CN115266982B - 一种全面控制落花生枝叶质量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种全面控制落花生枝叶质量的检测方法，通过超高效液相色谱法建立特征图谱，以菊苣酸和原儿茶酸为对照峰，结合了指标含量检测和薄层检测，通过优化的检测方法，对落花生枝叶的药材、饮片、制剂中间体及配方颗粒进行较为全面地质量监测。操作简单，重现性好，准确可靠，节约时间，为落花生枝叶的内在质量控制提供了一种新的分析手段。

Description

一种全面控制落花生枝叶质量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药制剂的检测方法，尤其涉及一种全面控制落花生枝叶质量的检测方法。

背景技术

落花生枝叶，通称落花生茎叶，为豆科植物落花生Arachis hypogaea Linnaeus的干燥地上部分。其味甘，性平；归肝、心经；具散瘀消肿，解毒，止汗之功效；可用于治疗跌打损伤，各种疮毒，盗汗等症。现代研究表明，落花生枝叶主要含有萜类、酚酸类、甾醇类、戊烯醇类等化合物，具有镇静催眠、扩张脑动脉血管、抗菌、抗氧化、抗自由基、抗肿瘤等作用，且对心肌收缩力和学习记忆能力有影响。

到目前为止，关于落花生枝叶的研究主要包括如下方面：

指纹图谱方面，CN103837627A公开了一种落花生茎叶药材的指纹图谱建立方法。该专利指纹图谱共建立了7个共有峰，对整体定性具有一定参考意义。但该指纹图谱对产品物质基准的明确性方面不够深入，所建指纹图谱中指认出的已知成分较少，仅峰1指认为原儿茶酸，其它成分信息不明确，不利于产品质量的准确判断。该分析方法采用HPLC，分析周期长、检测成本高，部分共有峰峰面积小，分离度差、基线不平稳，无法准确快速、高效的控制产品质量。

含量测定方面，鉏晓艳分别采用60Coγ-射线不同剂量辐照落花生茎叶提取生物碱、采用气相色谱-质谱联用，分析挥发性成分并测定了挥发油中芳樟醇的含量，但作为质量评价体系，该方法分析成本较高，对操作人员技术要求更高，目前国内药厂和饮片厂无法广泛适用；王国华采用HPLC法检测落花生枝叶中花生脯呤含量，但该对照品为实验室自制，不宜作为标准含量检测指标。

综上所述，以上作为研究尚可，作为标准的评价方法适用性欠佳。

除此之外，湖南省中药材标准(2009年版)中的薄层鉴别方法，采用石油醚(60～90℃)为提取溶剂，使用对照药材进行指认，展现薄层斑点信息为小极性成分。而中药配方颗粒是以水为溶媒，提取物均为中等极性及大极性成分，故此方法并不适用于落花生枝叶配方颗粒及其水提取制剂的质量评价。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为落花生的质量控制提供一种简单、快捷、全面的检测方法。

技术方案：本发明所述的全面控制落花生枝叶质量的检测方法，包含以下步骤：

(1)取菊苣酸和原儿茶酸对照品制备得到对照品溶液；取落花生枝叶对照药材制备得到对照药材溶液；

(2)取供试品制备得到供试品溶液；

(3)用超高效液相色谱仪分别检测供试品溶液、对照品溶液和对照药材溶液，得到相应的图谱；

(4)分析比较对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液的特征图谱，选择供试品溶液的特征图谱中与对照药材溶液的特征色谱中保留时间相对应的8个特征峰作为共有特征峰，构建落花生枝叶的超高效液相特征图谱；其中特征峰1应与原儿茶酸对照品的特征峰保留时间相对应，特征峰8应与菊苣酸对照品的特征峰保留时间相对应。

进一步地，所述步骤S3进样检测时色谱条件为：十八烷基键合硅胶色谱柱，流动相A：乙腈、流动相B：0.05-0.3％磷酸溶液，按以下的洗脱梯度进行洗脱：

检测波长：220nm；流速：0.2～0.4ml/min；柱温：20～50℃；供试品溶液和参照物溶液的进样量为0.5～2μl。

进一步地，步骤S3中，进样检测时最优的色谱条件为：ZORBAX Eclipse PlusC18RRHD，2.1×100mm，1.8μm，流动相A：乙腈、流动相B：0.1％磷酸溶液，检测波长：220nm；流速：0.35ml/min；柱温：35℃。

进一步地，步骤(4)中所述落花生枝叶的超高效液相特征图谱，以原儿茶酸对照品的特征峰为S1峰，计算特征峰2、特征峰3、特征峰4与S1峰的相对保留时间，峰2：1.53±10％、峰3：1.56±10％、峰4：1.69±10％；以菊苣酸对照品的特征为S2峰，计算特征峰5、特征峰6、特征峰7与S2峰的相对保留时间，峰5：0.66±10％、峰6：0.83±10％、峰7：0.88±10％。

