CN106093264A - 一种草莓叶黄素循环组分的测定方法 - Google Patents

一种草莓叶黄素循环组分的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种草莓叶黄素循环组分的测定方法，即采用超高效液相色谱法在同一色谱条件下对草莓中的3种叶黄素循环组分—玉米黄质、紫黄质、环氧玉米黄质同时进行含量测定，本发明丙酮作为提取剂，不经过皂化直接提取草莓中叶黄素循环组分，以乙腈：甲醇＝9：1为流动相，检测吸收波长为445nm，检测可以在1～2min内完成。本发明方法精密度高、灵敏度强、重复性好、回收率高，对草莓叶黄素循环3种组分同时进行分离和含量测定，具有提取速度快、测定精密度高、灵敏度强、重复性好的特点，且测定的结果准确可靠、试剂用量少，从而大大提高了测定速度和减少了溶剂消耗。

Description

一种草莓叶黄素循环组分的测定方法
【技术领域】
本发明涉及一种草莓叶黄素循环组分的测定方法。
【背景技术】
草莓(Fragaria ananassa Duch)属蔷薇科多年生草本植物，果实鲜美红嫩，浓郁多汁，果味芳香并且营养丰富，素有“水果皇后”之称。草莓喜温暖而不耐高温强光，在越夏露地栽培时比一般果菜类更易发生光抑制，光损伤，严重影响其品质及产量。叶黄素循环(Xanthophyll cycle)是高等植物长期进化过程中保存下来的一种代谢机制，主要由3个组分即玉米黄质(Zeaxanthin,Z)、环氧玉米黄质(Antheraxanthin,A)和紫黄质(Violaxanthin,V)参与。叶黄素循环是指在不同光强及pH下由紫黄质脱环氧化酶(Violaxanthin de-epoxidase,VDE)和玉米黄质环氧化酶(Zeaxanthin epoxidase,ZE)催化A、V和Z 3种组分相互转化的过程。依赖于叶黄素循环的热耗散是植物耗散过剩光能的主要方式，在逆境胁迫中起着非常重要的光保护作用。植物遭受水分、高低温、盐渍等胁迫时，依赖叶黄素循环的热耗散增强，光合器官均可通过叶黄素循环来提高应付过剩光能的能力。目前草莓叶黄素循环组分提取和测定尚未见报道，缺少准确可靠的检测方法，因此建立一种快速、准确的测定方法对研究叶黄素循环调控机制、合理开发和利用我国草莓资源具有重要的理论价值和应用前景。
高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)是近年来分离及测定植物天然色素的主要方法，但在实际应用中仍然存在分析时间长，分离效果不佳等缺陷。超高效液相色谱法(Ultra performance liquid chromatography，UPLC)是基于HPLC推出的一种新型的液相色谱技术，它使用粒径低于2μm的小颗粒填充色谱柱提升样品的分析效率，弥补了HPLC的缺陷，分离速度、灵敏度以及分离度高达HPLC的9、3、1.7倍，并且在HPLC的基础上兼具环境友好、成本低等特点，已逐渐成为食品分析检测的有效工具。但利用UPLC测定草莓叶黄素循环组分国内外还未见报道。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种草莓叶黄素循环组分的测定方法，该方法简单快速，结果准确可靠，且还具有精密度高、灵敏度强、重复性好、回收率高等优点。
本发明是这样实现的：
一种草莓叶黄素循环组分的测定方法，采用超高效液相色谱法在同一色谱条件下对草莓中的3种分别为玉米黄质、紫黄质、环氧玉米黄质的叶黄素循环组分同时进行含量测定；该方法包括如下步骤：
(1)制备对照品标准溶液:分别称取玉米黄质、紫黄质、环氧玉米黄质对照品，加丙酮得到三种单个对照品溶液；再分别精密量取三种单个对照品溶液，置同一容量瓶中，得到混合对照品标准溶液；
(2)制备待测品溶液:用液氮将草莓叶片研磨至粉末，精确称取0.1g，加入5mL丙酮，于4℃避光浸提5min，低温超声提取2min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液，重复操作1次，合并上清液，用旋转蒸发仪于40℃将其蒸干，用丙酮定容至5mL，即得；
(3)超高效液相色谱检测：
检测仪器：超高效液相色谱；
色谱柱：规格为2.1mm×100mm,1.7u m的色谱柱；
流动相：乙腈与甲醇；
流速：0.5ml/min；
检测波长：445nm；
进样体积：10ul；
柱温：30℃；
