CN112730674A - 一种罗汉茶的质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种罗汉茶的质量检测方法，该方法是用薄层色谱法对罗汉茶进行定性分析，利用薄层色谱微量、快速而简单的优点进行预测，再利用高效液相色谱法进行定量分析，基于高效液相色谱技术，结合一测多评法，以落新妇苷对照品为参照，同时测定罗汉茶中新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷6种成分的含量，成本低、时间短、操作简便，且检测结果较为准确。通过本发明的质量检测方法对罗汉茶进行定性分析和定量分析，为罗汉茶的质量标准建立奠定了基础。

Description

一种罗汉茶的质量检测方法
技术领域
本发明涉及中医药质量检测技术领域，具体是一种罗汉茶的质量检测方法。
背景技术
罗汉茶为胡桃科植物黄杞(Engelhardia roxburghiana wal1．)的干燥叶，是广西民间用量较大的壮药材，具有清热解毒、生津止渴、解暑利湿的功效，在广西各地区均有分布，曾收载在《广西中药材标准》。经研究表明，黄杞叶中含有主要的成分是黄酮类，其中二氢黄酮是黄杞叶中的主要活性成分，如落新妇苷、花旗松素和黄杞苷等。黄杞叶中落新妇苷的含量非常高，其含量超过黄杞含量的一半。此外，黄杞叶还含有醌类、甾类、三萜类等成分。黄杞叶的主要活性成分是落新妇苷，现代研究表明，落新妇苷能够降低胆固醇，保护肝脏以及具有镇痛、抗水肿作用；此外，落新妇苷还具有选择性免疫抑制等多种生物活性作用。花旗松素为落新妇苷的苷元，具有抗癌、抗炎、抗病毒等作用；黄杞叶还含有黄杞苷这种二氢黄酮醇类化合物，其有较强的抗氧化活性。黄杞叶还具有抗炎、抗癌、抗过敏、降血脂、降血糖、增强免疫力、防治动脉粥样硬化等多方面的药理作用。《中华本草》记载黄杞树皮行气化湿；叶可作茶饮，具有清热解毒、生津止渴、解暑利湿的作用，可用于脾胃湿滞、胸腹胀闷、感冒发烧等的治疗。
罗汉茶现行的质量标准收录于《广西壮族自治区壮药质量标准》中，其中关于含量测定这项，只检测了落新妇苷这一种化合物，还不能全面的描述罗汉茶的有效成分情况。覃兰芳等人通过取罗汉茶样品粉末0.5g，加甲醇10mL，超声处理30min，滤过，取续滤液作为供试品溶液，另取斛皮苷对照品，加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液，作为对照品溶液；采用硅胶G薄层板，以甲酸乙酯-丙酮-水-冰醋酸(5:4:0.8:0.4)为展开剂，用1%三氯化铝乙醇溶液显色，在紫外光灯(365nm )下，建立罗汉茶槲皮苷的TLC鉴别法。另外，其还采用甲醇-0.1%磷酸 (40:60)为流动相，在290nm的检测波长，建立了罗汉茶中落新妇苷的HPLC含量测定方法（参见覃兰芳，赖茂祥，刘布鸣，等．特色壮药材罗汉茶质量标准研究[J]．中医药导报，2012，18(II)：76-77．）。姚毅等人在色谱柱为 Lichrospher C-18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为甲醇-0.3%醋酸水溶液( v/v，45∶55)，检测波长 291nm，流速1.0mL.min-1，柱温 25℃的条件下，建立了高效液相色谱(HPLC)测定药材罗汉茶中落新妇苷含量的方法（参见姚毅，周翔，陈婷．高效液相色谱法测定罗汉茶中落新妇苷的含量[J]．中国现代应用药学，2006，23(s3)：920-921）。曲佳等人采用HPLC法，Phenomenex LunaC18色谱柱，乙腈-水-冰醋酸(22:78:0.1)为流动相，检测波长290nm，体积流量0.8mL/min；建立黄杞叶中落新妇苷及黄杞苷定量测定方法（参见曲佳，周军，侯文彬，等．HPLC法测定黄杞叶中落新妇苷和黄杞苷[J]．中草药，2009，40(2)：306-307．）。
可见，现有技术对于罗汉茶的研究均未有提供一种可以对罗汉茶进行全面评价的薄层色谱鉴别方法，也没有提到可以通过一测多评法测定罗汉茶中多种成分的含量，为了使罗汉茶的定性分析和定量分析更加全面，且能够快速、准确得到分析结果以保证罗汉茶的用药安全，本申请人提出了一种罗汉茶的质量检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种罗汉茶的质量检测方法，该方法先用薄层色谱法对罗汉茶进行定性分析，利用薄层色谱微量、快速而简单的优点进行预测，再利用高效液相色谱法进行定量分析，而且实现了“一测多评”；定性和定量分析结合为罗汉茶的质量标准建立奠定了基础。
本发明的技术方案如下：
一种罗汉茶的质量检测方法，包括罗汉茶的薄层色谱鉴别和罗汉茶的高效液相色谱检测；将定性分析和定量分析相结合建立罗汉茶的质量标准。
所述罗汉茶的薄层色谱鉴别是以槲皮苷、落新妇苷、黄杞苷为对照品，对供试品、对照药材、对照品分别用甲醇进行提取后在同一聚酰胺薄膜上成条带状点样，经展开和显色后得到薄层色谱图，实现对罗汉茶的定性分析。
当不需要确定或者已经提前确定了各对照品所对应的斑点时，罗汉茶的薄层色谱鉴别方法，具体步骤如下：