进一步地，所述供试品溶液的制备过程为：取供试品样品研细，精密称定0.2～1.0g，置具塞锥形瓶中，加入水或10～100％甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，超声/加热/震荡15min～60min后，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

进一步地，所述对照品溶液的浓度为菊苣酸20μg/ml，原儿茶酸50μg/ml，使用溶剂为70％甲醇；所述对照药材溶液以10～100％甲醇为溶剂，25ml/g对照药材用量溶解，提取方式为超声/加热/震荡，提取时间为30分钟。

进一步地，还包括：(5)将待测的供试品溶液进行步骤(3)的进样检测，以菊苣酸的含量作为含量指标成分，对落花生枝叶进行质量评价。

进一步地，在超高效液相色谱法检测后再进行薄层检测，所述薄层检测具体步骤包括：

(1)薄层供试品溶液的制备：取落花生枝叶配方颗粒0.1～2g，研细，加10％～100％的乙醇或10％～100％的甲醇10～20ml，超声处理15～45分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水或10％～100％甲醇0.5～2ml使溶解，作为供试品溶液；

(2)薄层对照溶液的制备：取落花生枝叶对照药材0.1～3g，加水20～100ml，煎煮10～60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水或10％～100％甲醇10～50ml，超声处理15～45分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5～2ml溶解，作为对照药材溶液；取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；

(3)测定：分别吸取上述三种溶液各0.5～4μl，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。

进一步地，所述薄层检测的步骤为：

(1)薄层供试品溶液的制备：取落花生枝叶配方颗粒0.2g，研细，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

(2)薄层对照溶液的制备：取落花生枝叶对照药材2g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为对照药材溶液；取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；

(3)测定：分别吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各2μl，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸2∶1∶1∶0.1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。

进一步地，所述供试品为落花生枝叶药材、饮片、制剂中间体或配方颗粒。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：

(1)本发明采用超高液相色谱法，共确定8个共有特征峰，并指认了原儿茶酸和菊苣酸，构建的特征图谱可以较为全面的反映落花生枝叶的特征。

(2)本发明的检测方法，指定菊苣酸作为含量指标，将特征图谱和含量指标检测相结合，能够更加准确的控制落花生枝叶的内在质量。

(3)本发明采用超高效液相色谱仪(UPLC)建立特征图谱，分析周期短、共有峰分离度好、基线平稳、检测成本低、回收率可靠，可用于落花生枝叶的药材、饮片、制剂中间体或配方颗粒的质量检测和评价，适用性更为广泛。

(4)本发明的检测方法还结合了薄层检测法，使用阿魏酸对照品作为参照，填补了落花生枝叶配方颗粒质量标准的空白。

附图说明

图1为落花生枝叶配方颗粒的对照特征图谱；

图2为不同提取溶剂考察的UPLC图-特征图谱；

图3为不同提取方式考察的UPLC图-特征图谱；

图4为不同提取时间考察的UPLC图-特征图谱；

图5为不同提取体积考察的UPLC图-特征图谱；

图6为落花生枝叶配方颗粒特征图谱不同检测波长下的UPLC色图；

图7为落花生枝叶配方颗粒特征图谱专属性试验；

图8为落花生枝叶配方颗粒特征图谱整体性试验；

图9为落花生枝叶配方颗粒特征图谱色谱柱考察；

图10为落花生枝叶配方颗粒特征图谱柱温考察；

图11为落花生枝叶配方颗粒特征图谱流速考察；

图12为落花生枝叶多批次药材特征图谱叠加图；

图13为落花生枝叶多批次标准汤剂特征图谱叠加图；

图14为落花生枝叶多批次颗粒特征图谱叠加图；

图15为落花生枝叶多批次中间体特征图谱叠加图；

图16为菊苣酸含量测定时落花生枝叶颗粒不同提取溶剂的UPLC图谱；

图17为菊苣酸含量测定时落花生枝叶颗粒不同提取方式的UPLC图谱；

图18为菊苣酸含量测定时落花生枝叶颗粒不同提取时间的UPLC图谱；

图19为菊苣酸含量测定时落花生枝叶颗粒不同提取体积的UPLC图谱；

图20为菊苣酸全波长扫描图；

图21为菊苣酸对照品的线性关系图；

图22为落花生枝叶配方颗粒菊苣酸含量测定专属性试验；

图23为落花生枝叶配方颗粒菊苣酸含量测定整体性试验；

图24为菊苣酸含量测定时不同流速考察；

图25为菊苣酸含量测定时不同柱温的考察；

图26为菊苣酸含量测定时不同色谱柱的考察；

图27为落花生枝叶配方颗粒的展开剂确定TLC图谱；其中1：方法一供试品溶液，2：方法二供试品溶液，3：方法三供试品溶液，S1：方法一对照药材溶液，S2：方法二对照药材溶液，T：阿魏酸对照品溶液；

