CN104280493A

CN104280493A - 板蓝根药材的检测方法

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Publication number: CN104280493A
Application number: CN201310291761.2A
Authority: CN
Inventors: 张慧晔; 徐小飞; 李楚源; 王德勤
Original assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN HEJI HUANGPU CHINESE MEDICINE CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU BAIYUNSHAN HEJI HUANGPU CHINESE MEDICINE CO Ltd
Priority date: 2013-07-11
Filing date: 2013-07-11
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2033-07-11
Also published as: CN104280493B

Abstract

本发明公开了一种板蓝根药材的检测方法，包括如下步骤：（1）确定相对校正因子:①制备含胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和（R,S）-告依春的混合对照品溶液；②采用高效液相色谱法分析上述混合对照品溶液；③根据步骤②检测得到的结果计算相对校正因子；（2）制备参照成分的对照品溶液；（3）制备板蓝根药材的供试品溶液；（4）采用高效液相色谱法分析步骤（2）的对照品溶液和（3）的供试品溶液，得参照成分的含量，其中色谱条件与步骤②相同；（5）计算其他成分的含量，即得。该检测方法可以在仅使用一个对照品的情况下，实现多个核苷成分测定，具有测定准确快速，重现性、选择性好，专属性强，结果误差小，低成本和操作方便等优点。

Description

板蓝根药材的检测方法

技术领域

本发明涉及化学分析检测技术领域，特别是涉及一种板蓝根药材的检测方法。

背景技术

板蓝根为我国传统中药，历代本草均有记载，始载于《神农本草经》，2010年版《中国药典》一部收载为十字花科植物菘蓝IsatisindigoticaFort.的干燥根；主产于安徽、河北、甘肃、河南、黑龙江等省。板蓝根具有清热，解毒，凉血，利咽之功效；临床用于治疗流行性感冒、高热头痛、瘟毒发斑、大头瘟疫、烂喉丹疼、疗腮、喉痹、疮肿、水痘麻疹、肝炎等，其主要药理作用有抗肿瘤、抑菌消炎、抗病毒、免疫调节等，是清热解毒类中药的代表药物之一。板蓝根化学成分复杂，主要成分有靛蓝、靛玉红、喹唑酮酸、棕榈酸、苯甲酸、水杨酸、脯氨酸、精氨酸、腺苷、尿苷、尿嘌呤、鸟嘌呤和次黄嘌呤等等，其中的核苷类成分具有抗毒、解热和活血等作用。以多种成分评价中药质量，有利于表征中药化学成分的整体性和复杂性。

然而，多成分的含量测定所用对照品较多，时间和金钱成本较高。

2010版《中国药典》中以表告依春为板蓝根的含测指标。研究表明表告依春并不稳定，受光照、温度影响较大，并不能完全准确的评价板蓝根药材的质量。而且中药成分较为复杂，用1～2种化学成分评价中药质量的模示，并不能表征中药化学成分的整体性和复杂性，不能有效地评价中药的质量。

现有文献报道的板蓝根中核苷类成分的含量测定方法，所选用的指标成分有的比较单一，如腺苷；有的虽采用了多指标综合评价，但仍不够全面，而且采用这些方法所用对照品较多，成本较高，有些对照品并不稳定，不易制备和测定。

目前，在采用多指标评价药材质量的研究中，大多采用多种方法分别测定或者采用一种色谱条件不同检测波长的方法测定相应指标成分，这种方法耗时、耗材、耗力。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种板蓝根药材的检测方法。

具体的技术方案如下：

一种板蓝根药材的检测方法，包括如下步骤：

（1）确定相对校正因子

①制备含胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和（R,S）-告依春的混合对照品溶液；

②采用高效液相色谱法分析上述混合对照品溶液，色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相A为水，流动相B为甲醇，0-20min，流动相A与流动相B的体积比为94:6-95:5；20-60min，流动相A与流动相B的体积比为由94:6-95:5变化至80:20；流速为0.4-0.7ml/min，检测波长为240-260nm，柱温25-35℃；