（1）取待测罗汉茶样品粉末0.5g，加甲醇10mL，超声处理30min，滤过，取滤液置于小孔树脂凝胶柱中，收集流出液作为供试品溶液。
（2）取对照药材0.5g，加甲醇10mL，超声处理30min，滤过，取滤液置于小孔树脂凝胶柱中，收集流出液作为对照药材溶液。
（3）取槲皮苷、落新妇苷、黄杞苷对照品，加甲醇制成每毫升含0.1mg槲皮苷、1mg落新妇苷、0.2mg黄杞苷的混合溶液，作为混合对照品溶液。
（4）吸取上述供试品溶液、对照药材溶液和混合对照品溶液各3μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上成条带状，以体积比为5:4:0.8:0.4的甲酸乙酯-丙酮-水-冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝试液，用热风吹干，置365nm紫外灯下检视。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
当需要确定各对照品所对应的斑点时，罗汉茶的薄层色谱鉴别方法，具体步骤如下：
（1）取待测罗汉茶样品粉末0.5g，加甲醇10mL，超声处理30min，滤过，取滤液置于小孔树脂凝胶柱中，收集流出液作为供试品溶液。
（2）取对照药材0.5g，加甲醇10mL，超声处理30min，滤过，取滤液置于小孔树脂凝胶柱中，收集流出液作为对照药材溶液。
（3）取槲皮苷加甲醇制成浓度为0.1mg/mL的槲皮苷溶液；取落新妇苷加甲醇制成浓度为1mg/mL的落新妇苷溶液；再取黄杞苷加甲醇制成浓度为0.2mg/mL的黄杞苷溶液，作为对照品溶液。
（4）吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、3种对照品溶液各3μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上成条带状，以体积比为5:4:0.8:0.4的甲酸乙酯-丙酮-水-冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝试液，用热风吹干，置365nm紫外灯下检视。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
使用单一对照品溶液可以确定各对照品所对应的斑点。而使用混合对照品溶液，溶液的制备方法更简单，甲醇的用量更少。
所述罗汉茶的高效液相色谱检测是以落新妇苷对照品为参照，以其相应的峰为S峰，设定新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷的相对保留时间（Rsi）及相对校正因子（fsi），采用一测多评法同时测定罗汉茶中新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷6种成分的含量，从而实现对罗汉茶的定量分析。
其中，以落新妇苷对照品为参照，以其相应的峰为S峰，设定新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷5种成分的Rsi及fsi，具体内容如下：
（1）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%甲酸为流动相，在乙腈:0.1%甲酸=19:81的条件下进行等梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm和291nm，通过变换波长的方式进行测定。
（2）取新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成已知各成分浓度的混合对照品溶液。
（3）精密吸取已知各成分浓度的混合对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定。
（4）以落新妇苷对照品为参照，以其相应的峰为S峰，计算新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷的Rsi及fsi。
（5）根据以上检测条件和步骤对可能引起校正系数波动的影响因素如校准曲线、不同型号的仪器、不同色谱柱、不同柱温、不同体积流量、不同的检测波长等进行考察，计算在各个影响因素条件下新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷的Rsi及fsi；取Rsi、fsi的相对标准偏差（RSD）≤5%的Rsi、fsi计算平均值作为最终的Rsi、fsi，最终得到的Rsi及fsi见下表1。
Figure 432661DEST_PATH_IMAGE001
根据以上计算得到的Rsi和fsi，采用一测多评法同时测定罗汉茶中新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷6种成分的含量，具体内容如下：