(4)测定：分别取制备获得的标准溶液及待测液，并采用上述色谱条件进行进样检测，记录色谱图，经过色谱仪器自带软件积分得到峰面积，计算得到待测液中3种叶黄素循环组分—玉米黄质、紫黄质、环氧玉米黄质的含量。
进一步地，所述流动相中各组分的体积比为乙腈：甲醇＝9:1。
本发明具有如下优点：
本发明确定了适用于草莓叶黄素循环组分测定的超高效液相法，本方法精密度高、灵敏度强、重复性好、回收率高，本发明的流动相组合可以将3种叶黄素循环组分彻底分离，且在同一色谱条件下对草莓中3种叶黄素循环组分同时进行分离和含量测定，流动相试剂用量少，方法简单快速，结果准确可靠，在1～2分钟内就可完成检测，大大提高了分析速度和减少了溶剂消耗；本发明方法采用未经皂化处理工艺步骤，可以提高叶黄素循环组分提取效果，因此本发明是适合草莓叶黄素循环组分定性和定量分析的最佳方法，为草莓叶黄素循环调控机制研究提供技术基础。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为玉米黄质、紫黄质、环氧玉米黄质混合对照品标准溶液超高效液相色谱(UPLC)图。
图2为实施例1的待测品溶液的超高效液相色谱(UPLC)图。
图3为实施例2的待测品溶液的超高效液相色谱(UPLC)图。
【具体实施方式】
请参阅图1～3所示，对本发明的实施例进行详细的说明。
一、实验条件
1、仪器与试药
超高效液相色谱仪为美国WATERS ACQUITY UPLC H-Class，包括四元溶剂管理器、自动进样器、柱温箱、PDA检测器以及Empower色谱工作站；玉米黄质、紫黄质、环氧玉米黄质对照品为美国ChromaDex公司产品；乙睛和甲醇为色谱纯，来自Fisher公司；其他试剂均为分析纯。
2、流动相各组分的体积比为乙腈：甲醇＝9:1。
3、本试验选择445nm作为草莓叶黄素循环组分吸收波长。
4、提取剂为丙酮提取剂。
二、重复性、精密度试验
分别称取玉米黄质、紫黄质、环氧玉米黄质对照品1.0mg，加丙酮定容于5ml容量瓶中，得到浓度为200ug/ml单个对照品溶液；分别精密量取单个对照品溶液，置同一容量瓶，得到混合对照品溶液。取上述三种叶黄素组分混合对照品标准溶液，在超高液相色谱仪中分别重复进样5次，以各组分峰面积的相对标准偏差(Relative standard deviation，RSD)，来测定仪器的性能以及方法的精密型，在超高液相色谱仪中分别重复进样5次，计算各组分峰面积的RSD来考察方法的重复性。结果如表1所示，玉米黄质、紫黄质和环氧玉米黄质3种组分在精密度试验中对应的RSD依次为0.31％、0.73％和1.15％，重复性测定中玉米黄质、紫黄质和环氧玉米黄质3种组分对应的RSD依次为0.54％、0.88％、1.32％，均小于2％，表明该方法具有良好的精密度和重复性。
表1三种对照品的精密度和重复性(n＝5)
三、线性关系及检出限、定量限测定
取上述三种叶黄素组分混合对照品标准溶液，在超高液相色谱仪中分别重复进样5次，以标准品浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准工作曲线并计算标准曲线回归方程以及相关系数，以信噪比(S/N)为3所对应的标准品浓度为检出限，以信噪比(S/N)为10所对应的标准品浓度为定量限。结果如表2所示，从表2中可得，玉米黄质、紫黄质和环氧玉米黄质的线性相关系数依次为0.9950、0.9995、0.9999，表明3种标准品的进样浓度与峰面积具有良好的线性关系，3种标准品的检出限为0.003-0.01μg·mL-1，定量限为0.005-0.02μg·mL-1，说明该方法具有较高的灵敏性。
表2三种对照品的标准曲线回归方程、线性范围、相关系数、
检出限及定量限
四、回收率试验
称取4份等量的草莓叶片粉末，加到锥形瓶中，其中3份如表3所示分别进行3个水平的加标，余下1份作空白对照。按前述的草莓叶黄素组分提取方法进行提取，测定4份样品的叶黄素循环组分含量，计算回收率，同样试验条件下平行测定三次。结果见表3，玉米黄质、紫黄质和环氧玉米黄质的平均回收率依次分别为104.94％、97.57％、96.34％，相对标准偏差为0.93％-1.67％，结果可靠且符合分析要求。
表3草莓叶叶黄素循环组分的回收率(n＝3)
五、具体实施例实验
实施例1
(1)制备对照品标准溶液:分别称玉米黄质、紫黄质、环氧玉米黄质对照品，加丙酮得到三种单个对照品溶液；再分别精密量取三种单个对照品溶液，置同一容量瓶中，得到混合对照品标准溶液。
