CN115060826A - 一种板青颗粒的三维高效液相色谱检测方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中兽药检测技术领域,具体涉及一种板青颗粒的三维高效液相色谱(HPLC)检测方法。本发明采用高效液相色谱仪器配四元高压泵、二级阵列管检测器(DAD检测器)柱温箱、蒸发光检测器,对具有紫外吸收的组分进行液相三维监测,确定色谱峰纯度,筛选特征成分,落实为三维特征图谱,并标记以胞苷、尿苷、鸟苷、(R,S)‑告依春和腺苷为药效成分关联的特征峰,进而构建板青颗粒三维质控标准体系,从三维立体视角,全息监测板青颗粒组分,最终确定质控指标。通过构建板青颗粒三维质控标准体系,建立质量标准,从而便于综合评价板青颗粒制剂质量。

Description

一种板青颗粒的三维高效液相色谱检测方法及其用途
技术领域
本发明属于中兽药检测技术领域,具体涉及一种板青颗粒的三维检测方法及其在板青颗粒质量控制中的用途。
背景技术
板青颗粒收载于《中华人民共和国兽药典》2020版二部,由板蓝根、大青叶两味中药煎煮浓缩后,与适量蔗糖、糊精混合制粒而成,具有清热解毒,凉血的功效,临床主要用于治疗风热感冒,咽喉肿痛,热病发斑等症,临床上广泛用于畜禽风热感冒、咽喉肿痛、热病发斑等温热性疾病的防治。
目前2020版中国兽药典中板青颗粒仅采用精氨酸进行定性薄层鉴别检测,仅一个检测指标,专属性不强,较构建三维质控标准体系综合评价制剂质量而言,该检测方法过于单一,没有三维评价更加全面、立体及直观,且无指标性成分的定性鉴别及定量测定,不能全面评价复方制剂的内在质量,且精氨酸的鉴别方法在实际质检中也很难对板青颗粒质量的优劣进行全面评价,这就造成了市面上假兽药、劣兽药的混入,进而导致板青颗粒质量也是参差不齐。
中国专利CN103575818A公开了一种板青颗粒质量控制方法,该方法使用HPLC色谱法同时测定精氨酸和靛玉红含量,其将板青颗粒中精氨酸的含量限度定为每克颗粒中不少于12.5mg/g,靛玉红为0.12mg/g。但是,板青颗粒是一种含多组分复杂成分的兽药复方中药,由于成分复杂,造成含量不易控制,使中药的安全性和有效性受到影响。尽管中国专利CN103575818A比2020版中国兽药典增加了一个含量测定指标,但是仍不能满足对板青颗粒的质量进行精细控制的需求。
发明内容
为了填补现有技术中尚未满足的技术空白,本发明提供了一种板青颗粒的三维高效液相色谱(HPLC)检测方法,所述检测方法采用高效液相色谱仪器配四元高压泵、二级阵列管检测器(DAD检测器)柱温箱、蒸发光检测器,对具有紫外吸收的组分进行液相三维监测,确定色谱峰纯度,筛选特征成分,落实为三维特征图谱,并标记以胞苷、尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春和腺苷为药效成分关联的特征峰,进而构建板青颗粒三维质控标准体系。
具体地,通过以下几个方面的技术方案实现了本发明:
在第一个方面中,本发明提供了一种板青颗粒的三维高效液相色谱(HPLC)检测方法,所述检测方法使用HPLC同时测定板青颗粒中的胞苷、尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春和腺苷,再在所述HPLC特征图谱基础上,建立所述板青颗粒的三维特征图谱。
作为可选的方式,在上述检测方法中,所述检测方法包括以下步骤:
(1)分别制备胞苷、尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春和腺苷的对照样品;
(2)制备板青颗粒的供试样品;
(3)将所述标准样品和所述供试样品分别进行HPLC检测;
(4)再在所述HPLC特征图谱基础上,建立所述板青颗粒的三维特征图谱。
作为可选的方式,在上述检测方法中,在步骤(1)中,精密称取胞苷对照品、尿苷对照品、鸟苷对照品、(R,S)-告依春对照品和腺苷对照品适量,加甲醇分别制成含胞苷对照品、尿苷对照品、鸟苷对照品、(R,S)-告依春对照品g和腺苷对照品的溶液,即得混合对照品溶液。
作为可选的方式,在上述检测方法中,在步骤(2)中,取板青颗粒样品,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入20%甲醇,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用20%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得所述板青颗粒的供试样品。
作为可选的方式,在上述检测方法中,超声处理条件为功率200W,频率40kHz。
作为可选的方式,在上述检测方法中,在步骤(3)中,HPLC检测的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的SB-C18色谱柱,色谱柱规格为3.0mm×100mm,2.7μm;以水为流动相A,以甲醇为流动相B,进行梯度洗脱;柱温为30℃;检测波长为254nm,理论塔板数按(R,S)-告依春峰计算不低于4000。
作为可选的方式,在上述检测方法中,梯度洗脱条件如下所示
Figure BDA0003713691160000041
Figure BDA0003713691160000051
作为可选的方式,在上述检测方法中,建立所述板青颗粒的三维特征图谱的方法为采用2级阵列管检测器,记录全波长吸收行为,X轴时间,Y轴响应值,Z轴波长,形成三维立体图。