（1）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%甲酸为流动相，在乙腈:0.1%甲酸=19:81的条件下进行等梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm和291nm，通过变换波长的方式进行测定。
（2）对照品溶液的制备：取落新妇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为50μg/mL的落新妇苷溶液，即得。
（3）供试品溶液的制备：取待测罗汉茶样品粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，在功率360W、频率45KHz的超声条件下超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
（4）测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。
（5）根据测得的落新妇苷含量，依据设定的fsi计算新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷5种成分的含量。
本发明的有益效果是：
在本发明的罗汉茶质量检测方法中，以槲皮苷、落新妇苷、黄杞苷为对照品，对罗汉茶用薄层色谱进行定性分析，可以实现对罗汉茶的全面评价，弥补了现有罗汉茶薄层色谱评价不全面的缺陷，而且得到的薄层色谱斑点清晰、3种成分分离效果好，可以快速、准确地将罗汉茶与其易混淆品鉴别开来，完善了罗汉茶的质量鉴别标准。先利用薄层色谱微量、快速而简单的优点进行预测，再利用高效液相色谱法进行定量分析，基于高效液相色谱技术，结合一测多评法，以落新妇苷对照品为参照，同时测定罗汉茶中新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷6种成分的含量，成本低、时间短、操作更加简便，且本发明的高效液相色谱检测方法灵敏、精密度高、重现性好、结果准确，可作为罗汉茶内在质量的控制方法，以保证罗汉茶的用药安全。通过本发明的质量检测方法对罗汉茶进行定性分析和定量分析，为罗汉茶的质量标准建立奠定了基础。
附图说明
图1为罗汉茶样品和青钱柳样品的薄层色谱图，图中标识：1、槲皮苷，2、落新妇苷，3、黄杞苷，4、罗汉茶样品1，5、罗汉茶样品2，6、罗汉茶样品3，7、罗汉茶样品4，8、罗汉茶样品5，9、罗汉茶样品6，10、罗汉茶样品7，11、罗汉茶样品8，12、罗汉茶样品9，13、青钱柳样品1，14、青钱柳样品2，15、青钱柳样品3，A、B、C表示蓝色荧光斑点。
图2为罗汉茶样品的薄层色谱图，图中标识：1、甲醇，2、槲皮苷、落新妇苷、黄杞苷混合对照品，3、罗汉茶样品2，4、罗汉茶样品4，5、罗汉茶样品6，6、罗汉茶样品7，A、B、C表示蓝色荧光斑点。
图3为罗汉茶样品的薄层色谱图，图中标识：1、罗汉茶样品2点样量1μL，2、罗汉茶样品2点样量2μL，3、罗汉茶样品2点样量3μL，4、罗汉茶样品2点样量5μL，5、罗汉茶样品2点样量10μL，6、罗汉茶样品4点样量1μL，7、罗汉茶样品4点样量2μL，8、罗汉茶样品4点样量3μL，9、罗汉茶样品4点样量5μL，10、罗汉茶样品4点样量10μL，A、B、C表示蓝色荧光斑点。
图4是罗汉茶样品2的高效液相色谱图，流动相为甲醇-0.1%磷酸系统。
图5是罗汉茶样品2的高效液相色谱图，流动相为乙腈-水系统。
图6是罗汉茶样品2的高效液相色谱图，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液系统。
图7是罗汉茶样品2的高效液相色谱图，流动相为乙腈-0.1%甲酸系统。
具体实施方式
为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。
实施例
一、待检测样品的来源：共收集到罗汉茶样品9批，详细信息见表2；并通过自购的方式收集到罗汉茶的易混淆品青钱柳样品3批，样品状态均是药材。完成样品收集后，将所有12份样品分别进行粉碎处理，并过二号筛，备用。
Figure 63494DEST_PATH_IMAGE002
备注：罗汉茶样品2为广西壮族自治区食品药品检验所中药室人员野外采集所得，经证实为罗汉茶，实验过程中以该样品作为罗汉茶的对照药材与其他样品进行对比。在罗汉茶样品收集过程中，本申请人发现青钱柳（拉丁文名：Cyclocarya paliurus.）与罗汉茶在使用过程中为易混淆品种，为了对比该两者之间化学成分是否有较大区别，亦收集了3批青钱柳样品同时进行实验。
二、罗汉茶的定性分析
1、罗汉茶的薄层色谱鉴别方法，具体操作步骤如下
（1）取罗汉茶样品或青钱柳样品粉末0.5g，加甲醇10mL，超声处理30min，滤过，取滤液置于小孔树脂凝胶柱中，收集流出液作为供试品溶液。
（2）取罗汉茶对照药材（罗汉茶样品2）0.5g，加甲醇10mL，超声处理30min，滤过，取滤液置于小孔树脂凝胶柱（内径1cm，柱高3cm）中，收集流出液作为对照药材溶液。
（3）取槲皮苷加甲醇制成浓度为0.1mg/mL的槲皮苷溶液；取落新妇苷加甲醇制成浓度为1mg/mL的落新妇苷溶液；再取黄杞苷加甲醇制成浓度为0.2mg/mL的黄杞苷溶液，作为对照品溶液。