③根据步骤②检测得到的结果计算相对校正因子

f_{km} = \frac{f_{k}}{f_{m}} = \frac{W_{k} \times A_{m}}{W_{m} \times A_{k}}

其中f_km—相对校正因子

W_k—参照成分的浓度

A_k—参照成分的峰面积

W_m—其他成分的浓度

A_m—其他成分的峰面积

所述参照成分为胞苷、尿苷、鸟苷或腺苷；

（2）制备参照成分的对照品溶液；

（3）制备板蓝根药材的供试品溶液；

（4）采用高效液相色谱法分析步骤（2）的对照品溶液和（3）的供试品溶液，得参照成分的含量，其中色谱条件与步骤②相同；

（5）根据下式计算其他成分的含量

Wm = \frac{W_{k} \times A_{m}}{f_{km} \times A_{k}},

即得。

在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的条件为：流动相A为水，流动相B为甲醇，0-20min，流动相A与流动相B的体积比为95:5；20-30min，流动相A与流动相B的体积比为由95:5至90:10-85:15；然后洗脱至60min。

在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的条件为：流动相A为水，流动相B为甲醇，0-20min，95:5；20-30min，流动相A与流动相B的体积比为由95:5至85:15；30-45min，流动相A与流动相B的体积比为85:15。

在其中一个实施例中，所述混合对照品溶液的制备方法如下：取胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷、（R,S）-告依春各对照品，精密称定，置棕色瓶中，加溶剂制成每1mL含胞苷0.01-0.4mg、尿苷0.01-0.4mg、鸟苷0.01-0.4mg、腺苷0.01-0.4mg、（R,S）-告依春0.05-2.0mg的混合溶液，所述溶剂为水或甲醇中的一种或两种，摇匀，即得。

在其中一个实施例中，所述混合对照品溶液的制备方法如下：取胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷、（R,S）-告依春各对照品，精密称定，置棕色瓶中，加水或体积百分含量为10%的甲醇水溶液或体积百分含量为70%的甲醇水溶液制成每1mL含胞苷0.0212-0.212mg、尿苷0.0382-0.382mg、鸟苷0.038-0.38mg、腺苷0.0282-0.282mg、表告依春0.1055-1.055mg的混合溶液，摇匀，即得。

在其中一个实施例中，所述供试品溶液的制备方法如下：将板蓝根药材粉碎过筛，精密称重，加溶剂超声提取或回流提取或煎煮提取，所述溶剂为水或甲醇中的一种或两种，所述溶剂的重量为板蓝根药材重量的6-100倍，过滤，取续滤液即得。

在其中一个实施例中，所述溶剂的重量为板蓝根药材重量的20-60倍（最优选为50倍）。

在其中一个实施例中，所述参照成分为腺苷，所述腺苷对照品溶液的制备方法如下：取腺苷对照品，精密称定，置棕色瓶中，加溶剂制成每1mL含腺苷0.1-0.4mg的溶液，所述溶剂为水或甲醇中的一种或两种，摇匀，即得。

在其中一个实施例中，步骤②中流动相的流速为0.5ml/min，检测波长为254nm，柱温30℃。

本发明板蓝根药材检测方法的优点如下：

（1）本方法较2010年版《中国药典》中板蓝根质量标准多检测了4个核苷类成分（胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷)，而这4种核苷类成分均为板蓝根的活性成分，因此含测指标的增加有益于板蓝根的品质评价与质量控制，另一方面增加的指标成分对板蓝根的鉴别也具有重要意义。

（2）本发明所用提取方法快速方便、简单实用，所采用的色谱条件可以同时测定板蓝根药材中的5种成分{胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和（R,S）-告依春}。

（3）本发明的检测方法可以在仅使用一个对照品的情况下，实现多个核苷成分测定。具有测定准确快速，重现性、选择性好，专属性强，结果误差小，低成本和操作方便等优点。本发明检测方法的运用可以更好、更快、更准确的监控和评价中药材的质量。

附图说明

图1为混合对照品溶液的高效液相色谱图；

图2为板蓝根药材供试品溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明做进一步阐述。

实施例1

1仪器与试剂

1.1仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪、Agilent 1100高效液相色谱仪和Waters2695-2996高效液相色谱仪。CP225D十万分之一电子天平、BT214D万分之一电子天平、SB25-12DTD超声波清洗器及锥形瓶、漏斗、滤纸等。

1.2试剂与样品

腺苷（批号：110879-201202）标准品购自中国药品生物制品鉴定所，鸟苷（批号：106K1848）、尿苷（批号：1001157075）、胞苷（批号：100914316）标准品购自德国SIGMA公司，（R,S）-告依春（批号：111753-201103）标准品均购自中国食品药品检定研究院。甲醇（色谱纯），水为高纯水，其余试剂均为分析纯。

实验用板蓝根药材分别采集于黑龙江大庆、安徽、河南、河北、陕西、山西、山东日照和甘肃，经广东省中药研究所丘金裕主任中药师鉴定，原植物为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根。