图28为落花生枝叶配方颗粒供试品考察的TLC图谱；其中1：方法一供试品溶液，2：方法二供试品溶液，3：方法三供试品溶液，S：方法一对照药材溶液，T：阿魏酸对照品溶液；

图29为落花生枝叶配方颗粒对照药材溶液考察的TLC图谱；其中1：方法一供试品溶液，S1：方法一对照药材溶液，S2：方法二对照药材溶液，T：阿魏酸对照品溶液；

图30为落花生枝叶配方颗粒不同点样量的TLC图谱；其中供试品溶液：1(1ul)、2(2μl)、3(4μl)、4(8μl)；对照药材溶液：S1(1μl)、S2(2μl)、S3(4μl)、S4(8μl)；T：阿魏酸对照品溶液；

图31为落花生枝叶配方颗粒专属性的TLC图谱；其中1～3：供试品溶液，4：阴性对照溶液，S：对照药材溶液，T：阿魏酸对照品溶液；

图32落花生枝叶配方颗粒不同温度考察的TLC图谱；其中1～3供试品溶液，S：对照药材溶液，T：阿魏酸对照品溶液；

图33落花生枝叶配方颗粒不同湿度的TLC图谱；其中1～3供试品溶液，S：对照药材溶液，T：阿魏酸对照品溶液；

图34落花生枝叶配方颗粒的TLC图谱；其中1～3供试品溶液，S：对照药材溶液，T：阿魏酸对照品溶液。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1落花生枝叶配方颗粒特征图谱方法的建立

1.对照品溶液的制备

取落花生枝叶对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加70％甲醇25ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，滤过，取续滤液，作为落花生枝叶药材对照物溶液。

取菊苣酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含菊苣酸20μg的溶液，即得菊苣酸对照品溶液。

取原儿茶酸对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含原儿茶酸50μg的溶液，即得原儿茶酸对照品溶液。

2.供试品溶液的制备

取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.进样检测

图谱条件：ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD(2.1×100mm，1.8μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.35ml；柱温为35℃；检测波长为220nm。理论板数按菊苣酸峰计算应不低于5000。

表1梯度洗脱条件

分别精密吸取各对照品溶液及供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪。

4.图谱分析

得到有8个特征峰的供试品色谱图和落花生枝叶药材对照物色谱图，且两个色谱图中的8个特征峰应相互对应，其中峰1和峰8的保留时间分别与原儿茶酸对照品、菊苣酸对照品峰保留时间相一致。以峰1原儿茶酸(S1)为参照峰，计算峰2-4与S1的相对保留时间规定值如下：1.53(峰2)、1.56(峰3)、1.69(峰4)。以峰8菊苣酸(S2)为参照峰，计算峰5-7与S2的相对保留时间规定值如下：0.66(峰5)、0.83(峰6)、0.88(峰7)。且以上相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。对照特征图谱如图1所示。

实施例2方法学考察

1.提取溶剂的考察

供试品溶液的制备，取同一批号样品，平行5组，分别采用水、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇作为提取溶剂，其他相关方法同实施例1。对照品溶液的制备及检测色谱条件相关方法同实施例1。分别精密吸取各供试液1μl，注入超高效液相色谱仪，计算特征峰峰面积/称样量，结果见表2、图2。

表2不同提取浴剂的提取效率比较(峰面积/称样量)

结论：当采用100％甲醇为提取溶剂时，色谱峰数目较少。采用其他提取溶剂(70％甲醇、50％甲醇、30％甲醇、水)提取时，色谱峰数目一致，且峰形均较好。进一步对比了除甲醇外其他不同提取溶剂的提取效率，各提取溶剂提取效率相当，为与含量测定提取溶剂一致，因此确定提取溶剂为70％甲醇。

2.提取方式的考察

供试品溶液的制备，取同一批号样品，平行3组，分别采用超声处理(功率250W，频率40kHz)、振摇提取、加热回流作为提取方式，其他相关方法同实施例1。对照品溶液的制备及检测色谱条件相关方法同实施例1。分别精密吸取各供试液1μl，注入超高效液相色谱仪，计算特征峰峰面积/称样量，结果见表3、图3。

表3不同提取方式的提取效率比较(峰面积/称样量)

结论：三种提取方式色谱峰数目一致，且峰形均较好。进一步对比了不同提取方式的提取效率，除振摇提取外，其余提取方式的提取效率差别不大，考虑到操作的方便，因此确定提取方法为超声提取。