（4）吸取上述供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各3μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上成条带状，以体积比为5:4:0.8:0.4的甲酸乙酯-丙酮-水-冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝试液，用热风吹干，置365nm紫外灯下检视。得到的薄层色谱图见图1，从图1可以看出，罗汉茶样品1-9的色谱中，在与对照品和罗汉茶对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点；斑点圆整清晰且各成分分离效果好，比移值适中，重现性好。青钱柳样品1-3的色谱中，在与对照品和罗汉茶对照药材色谱相应的位置上不显示荧光斑点。
2、罗汉茶的薄层色谱鉴别方法的专属性试验，具体步骤如下：
（1）取罗汉茶样品粉末0.5g，加甲醇10mL，超声处理30min，滤过，取滤液置于小孔树脂凝胶柱中，收集流出液作为供试品溶液。
（2）取罗汉茶对照药材（罗汉茶样品2）0.5g，加甲醇10mL，超声处理30min，滤过，取滤液置于小孔树脂凝胶柱（内径1cm，柱高3cm）中，收集流出液作为对照药材溶液。
（3）取槲皮苷、落新妇苷、黄杞苷对照品，加甲醇制成每毫升含0.1mg槲皮苷、1mg落新妇苷、0.2mg黄杞苷的混合溶液，作为混合对照品溶液。
（4）取甲醇作为阴性对照溶液。
（5）吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、阴性对照溶液和混合对照品溶液各3μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上成条带状，以体积比为5:4:0.8:0.4的甲酸乙酯-丙酮-水-冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝试液，用热风吹干，置365nm紫外灯下检视。得到的薄层色谱图见图2，从图2可以看出，在罗汉茶样品的色谱中，在与罗汉茶对照药材（罗汉茶样品2）和混合对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点；斑点圆整清晰且各成分分离效果好，比移值适中，重现性好。而在以甲醇进行点样的位置无斑点，说明本发明的薄层色谱鉴别方法阴性无干扰，专属性好。
另外，本申请人还对罗汉茶的薄层色谱鉴别方法进行了耐用性实验考察：①用不同厂家生产的薄层硅胶G板进行考察；②对不同展开温度：4℃、30℃进行考察；③对不同相对湿度32%、70%进行考察；结果表明本发明的薄层色谱鉴别方法耐用性良好。
本申请人还对罗汉茶对照药材溶液（罗汉茶样品2）和罗汉茶样品4供试品溶液的点样量进行考察，从少到多设置1、2、3、5、10μL 5个点样量，得到的薄层色谱图见图3。结果显示，当点样量为3μL时，对照药材（罗汉茶样品2）色谱与罗汉茶样品4色谱均能得到清晰的斑点，分离效果良好，故拟定点样量为3μL。
二、罗汉茶的定量分析
新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷等均为罗汉茶的活性成分，为提高罗汉茶质量控制水平，本发明采用一测多评方法，以落新妇苷对照品为参照，对收集到的罗汉茶样品（1-9）中新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷等6种成分进行含量测定，并进行方法学验证，测定方法考察及验证过程结果如下：
（一）仪器、试剂
Agilent 1260高效液相色谱仪；Agilent 1100高效液相色谱仪；waters 2690高效液相色谱仪；Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国戴安公司）；DAD紫外检测器；Milli-Q纯水处理器；超声清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；Agilent 5 TC-C18(2)（250×4.6mm）色谱柱；phenomenex SuperLu C18 （250×4.6mm）色谱柱；CAPCELL MGⅢ（250×4.6mm）色谱柱；CP224S电子分析天平（德国赛多利斯公司），XS205电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。
落新妇苷对照品（中检院供，含量测定用，批号：111798-201504，含量为93.9%）、黄杞苷对照品（中检院供，含量测定用，批号：111906-201102，含量为93.7%）、槲皮苷对照品（中检院供，含量测定用，批号：111538-201606，含量为90.6%）、新落新妇苷对照品（成都普菲德生物技术有限公司供，含量测定用，批号：DST191209-077，含量为98%）、异落新妇苷对照品（成都普菲德生物技术有限公司供，含量测定用，批号：DST190922-216，含量为98%）、新异落新妇苷对照品（成都普菲德生物技术有限公司供，含量测定用，批号：DST191025-078，含量为97%）、乙腈为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯。
