化合物库含有几十个至上百个微量样品。
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