2方法与结果

2.1方法

2.1.1色谱条件

（1）色谱柱为AgilentC₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为水（A）-甲醇（B），梯度洗脱：0～20min,流动相A与流动相B的体积比围95:5；20～30min,流动相A与流动相B的体积比由95:5至85:15；30～45min,流动相A与流动相B的体积比为85:15。流速0.5mL/min，检测波长254nm，柱温30℃，进样量10μL。上述色谱条件下，各待测组分峰分离效果良好(分离度＞1.5)，参见图1和图2。

2.1.2对照品溶液的制备

（1）混合对照品溶液的制备

取胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷、（R,S）-告依春各对照品适量，精密称定，置棕色瓶中，加水制成每1mL含胞苷0.0212mg、尿苷0.0382mg、鸟苷0.038mg、腺苷0.0282mg、（R,S）-告依春0.1055mg的混合溶液，摇匀，即得。

（2）参照成分对照品溶液的制备

腺苷对照品溶液的制备方法如下：取腺苷对照品，精密称定，置棕色瓶中，加水制成每1mL含腺苷0.0282mg的溶液，摇匀，即得。

2.1.3板蓝根药材供试品溶液的制备

取板蓝根粉末（过四号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水50mL，称定重量，摇匀，超声30min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4线性关系考察

分别吸取5个浓度的混合对照品溶液注入高效液相色谱仪。以混合对照品溶液中各成分进样量（μg)对峰面积积分值(A）进行线性回归处理，得到胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和（R,S）-告依春的标准曲线。结果表明5种成分在相应的线性范围内线性关系良好，结果见下表1。

表1各成分标准曲线及线性范围

2.1.5精密度考察

精密吸取同一混合对照品溶液10μL，连续进样6次，结果胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和（R,S）-告依春的RSD值分别为0.11%、0.19%、0.09%、0.06%、0.39%。表明仪器的精密度良好。

2.1.6稳定性考察

取新制备的板蓝根供试品溶液，在室温下放置0，3，6，9，12后各精密吸取10μL进样，胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和（R,S）-告依春色谱峰峰面积的RSD分别为2.21%、1.02%、0.69%、0.44%和0.76%，结果表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.1.7重复性考察

取同一批板蓝根药材粉末，共6份，精密称定，按2.1.3方法制备样品，注入高效液相色谱仪进行测定，计算各成分含量，计算得出胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和（R,S）-告依春的RSD值分别为1.96%、1.26%、1.91%、0.55%、1.91%，结果表明该方法重复性良好。

2.1.8加样回收率

精密称取已知含量的同一批次样品约0.5g，加入各成分对照品适量，按照供试品溶液制备方法制备，按2.1.1项下方法进行分析。结果显示，胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷和（R,S）-告依春的平均加样回收率分别为98.24%、100.57%、98.98%、98.38%和102.99%，RSD分别为2.6%、1.24%、1.77%，0.92%和1.15%。结果如下表2。

表2加样回收率考察结果（n=6）

2.2相对校正因子的计算及其耐用性验证

2.2.1待测成分相对校正因子的计算

在一定的范围内（线性范围内）待测成分的浓度（W）与待测成分的峰面积（A）成正比，即W＝fA，选取待测成分中一组分k为参照成分，建立组分k与其他组分m之间的相对校正因子，即f_km＝f_k/f_m＝（W_k×A_m）/（W_m×A_k）。配置一定浓度的混合对照品溶液，精密吸取不同体积的同一混合对照品进样分析，分别计算不同进样体积下的f_km，然后计算平均值，并以其作为相对校正因子进行样品测定。

本实施例以腺苷为参照成分（f_k），计算各成分的相对校正因子如下表3：

表3相对校正因子

2.2.2采用不同高效液相色谱仪测定的耐用性验证

取2.1.2项下的系列混合对照品溶液，分别精密吸取10μL，采用Agilent C₁₈色谱柱，分别在Agilent 1260、Agilent 1100、Waters2695-2996高效液相色谱仪上进样检测，求算以胞苷，尿苷及腺苷分别作为参照成分时其他4种成分的相对校正因子，采用不同仪器测定得到的各待测成分相对校正因子的RSD评价相对校正因子的耐用性，结果显示RSD在0.52%～2.97%之间，说明相对校正因子在使用不同仪器时的耐用性良好，结果见表4。