（二）以落新妇苷对照品为参照，以其相应的峰为S峰，设定新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷5种成分的Rsi及fsi，具体内容如下：
（1）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%甲酸为流动相，在乙腈:0.1%甲酸=19:81的条件下进行等梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm和291nm，通过变换波长的方式进行测定。
（2）已知各成分浓度的混合对照品溶液Ⅰ的制备：取新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含3.628μg新落新妇苷、435.696μg落新妇苷、0.995μg新异落新妇苷、26.068μg异落新妇苷、52.729μg槲皮苷、9.998μg黄杞苷的溶液，即得。
（3）已知各成分浓度的混合对照品溶液Ⅱ的制备：取新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每毫升含20.733μg新落新妇苷、1212.249μg落新妇苷、7.962μg新异落新妇苷、83.417μg异落新妇苷、146.772μg槲皮苷、154.605μg黄杞苷的溶液，即得。
（4）测定：精密吸取以上已知各成分浓度的混合对照品溶液（Ⅰ、Ⅱ）10μL，注入液相色谱仪，测定。
（5）以落新妇苷对照品为参照，以其相应的峰为S峰，计算新落新妇苷(1)、新异落新妇苷（3）、异落新妇苷（4）、槲皮苷（5）、黄杞苷（6）与落新妇苷（2）间的fsi（f21、f23、f24、f25、f26）和Rsi（R21、R23、R24、R25、R26）。
为了保证校正系数的稳定可靠，本申请人根据以上检测条件和步骤对可能引起校正系数波动的影响因素：标准曲线、不同型号的仪器、不同色谱柱、不同柱温、不同体积流量、不同的检测波长进行考察。
1．标准曲线的影响
取混合对照品溶液Ⅰ2、5、10、15、20、30μL，混合对照品溶液Ⅱ2、3、5、10、15μL分别注入液相色谱仪，按以上拟定的色谱条件进行测定分析，分别计算各质量浓度水平下新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷的Rsi及fsi，结果见表3。
Figure 656149DEST_PATH_IMAGE003
2．不同品牌液相色谱仪的影响
采用不同品牌的液相色谱仪，取混合对照品溶液Ⅰ10μL进样分析，计算新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷的fsi和Rsi。分别考察了4种品牌的高效液相色谱仪（1. 安捷伦（Agilent）1100；2. 安捷伦（Agilent）1260；3. Waters 2690；4、戴安（Ultimate）3000），结果如下表4和表5。
Figure 347025DEST_PATH_IMAGE004
Figure 290710DEST_PATH_IMAGE005
3．不同色谱柱的影响
采用不同品牌的色谱柱，取混合对照品溶液Ⅰ10μL进样分析，计算新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷的fsi和Rsi。分别考察了三种不同品牌的气相色谱柱（1. Agilent 5 TC-C18(2)色谱柱（250×4.6mm）；2.phenomenex SuperLu C18色谱柱（250×4.6mm）；3.CAPCELL MGⅢ色谱柱（250×4.6mm）），结果如下表6和表7。
Figure 725233DEST_PATH_IMAGE006
Figure 844499DEST_PATH_IMAGE007
4．不同柱温的影响
采用phenomenex SuperLu C18色谱柱（250×4.6mm），取混合对照品溶液Ⅰ10μL进样分析，计算新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷的fsi和Rsi。分别考察了30、35、40℃3种不同的柱温，结果如下表8和表9。
Figure 565330DEST_PATH_IMAGE008
Figure 871678DEST_PATH_IMAGE009
5．不同流速的影响
采用phenomenex SuperLu C18色谱柱（250×4.6mm），柱温30℃，取混合对照品溶液Ⅰ10μL进样分析，计算新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷的fsi和Rsi。分别考察了0.8、1.0、1.2mL/min 3种不同流速，结果发现改变流速时新落新妇苷、异落新妇苷和槲皮苷的fsi的RSD大于5%，表明改变流速对新落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷的校正因子影响较大，结果见表10和表11。