3.提取时间的考察

供试品溶液的制备，取同一批号样品，平行4组，分别采用15分钟、30分钟、45分钟和60分钟作为超声处理(功率250W，频率40kHz)提取时间，其他相关方法同实施例1。对照品溶液的制备及检测色谱条件相关方法同实施例1。分别精密吸取各供试液1μl，注入超高效液相色谱仪，计算特征峰峰面积/称样量，结果见表4、图4。

表4不同提取时间的提取效率比较(峰面积/称样量)

结论：不同提取时间色谱峰数目一致，且峰形均较好。进一步对比了不同提取时间的提取效率，超声处理15分钟提取时已较为充分，因此为确保提取效果，确定提取时间为30分钟。

4.提取体积的考察

供试品溶液的制备，取同一批号样品，平行3组，分别采用15ml、25ml、50ml作为70％甲醇的提取体积，其他相关方法同实施例1。对照品溶液的制备及检测色谱条件相关方法同实施例1。分别精密吸取各供试液1μl，注入超高效液相色谱仪，计算特征峰峰面积/称样量，结果见表5、图5。

表5不同提取体积的提取效率比较

结论：三种提取体积色谱峰数目一致，且峰形均较好。进一步对比了不同提取体积的提取效率，提取体积为25ml和50ml时，提取效率差别不大，从节省溶剂和提取充分的角度综合考虑，因此确定提取体积为25ml。

5.检测波长的考察

取同一批号样品按照实施例1方法制得供试品溶液，其他色谱条件同实施例1，分别在220nm，254nm和300nm波长条件下记录图谱，结果见图6。

结论：在220nm波长下色谱峰数目较多，响应适中，基线也较平稳，因此选用220nm作为特征图谱检测波长。

6.专属性考察

取同一批号样品按照实施例1方法制得供试品溶液、缺落花生枝叶的阴性溶液、对照药材溶液，按实施例1色谱条件注入超高效液相色谱仪，结果见图7。

结论：阴性溶液在与供试品溶液色谱图中各特征峰的保留时间处没有色谱峰，说明溶剂对落花生枝叶配方颗粒的测定无干扰，以本法测定落花生枝叶配方颗粒特征图谱具有专属性。

7.整体性考察

取同一批号样品按照实施例1方法制得供试品溶液，在实施例1的色谱条件上延长洗脱时间。考察在既定的色谱条件系统下，是否会残留杂质峰对后续样品造成影响，结果见图8。

结论：延长洗脱时间，无杂质峰，表明该色谱条件基本满足了信息量最大的原则，对后续样品的分析亦无影响。

8.精密度考察

取同一批号样品按照实施例1方法制得供试品溶液，连续进样6次，按实施例1色谱条件注入超高效液相色谱仪，记录其特征峰保留时间，按照实施例1方法计算相对保留时间，结果见表6、表7。

表6精密度实验结果(相对保留时间)

表7精密度实验结果(相对峰面积)

结论：各特征峰的相对保留时间RSD均小于1％，相对峰面积RSD均小于3％，精密度良好。

9.中间精密度考察

取同一批号样品按照实施例1方法制得供试品溶液，由两个实验员A、B分别按实施例1色谱条件处理3份供试品溶液，记录其特征峰保留时间，按照实施例1方法计算相对保留时间，结果表8。

表8中间精密度考察(相对保留时间)

结论：样品的特征峰相对保留时间的RSD小于1％，中间精密度试验良好。

10.稳定性考察

取同一批号样品按照实施例1方法制得供试品溶液，在实施例1色谱条件下分别于0、2、4、6、8、12、18、24小时进样，记录其特征峰保留时间，按照实施例1方法计算相对保留时间，结果见表9、表10。

表9稳定性考察(相对保留时间)

表10稳定性实验结果(相对峰面积)

结论：各特征峰的相对保留时间RSD均小于1％，相对峰面积RSD均小于3％，供试液在24小时内稳定性良好。

11.重复性考察

取同一批号样品，平行6组，按照实施例1方法制得供试品溶液，其他色谱条件同实施例1，分别进样，记录其特征峰保留时间，按照实施例1方法计算相对保留时间，结果见表11、表12。

表11重复性试验(相对保留时间)

表12重复性试验(相对峰面积)

结论：方法的重复性试验良好。

12耐用性考察

12.1色谱柱考察

取同一批号样品按照实施例1方法制得供试品溶液，分别采用ZORBAX EclipsePlus C18RRHD(2.1×100mm，1.8μm)，ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm，1.8μm)，ThermoSyncronis C18(2.1×100mm，1.7μm)3种色谱柱，其他色谱条件同实施例1，记录相应色谱图。结果见表13、图9。

