CN114965758B - 一种泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法及其用途 - Google Patents

一种泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药检测技术领域领域，具体涉及一种泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法及其用途。本发明提供的一种泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，能够对泽泻(东方泽泻)和泽泻(泽泻)进行检测，且构建的特征图谱中特征峰多，可以全面展示药效化学成分。

Description

一种泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法及其用途
技术领域
本发明涉及中药检测技术领域领域，具体涉及一种泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法及其用途。
背景技术
泽泻，中药名，为泽泻科植物东方泽泻Alisma orientale(Sam.)Juzep.或泽泻Alisma plantago-aquatica Linn.的干燥块茎。盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒为东方泽泻Alisma orientale(Sam.)Juzep.的干燥块茎经炮制并按照标准汤剂的主要质量指标加工制成的配方颗粒。盐泽泻(泽泻)配方颗粒为泽泻Alisma plantago-aquatica Linn.的干燥块茎经炮制并按照标准汤剂的主要质量指标加工制成的配方颗粒。
目前，现行的中药配方颗粒质量标准仅是单独针对泽泻(东方泽泻)或单独针对泽泻(泽泻)检测，未能提供一种标准能够对泽泻(东方泽泻)和泽泻(泽泻)进行检测，且构建的特征图谱中特征峰少，无法全面展示药效化学成分。此外，也无法对不同基源的泽泻(东方泽泻)和泽泻(泽泻)的药物制剂进行区分，以及无法对泽泻生药和炮制品进行区分。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，能够对泽泻(东方泽泻)和泽泻(泽泻)进行检测，且构建的特征图谱中特征峰多，可以全面展示药效化学成分。
本发明要解决的另一个技术问题在于提供一种区分不同基源的泽泻或其药物制剂的方法，能够快速区分东方泽泻Alisma orientale(Sam.)Juzep.或泽泻Alismaplantago-aquatica Linn.基源的泽泻或其药物制剂。
本发明要解决的另一个技术问题在于提供一种区分泽泻生药和炮制品的方法，能够快速区分泽泻的炮制品。
一种泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，包括：
色谱条件与系统适应性，照高效液相色谱法测定，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.08％-0.12％v/v磷酸水溶液为流动相B，按如下梯度洗脱程序进行洗脱：0～4min，流动相A的体积比百分比为34％；4～18min，流动相A的体积比百分比为34％→48％；18～22min，流动相A的体积比百分比为48％；22～40min,流动相A的体积比百分比为48％→90％；流速为每分钟0.25-0.33ml；柱温20-30℃；检测波长为：0～22min为246nm，22min～40min为208nm；理论板数按23-乙酰泽泻醇B计算应不低于5000；
参照物溶液的制备：取泽泻对照药材制备对照药材参照物溶液；以23-乙酰泽泻醇B对照品，23-乙酰泽泻醇C对照品制备的对照品参照物溶液；
供试品溶液的制备：取供试品制备成供试品溶液；
测定法：精密吸取参照物溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图；
所述泽泻包括东方泽泻Alisma orientale(Sam.)Juzep或泽泻Alisma plantago-aquatica Linn；。
所述的泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，所述色谱柱选择WatersACQUITY BEH C18，规格为2.1×150mm，1.7μm，或Phenomenex Kinetex C18 100A，规格为2.1×150mm，1.7μm；
可选的，色谱柱选择Waters ACQUITY UPLC BEH C18，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm；
可选的，所述流动相B为0.08％v/v、0.1％v/v或0.12％v/v磷酸水溶液；
可选的，流动相B为0.1％v/v磷酸水溶液；
可选的，所述柱温为20、23、25、27或30℃；
可选的，所述柱温为25℃；
可选的，所述流速为0.25ml/min 0.27ml/min、0.30ml/min、0.33ml/min；