(2)制备待测品溶液:用液氮快速正常光照条件下的草莓叶片研磨至粉末，精确称取0.1g，加入5mL丙酮，于4℃避光浸提5min，低温超声提取2min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液，重复操作1次，合并上清液，用旋转蒸发仪于40℃将其蒸干，用丙酮定容至5mL，即得。
(3)制定色谱条件:色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱，规格为2.1mm×50mm,1.7um的色谱柱；流动相为乙腈：甲醇＝9：1；流速为0.5ml/min；检测波长为445nm；柱温为30℃，进样体积：10ul。
(4)进行常规系统适应性试验(对仪器进行清洗、预热等)，先对玉米黄质、紫黄质、环氧玉米黄质混合对照品标准溶液注入超高效液相色谱仪进行测定，测定结果如图1所示；然后待测品溶液经0.22um微孔过滤膜过滤后注入超高效液相色谱仪进行测定，测定结果如图2所示，结果在正常光照条件下的草莓叶片检测到紫黄质、环氧玉米黄质和玉米黄质，含量依次为80.15μg·g-1、24.03μg·g-1、475.03μg·g-1。
实施例2：
(1)对照品标准溶液的制备和超高效液相色谱仪进行测定同实施例1。
(2)制备待测品溶液:用液氮快速强光胁迫后的草莓叶片研磨至粉末，精确称取0.1g，加入5mL丙酮，于4℃避光浸提5min，低温超声提取2min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液，重复操作1次，合并上清液，用旋转蒸发仪于40℃将其蒸干，用丙酮定容至5mL，即得。
(3)制定色谱条件:色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱，规格为2.1mm×50mm,1.7um的色谱柱；流动相为乙腈：甲醇＝9：1；流速为0.5ml/min；检测波长为445nm；柱温为30℃，进样体积：10ul。
(4)进行常规系统适应性试验(对仪器进行清洗、预热等)，然后供试品溶液经0.22um微孔过滤膜过滤后注入超高效液相色谱仪进行测定，测定结果如图3所示，结果在强光胁迫后的草莓叶片检测到紫黄质、环氧玉米黄质和玉米黄质，含量依次为53.90μg·g-1、23.77μg·g-1、551.33μg·g-1。
本发明确定了适用于草莓叶黄素循环组分测定的超高效液相法，本方法精密度高、灵敏度强、重复性好、回收率高，本发明的流动相组合可以将3种叶黄素循环组分彻底分离，且在同一色谱条件下对草莓中3种叶黄素循环组分同时进行分离和含量测定，流动相试剂用量少，方法简单快速，结果准确可靠，在1～2分钟内就可完成检测，大大提高了分析速度和减少了溶剂消耗；本发明方法采用未经皂化处理工艺步骤，可以提高叶黄素循环组分提取效果，因此本发明是适合草莓叶黄素循环组分定性和定量分析的最佳方法，为草莓叶黄素循环调控机制研究提供技术基础。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (2)

1.一种草莓叶黄素循环组分的测定方法，其特征在于：采用超高效液相色谱法在同一色谱条件下对草莓中的3种分别为玉米黄质、紫黄质、环氧玉米黄质的叶黄素循环组分同时进行含量测定；该方法包括如下步骤：
(1)制备对照品标准溶液:分别称取玉米黄质、紫黄质、环氧玉米黄质对照品，加丙酮得到三种单个对照品溶液；再分别精密量取三种单个对照品溶液，置同一容量瓶中，得到混合对照品标准溶液；
(2)制备待测品溶液:用液氮将草莓叶片研磨至粉末，精确称取0.1g，加入5mL丙酮，于4℃避光浸提5min，低温超声提取2min，12000rpm，4℃离心10min，取上清液，重复操作1次，合并上清液，用旋转蒸发仪于40℃将其蒸干，用丙酮定容至5mL，即得；
(3)超高效液相色谱检测：
检测仪器：超高效液相色谱；
色谱柱：规格为2.1mm×100mm,1.7u m的色谱柱；
流动相：乙腈与甲醇；
流速：0.5ml/min；
检测波长：445nm；
进样体积：10ul；
柱温：30℃；
(4)测定：分别取制备获得的标准溶液及待测液，并采用上述色谱条件进行进样检测，记录色谱图，经过色谱仪器自带软件积分得到峰面积，计算得到待测液中3种叶黄素循环组分—玉米黄质、紫黄质、环氧玉米黄质的含量。
2.根据权利要求1所述一种草莓叶黄素循环组分的测定方法，其特征在于：所述流动相中各组分的体积比为乙腈：甲醇＝9:1。
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