表13色谱柱考察(相对保留时间)

结论：不同色谱柱对各特征峰的相对保留时间影响较大，但基本上在规定值的范围内。因此，建议落花生枝叶配方颗粒特征图谱检测推荐使用色谱柱为ZORBAX EclipsePlus C18RRHD(2.1×100mm，1.8μm)。

12.2柱温考察

取同一批号样品按照实施例1方法制得供试品溶液，分别采用30℃、35℃、40℃作为色谱柱柱温，其他色谱条件同实施例1，记录其特征峰保留时间，按照实施例1方法计算其相对保留时间，结果见表14、图10。

表14柱温考察(相对保留时间)

结论：柱温在30℃～35℃区间对样品的测定结果均符合正文规定的保留时间要求，耐用性良好。

12.3流速考察

取同一批号样品按照实施例1方法制得供试品溶液，分别采用每分钟0.30ml、0.35ml、0.40ml作为流速，其他色谱条件同实施例1，记录其特征峰保留时间，按照实施例1方法计算其相对保留时间，结果见表15、图11。

表15流速考察(相对保留时间)

结论：流速在0.30ml/min～0.40ml/min区间对样品的测定结果均符合正文规定的保留时间要求，耐用性良好。

13样品测定

取3批落花生枝叶配方颗粒样品、中间体、15批落花生枝叶药材、标准汤剂，按照实施例1相关方法操作，测定结果见表16、表17、表18、表19、图12、图13、图14、图15。

表1615批落花生枝叶药材样品测定结果(相对保留时间)

表1715批落花生枝叶标准汤剂样品测定结果(相对保留时间)

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表18落花生枝叶颗粒测定结果(相对保留时间)

表19落花生枝叶中间体测定结果(相对保留时间)

实施例3菊苣酸含量检测

1.对照品来源及纯度检查

菊苣酸购于中国食品药品检定研究院，编号为111752-201703，供含量测定用，含量以97.6％计，使用前无须处理。

2.供试品溶液的制备

取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.进样检测

色谱条件：ZORBAX Eclipse Plus C18RRHD(2.1×100mm，1.8μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.35ml；柱温为35℃；检测波长为328nm。理论板数按菊苣酸峰计算应不低于5000。

分别精密吸取各对照品溶液及供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪。

4.质量分析

计算菊苣酸含量，对供试品进行质量分析。

实施例4菊苣酸含量检测的方法学考察

1.提取溶剂的考察

供试品溶液的制备，取同一批号样品，平行5组，每组平行2份，分别采用水、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇作为提取溶剂，其他相关方法同实施例3。对照品溶液的制备及检测色谱条件相关方法同实施例3。分别精密吸取各供试液1μl，注入超高效液相色谱仪，计算菊苣酸含量，结果见表20、图16。

表20不同提取溶剂的比较

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结论：选择不同浓度甲醇作为提取溶剂，除甲醇外，落花生枝叶配方颗粒中菊苣酸含量无明显变化，从充分提取的角度考虑，确定提取溶剂为70％甲醇。

2.提取方式的考察

供试品溶液的制备，取同一批号样品，平行3组，每组平行2份，分别采用超声处理(功率250W，频率40kHz)、振摇提取、加热回流作为提取方式，其他相关方法同实施例3。对照品溶液的制备及检测色谱条件相关方法同实施例3。分别精密吸取各供试液1μl，注入超高效液相色谱仪，计算菊苣酸含量，结果见表21、图17。

表21不同提取方法的比较

结论：超声处理、振摇提取、加热回流提取效率相当，考虑到操作的方便性，因此确定提取方法为超声提取。

3.提取时间的考察

供试品溶液的制备，取同一批号样品，平行4组，每组平行2份，分别采用15分钟、30分钟、45分钟和60分钟作为超声处理(功率250W，频率40kHz)提取时间，其他相关方法同实施例3。对照品溶液的制备及检测色谱条件相关方法同实施例3。分别精密吸取各供试液1μl，注入超高效液相色谱仪，计算菊苣酸含量，结果见表22、图18。

表22不同提取时间的比较

结论：不同的提取时间对于菊苣酸的含量无明显影响，从提取完全和节省时间的角度考虑，因此确定提取时间为30分钟。

4.提取体积的考察

供试品溶液的制备，取同一批号样品，平行3组，每组平行2份，分别采用15ml、25ml、50ml作为70％甲醇的提取体积，其他相关方法同实施例3。对照品溶液的制备及检测色谱条件相关方法同实施例3。分别精密吸取各供试液1μl，注入超高效液相色谱仪，计算菊苣酸含量，结果见表23、图19。