表4不同液相色谱仪测定的相对校正因子耐用性考察结果

2.2.3采用不同C₁₈色谱柱测定的耐用性验证

取2.1.2项下的系列混合对照品溶液，分别精密吸取10μL，在Agilent 1260高效液相色谱仪上，分别采用Agilent C₁₈色谱柱、DiKMA Diamonsil C₁₈色谱柱和Hibar RP-18色谱柱进行检测，求算以胞苷，尿苷，及腺苷分别作为参照成分时其他4种成分的相对校正因子，使用不同色谱柱测定时各相对校正因子RSD<1.25%，说明相对校正因子在使用不同色谱柱时耐用性良好，结果见表5。

表5不同C₁₈色谱柱测定的相对校正因子耐用性考察结果

2.3待测成分色谱峰的定位

本研究比较了在使用不同仪器及色谱柱进行测定时，保留时间、保留时间差值（绝对值）及相对保留时间对5种待测成分色谱峰在色谱图上的定位准确度(以RSD评价)。各待测成分的保留时间、保留时间差值及相对保留值的RSD分别为0.21%～1.23%；0.62%～2.41%；0.20%～1.27%。由结果可知，保留时间差值的变化范围稍大，保留时间和相对保留时间数值稳定，可以用于待测成分色谱峰的定位，结果见表6、7。

表6板蓝根各成分保留时间结果

表7板蓝根各成分保留时间差值绝对值和相对保留时间结果

2.5本发明检测方法与外标法测定结果的比较

选取腺苷作为参照成分，计算33批板蓝根药材样品中其他4种成分的质量分数（W_f)，并与外标法的测定结果(W_s)进行比较，结果见表8，由表得出同一成分分别用2种方法求得的含量值之间均无显著性差异。

表8两种方法测定33批板蓝根药材中5种成分的含量

此外，采用外标法与本发明检测方法所得含量的比值（Ws/Wf）评价本发明检测方法的准确度，以腺苷作为参照成分时，其他成分（Ws/Wf）的比值在97.48%～104.66%之间。结果表明本发明建立的检测方法的准确度与外标法相当，见表9。

表9外标法和本发明检测方法测定4种成分的准确度比较

2.6结论

本发明建立了准确、快速且耐用性良好的5种活性成分同时定位定量的板蓝根药材的检测方法，为将该方法应用于板蓝根药材的质量控制提供了可靠依据。

实施例2

1.仪器与试剂：同实施例1

2方法与结果

2.1方法

2.1.1色谱条件

色谱柱为Waters C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为水（A）-甲醇（B），梯度洗脱：0～20min,流动相A与流动相B的体积比围95:5；20～30min,流动相A与流动相B的体积比由95:5至90:10；30～60min,流动相A与流动相B的体积比由90:10至80:20。流速0.6mL/min，检测波长254nm，柱温30℃，进样量10μL。上述色谱条件下，各待测组分峰分离效果良好(分离度＞1.5)，谱图与图1类似（略去）。

2.1.2对照品溶液的制备

（1）混合对照品溶液的制备

取胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷、（R,S）-告依春各对照品适量，精密称定，置棕色瓶中，加10%甲醇水制成每1mL含胞苷0.0212mg、尿苷0.0382mg、鸟苷0.038mg、腺苷0.0282mg、（R,S）-告依春0.1055mg的混合溶液，摇匀，即得。

（2）参照成分对照品溶液的制备

腺苷对照品溶液的制备方法如下：取腺苷对照品，精密称定，置棕色瓶中，加10%甲醇水制成每1mL含腺苷0.0282mg的溶液，摇匀，即得。

2.1.3板蓝根药材供试品溶液的制备

取板蓝根粉末（过四号筛）约1g，精密称定，置容器中，精密加入水100mL，称定重量，摇匀，煎煮1小时，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4方法学考察

线性关系考察结果显示，每个成分的回归方程的R²＞0.999，表明5种成分在相应的线性范围内线性关系良好。精密度考察结果显示，每个成分连续进样6次的RSD小于3%。表明仪器的精密度良好。稳定性考察结果显示，供试品溶液在12h内稳定性良好。重复性考察结果显示，5种成分RSD值都小于3%，结果表明该方法重复性良好。加样回收率在98%～104%范围内，RSD都小于3%，符合方法学要求。

2.2相对校正因子的计算及其耐用性验证，结果显示符合方法学要求。

实施例3

1.仪器与试剂：同实施例1

2方法与结果

2.1方法

2.1.1色谱条件

色谱柱为Dikma Diamonsil C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为水（A）-甲醇（B），梯度洗脱：0～20min,流动相A与流动相B的体积比围94:6；20～40min,流动相A与流动相B的体积比由94:6至85:15；40～60min,流动相A与流动相B的体积比为85:15。流速0.4mL/min，检测波长254nm，柱温25℃，进样量10μL。上述色谱条件下，各待测组分峰分离效果良好(分离度＞1.5)，谱图与图1类似（略去）。