Figure 968947DEST_PATH_IMAGE010
Figure 677140DEST_PATH_IMAGE011
6．不同检测波长的影响
采用phenomenex SuperLu C18色谱柱（250×4.6mm），柱温30℃，取混合对照品溶液Ⅰ10μL进样分析，计算各成分的fsi和Rsi。分别考察了254nm和291nm、252nm和289nm、256nm和293nm 3组不同的检测波长，结果见表12和表13。
Figure 568873DEST_PATH_IMAGE012
Figure 96937DEST_PATH_IMAGE013
由于流速对各成分的相对校正因子影响较大（RSD大于5%），故将流速因素剔除，取其余各项影响因素的平均fsi的平均值作为最终的相对校正因子值；虽然不同的色谱系统条件对Rsi均有影响，但影响都不大（RSD小于5%），因此，直接取各项影响因素的平均Rsi的平均值作为最终的相对保留时间值。最终确定的fsi值和Rsi值结果见表1。
Figure 997897DEST_PATH_IMAGE014
（三）根据以上计算得到的Rsi和fsi，采用一测多评法同时测定罗汉茶中新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷6种成分的含量，具体内容如下：
（1）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%甲酸为流动相，在乙腈:0.1%甲酸=19:81的条件下进行等梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm和291nm，通过变换波长的方式进行测定。
（2）对照品溶液的制备：取落新妇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为50μg/mL的落新妇苷溶液，即得。
（3）供试品溶液的制备：取待测罗汉茶样品粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，在功率360W、频率45KHz的超声条件下超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
（4）测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定。
（5）根据测得的落新妇苷含量，依据设定的fsi计算新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷5种成分的含量。
为了验证本发明以落新妇苷对照品为参照，通过一测多评方法测定罗汉茶中新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷6种成分含量的可行性，本申请人采用对照品法和一测多评法对收集到的9种罗汉茶样品按照本发明的高效液相色谱检测条件进行测定，结果见表14。结果表明，两种测定方法结果的相对偏差小于5%，本发明中设定的的fsi和Rsi是合理的，本发明采用一测多评方法测定罗汉茶中新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷6种成分含量是可行的。其中，按照对照品法测定时，取对照品加甲醇制成每毫升含21.64μg新落新妇苷、51.83μg落新妇苷、19.90μg新异落新妇苷、20.84μg异落新妇苷、52.73μg槲皮苷、20.00μg黄杞苷的混合溶液，作为对照品溶液进行测定。
Figure 91755DEST_PATH_IMAGE015
为了验证本发明的高效液相色谱检测的准确性和可行性，本申请还分别对色谱条件和操作条件进行了考察（均用罗汉茶样品2作为供试品），具体如下：
（一）色谱条件的考察
1．检测波长的考察：采取二极管阵列检测器检测，提取各成分波谱图，发现新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、黄杞苷在291nm下有最大吸收波长；槲皮苷在254nm下有最大吸收波长。在254nm和291nm下各组分色谱峰面积、高度适中，分离度好，所以确定通过变换检测波长的方式在检测波长为254nm时检测槲皮苷，在检测波长为291nm时检测新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、黄杞苷，实现同时测定罗汉茶中6种成分。
2．流动相组成的考察：分别考察了（1）甲醇-0.1%磷酸系统，（2）乙腈-水系统，（3）乙腈-0.1%磷酸溶液系统，（4）乙腈-0.1%甲酸系统；结果以乙腈-0.1%甲酸溶液系统为含量测定的流动相系统可使各组分峰形及分离度较好且出峰时间较适中，见图4-7。
（二）操作条件考察（按拟定的色谱条件进样分析，进样量为10μL）