表23不同提取体积的比较

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结论：不同提取体积的提取效率相当，从充分提取与节省溶剂的角度综合考虑，确定提取体积为25ml。

5.检测波长的考察

对菊苣酸对照品溶液进行全波长扫描，记录其紫外吸收图，结果见图20。

结论：菊苣酸在328nm左右波长处有较大吸收，因此选择328nm作为菊苣酸含量测定的检测波长。

6.线性

分别精密吸取菊苣酸对照品溶液(浓度32.16896μg/mL)0.1μl、0.2μl、0.4μl、0.8μl、1.0μl、2.0μl注入超高效液相色谱仪，按实施例3色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，求得菊苣酸回归方程，结果见表24、表25、图21。

表24回归方程

表25菊苣酸对照品进样量与峰面积关系

结论：菊苣酸进样量在0.0032μg～0.0643μg范围内，进样量与峰面积值呈良好的线性关系。

7精密度试验

7.1仪器精密度试验

取同一批号样品按照实施例3方法制得供试品溶液，连续进样6次，按实施例3色谱条件注入超高效液相色谱仪，记录其特征峰保留时间，计算相对标准偏差，结果表26。

表26仪器精密度试验

/>

结论：仪器精密度试验良好(RSD％≤1.0％)。

7.2重复性试验

取同一批号样品，平行6组，按照实施例3方法制得供试品溶液，其他色谱条件同实施例3，分别进样，测定菊苣酸的峰面积，计算其含量及RSD，结果表27。

表27样品的重复性试验结果

结论：重复性试验良好(RSD％≤2.0％)。

7.3中间精密度试验

取同一批号样品按照实施例3方法制得供试品溶液，由两个实验员A、B分别按实施例3色谱条件处理3份供试品溶液，分别在Thermo-UPLC、Agilent-UPLC上进样1μl，测定菊苣酸峰面积值并计算其含量及RSD，结果表28。

表28中间精密度试验

结论：中间精密度良好。

8.准确度试验

取三组已知含量的样品(菊苣酸含量0.77mg/g)适量，研细，取约0.25g，平行3份，精密称定，分别加入0.25g样品所含各成分的50％、100％、150％的对照品。照实施例3方法制得加样回收供试品溶液，按实施例3色谱条件，分别进样1μl，以下列公式计算回收率，平均回收率，RSD，结果见表29。

表29菊苣酸准确度结果

结论：菊苣酸回收率在98.23％～106.87％之间，准确度试验结果良好。

9.专属性考察

落花生枝叶配方颗粒中所添加的辅料为麦芽糊精和二氧化硅及硬脂酸镁。本次实验考察缺落花生枝叶的阴性样品对落花生枝叶配方颗粒含量测定的影响。

取同一批号样品按照实施例3方法制得供试品溶液、缺落花生枝叶的阴性溶液、对照品溶液，按实施例3色谱条件注入超高效液相色谱仪，结果见图22。

结论：阴性色谱图中在与对照品相应的保留时间处没有色谱峰，说明辅料及溶剂对菊苣酸的测定无干扰，以本法测定落花生枝叶配方颗粒中菊苣酸的含量具有专属性。

10.整体性考察

取同一批号样品按照实施例3方法制得供试品溶液，在实施例3的色谱条件上，保持有机相比例最高时的洗脱梯度，洗脱时间延长一倍，考察在既定的色谱条件系统下，是否会残留杂质峰对后续样品造成影响，结果见图23。

结论：延长洗脱时间一倍，无杂质峰，表明该色谱条件基本满足了信息量最大的原则，对后续样品的分析亦无影响。

11.耐用性考察

11.1稳定性考察

取同一批号样品按照实施例3方法制得供试品溶液，在实施例3色谱条件下分别于0、2、4、6、8、12、18、24小时进样，测定峰面积值，计算其RSD，结果见表30。

表30稳定性试验测定结果

结论：样品供试液在24小时内稳定性良好。

11.2流速考察

取同一批号样品按照实施例3方法制得供试品溶液，分别采用每分钟0.30ml、0.35ml、0.40ml作为流速，其他色谱条件同实施例3，计算菊苣酸含量结果，结果见表31、图24。

表31不同流速考察

结论：三种流速下，菊苣酸色谱峰的分离度均较好，含量相近，耐用性较好。

11.3柱温考察

取同一批号样品按照实施例3方法制得供试品溶液，分别采用30℃、35℃、40℃作为色谱柱柱温，其他色谱条件同实施例3，计算菊苣酸含量结果，结果见表32、图25。

表32不同柱温的考察

结论：三种柱温下，菊苣酸色谱峰的分离度均较好，含量相近，耐用性较好。

11.4色谱柱考察

取同一批号样品按照实施例3方法制得供试品溶液，分别采用ZORBAX EclipsePlus C18 RRHD(2.1×100mm，1.8μm)，ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm，1.8μm)，ThermoSyncronis C18(2.1×100mm，1.7μm)3种色谱柱，其他色谱条件同实施例3，计算菊苣酸含量结果，结果见表33、图26。

