CN107389814A - 一种rp‑hplc‑dad快速分析沙棘主要黄酮苷元的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析化学技术领域，公开了一种运用反相高效液相色谱二极管阵列检测快速测定沙棘中儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素成分含量的方法。该方法将沙棘黄酮主成分标准品或提取物以甲醇稀释，以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，采用甲醇‑水(酸性)为流动相并进行等度洗脱，在各黄酮吸收波长下记录色谱图。本方法采用十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以甲醇‑水(酸性)为流动相，可以定量测定沙棘黄酮提取物中几乎全部黄酮苷元成分，各成分基本实现基线分离，可以有效实现对沙棘黄酮提取物的精确质控。本发明方法专属性强，灵敏度高，准确性好。

Description

一种RP-HPLC-DAD快速分析沙棘主要黄酮苷元的方法
技术领域
本发明涉及中药生产质量检测技术领域，具体涉及沙棘中6种主要黄酮苷元的含量测定方法及其在提取分析中的应用。
背景技术
沙棘为胡颓子科酸刺属的灌木或小乔木，别名醋柳、黑刺、酸刺、其察日嘎纳(蒙名)、达普(藏名)、吉汗(维吾尔名)。沙棘主要分布在亚洲和欧洲，沙棘的各个组织，特别是浆果，在中国西藏、蒙古和中东地区被用于传统药品。1977年，沙棘被列入了《中华人民共和国药典》，之后在中国药典中均有收录。
黄酮类化合物是沙棘的主要活性成分之一，沙棘黄酮已经被证实具有抗氧化活性、改善高血脂、预防血栓形成、抗炎、保护细胞、治疗糖尿病等作用。
目前经报道的主要沙棘黄酮主要成分有槲皮素、山奈酚、异鼠李素等，种类较少，难以覆盖沙棘黄酮的全部主要成分。近年来，沙棘作为西部防风治沙的主要经济作物，得到了广泛种植，原料丰富。深入开发沙棘的经济价值，尤其是其药用价值，则需要对沙棘的药用成分进行更为精准有效的提取和分析。目前沙棘黄酮的提取分析方法多以总黄酮的简单分析为主，但缺乏相应提取物中分类黄酮苷元定量分析研究，无法实现对提取成分的精确质控和深入药理药效分析。
本发明针对以上问题，以RP-HPLC-DAD为检测手段，开发快速有效的黄酮分析方法，从而克服了总黄酮分析的局限性，对沙棘黄酮提取物可实现精确质控。且方法操作简便、快速、适用性广，特别适用工业化的质控分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能应用于企业质控检测的具有高度准确性和普适性的多种黄酮快速测定方法。
本发明提供的技术方案包括如下步骤：
(1)通过盐酸水解黄酮提取物样品，获得可检测游离黄酮苷元
(2)步骤(1)获得的样品经RP-HPLC-DAD检测，获得黄酮苷元的精确含量
本发明通过酸性水解，将黄酮苷水解后，释放独立的游离苷元，依靠RP-HPLC-DAD对游离苷元进行准确定量，获得黄酮提取物的精确质控数据。
一种黄酮苷水解方法：采用盐酸作为水解作用剂，甲醇为反应溶剂；
反应条件为：以甲醇溶解黄酮提取物，加入盐酸溶液，80-95℃下加热回流0.5-3h；
优选地，黄酮提取物甲醇溶液、25％盐酸以1:1的体积比混合，90℃下，进行水解反应， 2h。
由于所述的水解方法可将黄酮苷稳定水解，获取游离黄酮苷元，且水解后，黄酮苷元稳定，适宜后续分析检测。
一种黄酮苷元的RP-HPLC-DAD快速定量方法：将黄酮提取物水解后，选用C18色谱柱，以甲醇：水(含磷酸)为流动相，等度洗脱，测定。
洗脱条件为：甲醇：水(含磷酸)＝60:40，流速0.5-2mL/min，柱温30-50℃；
优选地，色谱柱选用SHIMADZU C18柱(150mm×2.1mm，5μm)；磷酸浓度0.4％，流动相以甲醇：水(体积比)为60:40，流速1.0mL/min，柱温40℃，进样量20μL。
一种沙棘黄酮的提取方法：沙棘中黄酮的提取方法：取10g粉碎后的沙棘叶和沙棘籽，烘干，加8倍量的石油醚(沸程60～90℃)70℃下搅拌回流2h，抽滤。脱脂后的沙棘叶渣和沙棘籽渣用乙醇提取数次，合并续滤液，冻干，得沙棘叶和沙棘籽黄酮粗提物。
上述的沙棘叶中黄酮的提取方法，乙醇浓度为70％，提取时间为2h，提取次数为3次，料液比为1:16。
上述的沙棘籽中黄酮的提取方法，乙醇浓度为50％，提取时间为1.5h，提取次数为3次，料液比为1:16。
上述的沙棘中黄酮的提取方法，所述黄酮中含有儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素。
本发明提供的6种黄酮苷元的含量测定方法，具有以下有益效果：
1)工艺合理，儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素6种成分基本实现基线分离。
2)本发明提供一种沙棘的质量评价方法，完成了沙棘的含量测定，其中含量测定是采用 HPLC法测定儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素的含量。经方法学验证，该方法精密度、稳定性、重现性及加样回收率均良好，该方法满足含量测定的技术要求。
3)本发明方法快速、灵敏度高，准确度好。
附图说明
图1为本发明检测黄酮混合标准品的分析谱图
图2为本发明检测沙棘叶黄酮提取物的分析谱图
图3为本发明检测沙棘籽黄酮提取物的分析谱图
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将进一步通过实例进行表述。