（1）混合对照品溶液的制备

取胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷、（R,S）-告依春各对照品适量，精密称定，置棕色瓶中，加70%甲醇水制成每1mL含胞苷0.0212mg、尿苷0.0382mg、鸟苷0.038mg、腺苷0.0282mg、（R,S）-告依春0.1055mg的混合溶液，摇匀，即得。

（2）参照成分对照品溶液的制备

腺苷对照品溶液的制备方法如下：取腺苷对照品，精密称定，置棕色瓶中，加70%甲醇水制成每1mL含腺苷0.0282mg的溶液，摇匀，即得。

2.1.3板蓝根药材供试品溶液的制备

取板蓝根粉末（过四号筛）约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4方法学考察

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种板蓝根药材的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）确定相对校正因子

③根据步骤②检测得到的结果计算相对校正因子

f_{km} = \frac{f_{k}}{f_{m}} = \frac{W_{k} \times A_{m}}{W_{m} \times A_{k}}

其中f_km—相对校正因子

W_k—参照成分的浓度

A_k—参照成分的峰面积

W_m—其他成分的浓度

A_m—其他成分的峰面积

所述参照成分为胞苷、尿苷、鸟苷或腺苷；

（2）制备参照成分的对照品溶液；

（3）制备板蓝根药材的供试品溶液；

（5）根据下式计算其他成分的含量

Wm = \frac{W_{k} \times A_{m}}{f_{km} \times A_{k}},

即得。

2.根据权利要求1所述的板蓝根药材的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件为：流动相A为水，流动相B为甲醇，0-20min，流动相A与流动相B的体积比为95:5；20-30min，流动相A与流动相B的体积比为由95:5变化至90:10-85:15；然后洗脱至60min。

3.根据权利要求1所述的板蓝根药材的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件为：流动相A为水，流动相B为甲醇，0-20min，95:5；20-30min，流动相A与流动相B的体积比为由95:5变化至85:15；30-45min，流动相A与流动相B的体积比为85:15。

4.根据权利要求1-3任一项所述的板蓝根药材的检测方法，其特征在于，所述混合对照品溶液的制备方法如下：取胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷、（R,S）-告依春各对照品，精密称定，置棕色瓶中，加溶剂制成每1mL含胞苷0.01-0.4mg、尿苷0.01-0.4mg、鸟苷0.01-0.4mg、腺苷0.01-0.4mg、（R,S）-告依春0.05-2.0mg的混合溶液，所述溶剂为水或甲醇中的一种或两种，摇匀，即得。

5.根据权利要求4所述的板蓝根药材的检测方法，其特征在于，所述混合对照品溶液的制备方法如下：取胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷、（R,S）-告依春各对照品，精密称定，置棕色瓶中，加水或体积百分含量为10%的甲醇水溶液或体积百分含量为70%的甲醇水溶液制成每1mL含胞苷0.0212-0.212mg、尿苷0.0382-0.382mg、鸟苷0.038-0.38mg、腺苷0.0282-0.282mg、表告依春0.1055-1.055mg的混合溶液，摇匀，即得。

6.根据权利要求1-3任一项所述的板蓝根药材的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法如下：将板蓝根药材粉碎过筛，精密称重，加溶剂超声提取或回流提取或煎煮提取，所述溶剂为水或甲醇中的一种或两种；溶剂的体积或重量为板蓝根药材重量的6-100倍，过滤，取续滤液即得。

7.根据权利要求6所述的板蓝根药材的检测方法，其特征在于，所述溶剂的重量为板蓝根药材重量的20-60倍。

8.根据权利要求7所述的板蓝根药材的检测方法，其特征在于，所述溶剂的重量为板蓝根药材重量的50倍。

9.根据权利要求1-3任一项所述的板蓝根药材的检测方法，其特征在于，所述参照成分为腺苷，所述腺苷对照品溶液的制备方法如下：取腺苷对照品，精密称定，置棕色瓶中，加溶剂制成每1mL含腺苷0.01-0.4mg的溶液，所述溶剂为水或甲醇中的一种或两种，摇匀，即得。

10.根据权利要求1-3任一项所述的板蓝根药材的检测方法，其特征在于，步骤②中流动相的流速为0.5ml/min，检测波长为254nm，柱温30℃。