1．稳定性试验：对同一供试品溶液，每隔4小时测定一次，共测定6次，结果6次测定的新落新妇苷峰面积、落新妇苷峰面积、新异落新妇苷峰面积、异落新妇苷峰面积、槲皮苷峰面积、黄杞苷峰面积的RSD符合要求，见表15。试验表明，供试品溶液在24小时内稳定。
Figure 295334DEST_PATH_IMAGE016
2．精密度试验：对同一供试品溶液，连续测定6次，结果6次测定的新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷峰面积的RSD符合要求，见表16。试验表明，高效液相色谱仪的精密度较好。
Figure 435329DEST_PATH_IMAGE017
3．重复性试验
分别取同一罗汉茶样品共6份，每份0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，在功率360W、频率45KHz的超声条件下超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得6份供试品溶液，分别对该6份供试品溶液进行测定并按外标法计算新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷的含量，结果6份供试品溶液的新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷含量的RSD均符合要求，见表17。试验表明，本发明的高效液相色谱检测方法重复性较好。
Figure 15346DEST_PATH_IMAGE018
4．准确度（加样回收率）试验
取已知新落新妇苷含量(1.1285mg/g)、落新妇苷含量(56.4082mg/g)、新异落新妇苷含量(0.3224mg/g)、异落新妇苷含量(4.8008mg/g)、槲皮苷含量（6.2481mg/g）、黄杞苷含量（2.5968 mg/g）的罗汉茶样品适量，平行称取6份，每份约0.125g，精密称定，置具塞锥形瓶中，各精密加入加样回收混合对照品溶液（新落新妇苷5.929μg/mL、落新妇苷240.994μg/mL、新异落新妇苷1.217μg/mL、异落新妇苷20.683μg/mL、槲皮苷31.869μg/mL、黄杞苷10.822μg/mL）25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率360W，频率45kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得加样供试品溶液。按拟定的高效液相色谱条件测定，计算加样回收率，结果新落新妇苷平均回收率为97.34%，RSD=2.81%（n=6）；落新妇苷平均回收率为94.93%，RSD=2.10%（n=6）；新异落新妇苷平均回收率为96.97%，RSD=1.79%（n=6）；异落新妇苷平均回收率为96.95%，RSD=2.51%（n=6）；槲皮苷平均回收率为97.21%，RSD=2.83%（n=6）；黄杞苷平均回收率为97.60%，RSD=2.01%（n=6）；均符合定量分析的要求，见表18。试验表明，本发明的高效液相色谱检测方法回收率较好。
Figure 557185DEST_PATH_IMAGE019
5．线性关系考察
分别精密吸取以上混合对照品溶液Ⅰ2、5、10、15μL，混合对照品溶液Ⅱ10、15μL，注入液相色谱仪，按拟定的色谱条件进行测定。以对照品进样量为横坐标（x），峰面积积分值为纵坐标（y）绘制标准曲线，回归方程见表19。
结果表明，新落新妇苷在进样量为0.007～0.311μg范围内时，落新妇苷在进样量为0.871～18.184μg范围内时，新异落新妇苷在进样量为0.002～0.119μg范围内时，异落新妇苷在进样量为0.052～1.251μg范围内时，槲皮苷在进样量为0.105～2.202μg范围内时，黄杞苷在进样量为0.020～2.319μg范围内时，进样量与峰面积呈良好线性关系，结果见表19。
Figure 931666DEST_PATH_IMAGE020
6．专属性试验
取甲醇10μL注入液相色谱仪，按拟定的色谱条件进行测定，结果在291nm和254nm检测波长下，在与新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷相应的保留时间无吸收峰，表明阴性无干扰，本发明的高效液相色谱检测方法专属性好。
经过以上稳定性试验、精密度试验、重复性试验、准确度试验、线性关系考察、专属性试验，结果表明本发明的高效液相色谱检测的色谱条件和操作条件符合要求，表明本发明的高效液相色谱检测方法灵敏、精密度高、重现性好、结果准确，可作为罗汉茶内在质量的控制方法，以保证罗汉茶的用药安全。

Claims (6)

1.一种罗汉茶的质量检测方法，其特征在于，所述质量检测方法包括罗汉茶的薄层色谱鉴别和罗汉茶的高效液相色谱检测；
所述罗汉茶的薄层色谱鉴别是以槲皮苷、落新妇苷、黄杞苷为对照品，对供试品、对照药材、对照品分别用甲醇进行提取后在同一聚酰胺薄膜上成条带状点样，经展开和显色后得到薄层色谱图，实现对罗汉茶的定性分析；