表33不同色谱柱的比较

结论：除Syncronis C18色谱柱菊苣酸分离度不佳外，EP C18、HSS T3色谱柱对菊苣酸的分离效果均较好，本实验选择ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD(2.1×100mm，1.8μm)进行后续研究。

12.样品测定

取3批落花生枝叶配方颗粒样品、中间体、15批落花生枝叶药材、标准汤剂，按照实施例3相关方法操作，测定样品中菊苣酸的含量，测定结果见表34、表35、表36、表37。

表34落花生枝叶配方颗粒中菊苣酸的含量测定

表35落花生枝叶中间体中菊苣酸的含量测定

表36落花生枝叶药材中菊苣酸的含量测定

表37落花生枝叶标准汤剂中菊苣酸的含量测定

实施例5落花生枝叶薄层鉴别测定方法的构建

1.供试品溶液的制备

方法一：取本品0.2g，研细，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

方法二：取本品0.2g，研细，加乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

方法三：取本品0.2g，研细，加水10ml溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次10ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

2.对照溶液的制备

2.1对照药材溶液的制备

方法一：取落花生枝叶对照药材2g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为对照药材溶液。

方法二：取落花生枝叶对照药材2g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为对照药材溶液。

2.2对照品溶液的制备

取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为阿魏酸对照品溶液。

2.3阴性对照溶液的制备

取缺落花生枝叶配方颗粒的阴性样品0.2g，同供试品溶液制备方法中的“方法一”制成阴性对照溶液。

3.分析方法的确定

3.1展开剂的确定

吸取上述3种供试品溶液、2种对照药材溶液和阿魏酸对照品溶液各2μl，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(2∶1∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。结果见图27。

结论：供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液均有斑点，且供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。所以确定薄层条件为；在硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(2∶1∶1∶0.1)为展开剂。

3.2供试品溶液制备方法的考察

吸取上述3种供试品溶液、方法一制备的对照药材溶液和阿魏酸对照品溶液各2μl，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(2∶1∶1∶0.1)为展开剂，展开，取山，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。结果见图28。

结论：方法一和方法二制备的供试品溶液色谱斑点清晰丰富，分离效果好，且供试品色谱与对照药材色谱和对照品色谱斑点相对应，最终确定方法一作为落花生枝叶配方颗粒薄层鉴别的样品制备方法。

3.3对照药材溶液制备方法的考察

吸取方法一制备的供试品溶液、2种对照药材溶液和阿魏酸对照品溶液各2μl，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(2∶1∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。结果见图29。

结论：采用方法一制备的对照药材溶液色谱斑点清晰丰富，分离效果较好，且供试品色谱与对照药材色谱和对照品色谱斑点相对应，所以选择方法一作为落花生枝叶配方颗粒薄层鉴别的对照药材溶液制备方法。

3.4点样量的考察

吸取方法一制备的供试品溶液、方法一制备的对照药材溶液和阿魏酸对照品溶液，供试品溶液和对照药材溶液分别点样1μl、2μl、4μl和8μl，点样于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(2∶1∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。结果见图30。

结论：当供试品溶液、对照药材溶液点样量为2μl时，落花生枝叶配方颗粒色谱与对照药材色谱和对照品色谱在相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，无其他干扰，因此选择供试品、对照药材点样量为2μl。

4.确定落花生枝叶配方颗粒薄层鉴别方法的最佳方案为：

取落花生枝叶配方颗粒0.2g，研细，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。取落花生枝叶对照药材2g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为对照药材溶液。再取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，分别吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各2μl，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(2∶1∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

5.方法学验证

5.1专属性试验

吸取“4”项下的供试品溶液3份、对照药材溶液、阿魏酸对照品溶液和“2.3”项下的阴性对照溶液各2μl，在同一硅胶G薄层板上分别点样，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(2∶1∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。结果见图31。

结论：供试品溶液色谱在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰。说明该薄层方法专属性好。

5.2耐用性试验

5.2.1不同温度的考察

取“4”项下的供试品溶液3份、对照药材溶液和阿魏酸对照品溶液各2μl，，在同一硅胶G薄层板上分别点样，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(2∶1∶1∶0.1)为展开剂，分别在低温和常温条件下展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。结果见图32。

结论：低温和常温条件下供试品溶液分离效果都较好，且供试品溶液色谱在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，实验结果表明，温度对落花生枝叶配方颗粒薄层鉴别无显著影响，说明该薄层鉴别方法对不同温度的耐用性好。