本发明所使用的试剂均从市场上购得。
实施例1：沙棘黄酮含量测定及方法学验证
仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪
色谱柱：SHIMADZU C18柱(150mm×2.1mm，5μm)；
流动相：A：甲醇，B：水(含0.4％磷酸)，A：B＝60:40(v/v)；
流速：1.0mL/min；
柱温：40℃；
检测波长：儿茶素的最大吸收波长为208nm，芦丁的最大吸收波长为257nm，杨梅素的最大吸收波长为373nm，槲皮素的最大吸收波长为371nm，山奈酚的最大吸收波长为367nm，异鼠李素的最大吸收波长为371nm；
进样量：20μL；
稀释液：甲醇；
1.1供试品溶液制备
精密称取沙棘叶和沙棘籽黄酮粗提物粉末50mg，加入20mL甲醇，混合均匀后加入20 mL 25％的HCl溶液，氮气保护，90℃下加热回流1h，待溶液冷却至室温后，过滤，将续滤液转移至50mL容量瓶中，摇匀，用甲醇定容至刻度，即得供试品溶液。
1.2对照品溶液的制备
分别精密称取儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚、异鼠李素对照品各5.0mg，混合均匀后，用甲醇逐级稀释，并以HCl调至样品pH值，得系列浓度的混合对照品溶液。
1.3色谱条件
色谱柱为SHIMADZU C18柱(150mm×2.1mm，5μm)；流动相A：甲醇，B：水(含 0.4％磷酸)，A：B＝60:40(v/v)，采用等度洗脱；流速为1.0mL/min；柱温40℃；检测波长 208nm；进样量为20μL。
1.4精密度考察
取沙棘叶及沙棘籽粉末各10g，精密称定，提取黄酮粗品，按1.1项下方法制备供试品溶液，重复进样6次，记录各成分的峰面积，并计算含量。测得结果表明，各成分含量的检测结果RSD值均小于1.77％，表明方法精密度良好。
1.5稳定性试验
取同一供试品溶液，每隔2h进样，进行色谱分析，结果表明，各成分含量检测结果RSD 值小于1.51％，显示方法稳定。
1.6重复性试验
取同批沙棘叶和沙棘籽黄酮粗品各6份，按1.1项下方法制备供试品溶液，重复进样，检测各成分含量。结果表明，6种黄酮的含量结果RSD值小于1.83％。
1.7工作曲线绘制
将系列浓度的混合对照品溶液按照1.3项下进行色谱检测，并建立相应工作曲线。所得各线性方程分别为：儿茶素：y＝128086x+101987，R2＝0.9996；芦丁：y＝13553x+27405， R2＝0.9996；杨梅素：y＝32713x-2733.8，R2＝0.9999；槲皮素：y＝37503x-9514.1，R2＝0.9994；山奈酚：y＝38039x-5124.4，R2＝0.9997；异鼠李素：y＝38376x-3240.2，R2＝0.9998；各黄酮标准曲线的相关系数(r)均高于0.9995，线性关系良好。
1.8样品含量测定
取6批沙棘叶和沙棘籽样品各2份，按照1.1项中方法制得样品溶液，每份溶液按照1.3 项下色谱条件进样3次，结果见表1。
表1沙棘叶与沙棘籽样品测定结果(‰)
Table 1 Seabuckthorn leaves and seabuckthorn seed sampledetermination results(‰)
最后应说明的是：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行改进和修饰，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，也应落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.一种运用RP-DAD-HPLC快速测定沙棘主要黄酮苷元含量的检测方法，其特征在于：
(1)检测周期10min
(2)同时测定6种沙棘主要黄酮苷元。
(3)所述的黄酮苷元为儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素。
(4)采用RP-DAD-HPLC法对6种主要黄酮苷元的含量进行测定，使用分波段扫描，对不同黄酮苷元进行单独测量。
2.根据权利要求1所述的6种主要黄酮苷元的含量测定方法，其特征在于，在RP-DAD-HPLC色谱仪上进行等度洗脱，色谱柱为十八烷基键合硅胶色谱柱，采用甲醇-水-酸为流动相，检测波长为200～400nm，柱温为35-45℃。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为SHIMADZU C18柱(150mm×2.1mm，5μm)。
4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述流动相中甲醇、水(酸的体积浓度为0.1％-0.8％)的体积比为60：40，所述流速为1.0mL/min。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，酸的体积百分浓度为0.4％。
6.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，检测波长为：儿茶素208nm，芦丁257nm，杨梅素373nm，槲皮素371nm，山奈酚367nm，异鼠李素371nm。
7.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述柱温为40℃。
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