所述罗汉茶的高效液相色谱检测是以落新妇苷对照品为参照，以其相应的峰为S峰，设定新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷的相对保留时间及相对校正因子，采用一测多评法同时测定罗汉茶中新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷6种成分的含量，从而实现对罗汉茶的定量分析。
2.根据权利要求1所述罗汉茶的质量检测方法，其特征在于，所述罗汉茶的薄层色谱鉴别方法，具体步骤如下：
（1）取待测罗汉茶样品粉末0.5g，加甲醇10mL，超声处理30min，滤过，取滤液置于小孔树脂凝胶柱中，收集流出液作为供试品溶液；
（2）取对照药材0.5g，加甲醇10mL，超声处理30min，滤过，取滤液置于小孔树脂凝胶柱中，收集流出液作为对照药材溶液；
（3）取槲皮苷、落新妇苷、黄杞苷对照品，加甲醇制成每毫升含0.1mg槲皮苷、1mg落新妇苷、0.2mg黄杞苷的混合溶液，作为混合对照品溶液；
（4）吸取上述供试品溶液、对照药材溶液和混合对照品溶液各3μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上成条带状，以体积比为5:4:0.8:0.4的甲酸乙酯-丙酮-水-冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝试液，用热风吹干，置365nm紫外灯下检视。
3.根据权利要求1所述罗汉茶的质量检测方法，其特征在于，所述罗汉茶的薄层色谱鉴别方法，具体步骤如下：
（1）取待测罗汉茶样品粉末0.5g，加甲醇10mL，超声处理30min，滤过，取滤液置于小孔树脂凝胶柱中，收集流出液作为供试品溶液；
（2）取对照药材0.5g，加甲醇10mL，超声处理30min，滤过，取滤液置于小孔树脂凝胶柱中，收集流出液作为对照药材溶液；
（3）取槲皮苷加甲醇制成浓度为0.1mg/mL的槲皮苷溶液；取落新妇苷加甲醇制成浓度为1mg/mL的落新妇苷溶液；再取黄杞苷加甲醇制成浓度为0.2mg/mL的黄杞苷溶液，作为对照品溶液；
（4）吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、3种对照品溶液各3μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上成条带状，以体积比为5:4:0.8:0.4的甲酸乙酯-丙酮-水-冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝试液，用热风吹干，置365nm紫外灯下检视。
4.根据权利要求1所述罗汉茶的质量检测方法，其特征在于，所述罗汉茶的高效液相色谱检测，具体内容如下：
（1）以落新妇苷对照品为参照，以其相应的峰为S峰，确定新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷5种成分的相对保留时间及相对校正因子；
（2）色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%甲酸为流动相，在乙腈:0.1%甲酸=19:81的条件下进行等梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm和291nm，通过变换波长的方式进行测定；
（3）对照品溶液的制备：取落新妇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度为50μg/mL的落新妇苷溶液，即得；
（4）供试品溶液的制备：取待测罗汉茶样品粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，在功率360W、频率45KHz的超声条件下超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
（5）测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定；
（6）根据测得的落新妇苷含量，依据相对校正因子计算新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷5种成分的含量。
5.根据权利要求1或4所述罗汉茶的质量检测方法，其特征在于，所述新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷5种成分的相对保留时间分别为0.9100、1.1954、1.2815、1.4583、1.6346。
6.根据权利要求1或4所述罗汉茶的质量检测方法，其特征在于，所述新落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、槲皮苷、黄杞苷5种成分的相对校正因子分别为1.2526、1.1983 、0.9586、0.8071、1.1381。
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