5.2.2不同湿度的考察

取“4”项下的供试品溶液3份、对照药材溶液和阿魏酸对照品溶液各2μl，在同一硅胶G薄层板上分别点样，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(2∶1∶1∶0.1)为展开剂，分别在不同湿度展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。结果见图33。

结论：不同湿度条件下供试品溶液分离效果都较好，且供试品溶液色谱在与对照药材色谱色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，实验结果表明，湿度对落花生枝叶配方颗粒薄层鉴别无显著影响，说明该薄层鉴别方法对不同温度的耐用性好。

6.样品检测

取3份不同批次的落花生枝叶配方颗粒，按照“4”项下的相关方法制备供试品溶液。取“4”项下的对照药材溶液和阿魏酸对照品溶液。分别取2μl点样于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(2∶1∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。结果见图34。

结论：供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

Claims (6)

1.一种全面控制落花生枝叶质量的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：

（1）取菊苣酸和原儿茶酸对照品制备得到对照品溶液；取落花生枝叶对照药材制备得到对照药材溶液；

（2）取供试品制备得到供试品溶液：取供试品样品研细，精密称定0.2～1.0g，置具塞锥形瓶中，加入水或10～100%甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，超声或加热回流或震荡15min～60min后，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；所述供试品为落花生枝叶药材、饮片、制剂中间体或配方颗粒；

（3）用超高效液相色谱仪分别检测供试品溶液、对照品溶液和对照药材溶液，得到相应的图谱；

色谱条件为：十八烷基键合硅胶色谱柱，流动相A：乙腈、流动相B：0.05~0.3%磷酸溶液，按以下的洗脱梯度进行洗脱：

时间（分钟） 流动相A（%） 流动相B（%） 0～6 2→9 98→91 6～11 9→11 91→89 11～21 11→20 89→80 21～27 20 80 27～28 20→80 80→20

检测波长：220nm；流速：0.2～0.4ml/min；柱温：20～50℃；供试品溶液和参照物溶液的进样量为0.5~2µl;

（4）分析比较对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液的特征图谱，选择供试品溶液的特征图谱中与对照药材溶液的特征色谱中保留时间相对应的8个特征峰作为共有特征峰，构建落花生枝叶的超高效液相特征图谱；其中特征峰1应与原儿茶酸对照品的特征峰保留时间相对应，特征峰8应与菊苣酸对照品的特征峰保留时间相对应。

2.根据权利要求1所述的全面控制落花生枝叶质量的检测方法，其特征在于：步骤（3）中，所述步骤（3）进样检测时色谱条件为：ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD，2.1×100mm，1.8μm，流动相A： 乙腈、流动相B：0.1％磷酸溶液；检测波长：220nm；流速：0.35ml/min；柱温：35℃，供试品溶液和参照物溶液的进样量为2µl。

3.根据权利要求1所述的全面控制落花生枝叶质量的检测方法，其特征在于：所述对照品溶液的浓度为菊苣酸20μg/ml，原儿茶酸50μg/ml,使用溶剂为70%甲醇；所述对照药材溶液以10～100%甲醇为溶剂，25ml/g对照药材用量溶解，提取方式为超声或加热回流或震荡，提取时间为30分钟。

4.根据权利要求1所述的全面控制落花生枝叶质量的检测方法，其特征在于，还包括：（5）将待测的供试品溶液进行步骤（3）的进样检测，以菊苣酸的含量作为含量指标成分，对落花生枝叶进行质量评价。

5.根据权利要求1所述的全面控制落花生枝叶质量的检测方法，其特征在于，在超高效液相色谱法检测后再进行薄层检测，所述薄层检测具体步骤包括：

（1）薄层供试品溶液的制备：取落花生枝叶0.1~2g，研细，加10%~100%的乙醇或10%~100%的甲醇10~20ml，超声处理15~45分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水或10%~100%甲醇0.5~2ml使溶解，作为供试品溶液；

（2）薄层对照溶液的制备：取落花生枝叶对照药材0.1~3g，加水20~100ml，煎煮10~60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水或10%~100%甲醇10~50ml，超声处理15~45分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5~2ml溶解，作为对照药材溶液；取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；

（3）测定：分别吸取上述三种溶液各0.5~4μl，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。

6.根据权利要求5所述的全面控制落花生枝叶质量的检测方法，其特征在于，所述薄层检测的步骤为：

（1）薄层供试品溶液的制备：取落花生枝叶0.2g，研细，加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；

（2）薄层对照溶液的制备：取落花生枝叶对照药材2g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为对照药材溶液；取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；

（3）测定：分别吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各2μl，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸2：1：1：0.1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。