可选的，所述流速为0.30ml/min。
所述的泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，
所述对照药材参照物溶液的制备方法：取所述对照药材，先经过水提取，过滤，将得到的滤液蒸干，然后加入醇溶剂或醇溶液提取，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；
可选的，所述对照药材参照物溶液的制备方法：取对照药材3g，置具塞锥形瓶中，加水100ml，加热回流45分钟，滤过，滤液蒸干，放冷，加入70％v/v甲醇25ml，超声处理45分钟，功率250W，频率35kHz，放冷，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；
可选的，所述对照品参照物溶液的制备方法：取23-乙酰泽泻醇B对照品，乙酰泽泻醇C对照品，加70％v/v甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液。
所述的泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，供试品溶液的制备方法：取供试品，加入醇溶剂或醇溶液进行提取，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
可选的，醇溶剂或醇溶液选自甲醇、乙醇、30％v/v甲醇溶液、50％v/v甲醇溶液、70％v/v甲醇溶液或85％v/v甲醇溶液；
可选的，取供试品0.2-1.0重量份，置具塞锥形瓶中，加入醇溶剂或醇溶液25体积份，密塞，超声处理30分钟，功率250W，频率35kHz，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
可选的，取供试品0.7重量份，置具塞锥形瓶中，加入醇70％v/v甲醇溶液25体积份，密塞，超声处理30分钟，功率250W，频率35kHz，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
所述重量份和体积份的比例关系为g/ml；
可选的，所述测定法中，精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1-10微升；
可选的，所述测定法中，精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5微升。
所述的泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，所述泽泻或其药物制剂包括泽泻药材、泽泻饮片、盐泽泻饮片、泽泻饮片标准汤剂、盐泽泻饮片标准汤剂、泽泻配方颗粒或盐泽泻配方颗粒。
采用所述的泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法构建的特征图谱进行质量检测的方法，供试品的特征图谱中包括11个特征峰，峰1为16-氧代泽泻醇A，峰4为泽泻醇C，峰5为11-脱羟基-16-氧代泽泻醇A，7为23-乙酰泽泻醇C，峰8为泽泻醇A，峰9为泽泻醇A-24-醋酸酯，峰10为泽泻醇B，峰11为23-乙酰泽泻醇B；以峰7为S1峰，峰1～6与S1峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为峰1：0.37、峰2：0.43、峰3：0.56、峰4：0.65、峰5：0.76、峰6：0.93；以峰11为S2峰，峰8～10与S2峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为峰8：0.67、峰9：0.81、峰10：0.90；
所述供试品包括泽泻药材、泽泻饮片、盐泽泻饮片、泽泻饮片标准汤剂、盐泽泻饮片标准汤剂、泽泻配方颗粒或盐泽泻配方颗粒；
泽泻包括东方泽泻Alisma orientale(Sam.)Juzep或泽泻Alisma plantago-aquatica Linn。
一种区分不同基源的泽泻或其药物制剂的方法，利用所述的泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，获得供试品的特征特征图谱；
当峰1与S1峰的相对峰面积≤0.6时，供试品的基源为东方泽泻Alisma orientale(Sam.)Juzep；
当峰1与S1峰的相对峰面积＞0.6时，供试品的基源为泽泻Alisma plantago-aquatica Linn。
一种区分泽泻生药和炮制品的方法，利用所述的盐泽泻配方颗粒的特征图谱的构建方法，获得供试品的特征特征图谱；
当S1峰面积/(峰4峰面积+峰10峰面积)＜4.6，供试品为泽泻生药；
当S1峰面积/(峰4峰面积+峰10峰面积)≥4.6，供试品为盐泽泻炮制品；
泽泻包括东方泽泻Alisma orientale(Sam.)Juzep或泽泻Alisma plantago-aquatica Linn。