在第二个方面中,本发明提供了上述第一个方面所述的检测方法在板青颗粒质量控制中的用途。
作为可选的方式,在上述用途中,根据板青颗粒三维图谱的药效成分胞苷、尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春和腺苷响应值的高低差异,进而直观对比各种板青颗粒的质量差异。
作为可选的方式,在上述用途中,如果某一板青颗粒供试样品各药效成分响应值高于其他板青颗粒供试样品,则说明所述板青颗粒供试样品各药效成分含量较高、质量较好,反之则说明质量较差,可能是劣兽药。
本发明相对于现有技术,具有以下有益效果:
本发明通过处理得到板青颗粒多指标成分特征图谱,并标记以胞苷、尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春和腺苷为药效成分关联的特征峰,进而构建板青颗粒三维质控标准体系,从三维立体视角,全息监测板青颗粒组分,选定适合申请人公司产品的控制指标,最终确定质控指标,增加公司产品的核心竞争力。
该体系的构建不仅对或尚未颁布的兽药典质量标准的提升,以及申请人自身产品的质量控制,发挥着巨大作用,而且对企业,乃至整个中兽药行业发展,都有很大的推进意义。
附图说明
图1:混合对照品的色谱图。顺序:胞苷、尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春、腺苷。
图2:板青颗粒样品1的特征图谱和特征峰。
图3:板青颗粒样品2的特征图谱和特征峰。
图4:板青颗粒样品3的特征图谱和特征峰。
图5:板青颗粒样品4的特征图谱和特征峰。
图6:板青颗粒样品5的特征图谱和特征峰。
图7:板青颗粒样品6的特征图谱和特征峰。
图8:板青颗粒样品1的三维特征图谱。
图9:板青颗粒样品2的三维特征图谱。
图10:板青颗粒样品3的三维特征图谱。
图11:板青颗粒样品4的三维特征图谱。
图12:板青颗粒样品5的三维特征图谱。
图13:板青颗粒样品6的三维特征图谱。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明,并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为市售产品。
实施例:
1.仪器与试药
1.1仪器
Agilent-1260InfinityⅡ高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司);PS-40AD超声波清洗器(深圳市科洁超声科技有限公司);CP225D型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)。
1.2试剂
甲醇(色谱纯,美国TEDIA公司,批号:21115131);甲醇为分析纯,水为娃哈哈纯净水。
1.3对照品
胞苷对照品(供含量测定用,成都克洛玛生物科技有限公司,批号:CHB201228),尿苷对照品(供含量测定用,成都克洛玛生物科技有限公司,批号:CHB180121),鸟苷对照品(供含量测定用,成都克洛玛生物科技有限公司,批号:CHB180118),(R,S)-告依春对照品(供含量测定用,成都克洛玛生物科技有限公司,批号:CHB210105),腺苷对照品(供含量测定用,成都克洛玛生物科技有限公司,批号:CHB190220)
1.4样品:
6个不同厂家的板青颗粒样品。
2.色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的InfinityLab Poroshell 120SB-C18色谱柱,色谱柱规格为3.0mm×100mm,2.7μm;以水为流动相A,以甲醇为流动相B,按下表1中的规定进行梯度洗脱;柱温为30℃;检测波长为254nm。理论塔板数按(R,S)-告依春峰计算应不低于4000。
表1梯度洗脱技术参数
Figure BDA0003713691160000091
3.溶液的制备
3.1供试品溶液的制备
取板青颗粒不同厂家供试样品约1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入20%甲醇20mL,称定重量,超声处理(功率200W,频率40kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用20%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
3.2对照品溶液的制备
精密称取胞苷对照品、尿苷对照品、鸟苷对照品、(R,S)-告依春对照品和腺苷对照品适量,加甲醇分别制成每1mL含胞苷对照品30.2μg、尿苷对照品31.4μg、鸟苷对照品27.6μg、(R,S)-告依春对照品25.6μg和腺苷对照品29.4μg的溶液,即得混合对照品溶液。
4.三维质控体系的构建
4.1特征图谱的建立及特征峰的标定
处理得到混合对照品及6个不同厂家的板青颗粒样品在254nm波长下的特征图谱,见图1-图7。
4.2构建三维特征图谱
在混合对照品及6个不同厂家的板青颗粒样品在254nm波长下的特征图谱基础上,分别建立不同厂家板青颗粒的三维特征图谱,见图8-图13。
通过特征图谱图1-图7中可以看出,在紫外单波长254nm条件下,6个厂家的板青颗粒之间化学成分响应值存在一定差异,即含量高低明显不同;再通过三维图谱图8-图13可以看出,在全波长条件下,6个不同厂家的板青颗粒三维图谱的信息量及响应值的高低差异,进而可以直观对比出各自的质量差异,即样品4的各药效成分响应值均高于其他样品(图11),说明其各成分含量较高,质量较好,可以进行大批量购买;样品6与其他板青颗粒整体三维图谱特征信息完全不同(图13),只有(R,S)-告依春成分,而未检出胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷等成分,说明其质量较差,可能是劣兽药,不建议进行购买,因此该三维质控标准体系的建立不仅可综合评价板青颗粒制剂质量,也更便于自家产品跟市场销量大竞品比对制剂质量,增加公司产品的核心竞争力,具有很大的应用价值。
5讨论与结论
方中板蓝根为十字花科菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根,主要含有生物碱类、核苷类、有机酸类、木脂素类等其他类化学成分。2020年版《中国兽药典》二部中板蓝根药材质量标准是以(R,S)-告依春为指标成分进行高效液相色谱定量测定,可实现与南板蓝根的快速鉴别。大青叶与板蓝根为同源植物,为菘蓝的干燥叶,与板蓝根所含化学成分基本一致。
本研究结合板青颗粒的临床药效,建立以(R,S)-告依春、胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷为特征峰的三维特征图谱,其中(R,S)-告依春属于生物碱类,在板青颗粒中含量较高且易溶于水,现代药理学研究表明其具有良好的抗炎、抗病毒、解热等作用,而胞苷、尿苷、鸟苷和腺苷等则属于核苷类成分,同样在方中含量较高且易溶于水,主要通过干扰病毒核酸合成发挥临床疗效,也是板青颗粒抗病的主要活性成分,而故可选择上述5个与药效关联的化学成分作为指标性成分来控制该制剂的质量。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种板青颗粒的三维高效液相色谱(HPLC)检测方法,其特征在于:所述检测方法使用HPLC同时测定板青颗粒中的胞苷、尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春和腺苷,再在所述HPLC特征图谱基础上,建立所述板青颗粒的三维特征图谱。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:所述检测方法包括以下步骤:
(1)分别制备胞苷、尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春和腺苷的对照样品;
(2)制备板青颗粒的供试样品;
(3)将所述标准样品和所述供试样品分别进行HPLC检测;
(4)再在所述HPLC特征图谱基础上,建立所述板青颗粒的三维特征图谱。
3.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于:
在步骤(1)中,精密称取胞苷对照品、尿苷对照品、鸟苷对照品、(R,S)-告依春对照品和腺苷对照品适量,加甲醇分别制成含胞苷对照品、尿苷对照品、鸟苷对照品、(R,S)-告依春对照品g和腺苷对照品的溶液,即得混合对照品溶液。
4.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于:
在步骤(2)中,取板青颗粒样品,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入20%甲醇,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用20%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得所述板青颗粒的供试样品,优选地,超声处理条件为功率200W,频率40kHz。
5.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于:
在步骤(3)中,HPLC检测的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的SB-C18色谱柱,色谱柱规格为3.0mm×100mm,2.7μm;以水为流动相A,以甲醇为流动相B,进行梯度洗脱;柱温为30℃;检测波长为254nm,理论塔板数按(R,S)-告依春峰计算不低于4000。
6.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于:梯度洗脱条件如下所示
Figure FDA0003713691150000021
Figure FDA0003713691150000031
7.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于:建立所述板青颗粒的三维特征图谱的方法为采用2级阵列管检测器,记录全波长吸收行为,X轴时间,Y轴响应值,Z轴波长,形成三维立体图。
8.权利要求1至7中任一项所述的检测方法在板青颗粒质量控制中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于:根据板青颗粒三维图谱的药效成分胞苷、尿苷、鸟苷、(R,S)-告依春和腺苷响应值的高低差异,进而直观对比各种板青颗粒的质量差异。
10.根据权利要求9所述的用途,其特征在于:如果某一板青颗粒供试样品各药效成分响应值高于其他板青颗粒供试样品,则说明所述板青颗粒供试样品各药效成分含量较高、质量较好,反之则说明质量较差,可能是劣兽药。
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