在本发明中东方泽泻Alisma orientale(Sam.)Juzep.基源的药材、饮片、饮片标准汤剂、配方颗粒、炮制品简写为泽泻(东方泽泻)的药材、饮片、饮片标准汤剂、配方颗粒、炮制品。
泽泻Alisma plantago-aquatica Linn.的基源的药材、饮片、饮片标准汤剂、配方颗粒、炮制品简写为泽泻(泽泻)的药材、饮片、饮片标准汤剂、配方颗粒、炮制品。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的一种泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，能够对泽泻(东方泽泻)和泽泻(泽泻)进行检测，且构建的特征图谱中特征峰多，可以全面展示药效化学成分。
2.本发明提供的一种区分不同基源的泽泻或其药物制剂的方法，能够快速区分东方泽泻Alisma orientale(Sam.)Juzep.或泽泻Alisma plantago-aquatica Linn.基源的泽泻或其药物制剂。
3.本发明提供一种区分泽泻生药和炮制品的方法，能够快速区分泽泻的炮制品。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中的对照特征色谱图；
图2是本发明实施例1中的泽泻(东方泽泻)对照药材的特征图谱；
图3是本发明实施例1中15批盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)的特征图谱；
图4是本发明实施例1中3批盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒特征图谱；
图5是本发明实施例1中通过HPLC进行对照品定位的色谱图；图中，S1：盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂色谱图；S2：16-氧代泽泻醇A；S3：23-乙酰泽泻醇C；S4：泽泻醇A；S5：泽泻醇B；S6：23-乙酰泽泻醇B；
图6是本发明实施例2中泽泻(东方泽泻)药材与泽泻(泽泻)药材对照特征图谱；其中，S1(11)：泽泻(东方泽泻)药材对照特征图谱；S2(11)：泽泻(泽泻)药材对照特征图谱；
图7是本发明实施例2中盐泽泻(东方泽泻)饮片与盐泽泻(泽泻)饮片对照特征图谱；其中，S1(11)：盐泽泻(东方泽泻)饮片对照特征图谱；S2(11)：盐泽泻(泽泻)饮片对照特征图谱；
图8是本发明实施例2中泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂与泽泻(泽泻)饮片标准汤剂对照特征图谱；其中，S1(11)：泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂对照特征图谱；S2(11)：泽泻(泽泻)饮片标准汤剂对照特征图谱；
图9是本发明实施例2中盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂与盐泽泻(泽泻)饮片标准汤剂对照特征图谱；其中，S1(11)：盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂对照特征图谱；S2(11)：盐泽泻(泽泻)饮片标准汤剂对照特征图谱；
图10是本发明实施例3中泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)与盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)对照特征图谱；其中，S1(11)：泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂对照特征图谱；S2(11)：盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂对照特征图谱；
图11是本发明实施例4中色谱条件中流速为0.25ml/min的色谱图；
图12是本发明实施例5中色谱条件中柱温为20℃的色谱图；
图13是本发明实施例6中色谱条件中柱温为30℃的色谱图；
图14是本发明实施例7中提取溶剂为甲醇的色谱图；
图15是本发明实施例7中提取溶剂为乙醇的色谱图；
图16是本发明实施例7中提取溶剂为30％甲醇的色谱图；
图17是本发明实施例7中提取溶剂为50％甲醇的色谱图；
图18是本发明实施例7中提取溶剂为85％甲醇的色谱图；
图19是本发明对比例1中提取溶剂为乙腈的色谱图；
图20是本发明实施例8中取样量为0.2g的色谱图；
图21是本发明实施例8中取样量为0.5g的色谱图；
图22是本发明实施例8中取样量为1g的色谱图；
图23是本发明实施例9中进样量为1μL的色谱图；
图24是本发明实施例9中进样量为3μL的色谱图；
图25是本发明实施例9中进样量为7μL的色谱图；
图26是本发明实施例9中进样量为10μL的色谱图；
图27是本发明实验例1中1精密度试验中色谱图；
图28是本发明实验例1中2方法重复性试验中色谱图；
图29是本发明实验例1中3中间精密度(不同操作人员)试验中色谱图；
图30是本发明实验例1中4专属性试验中阴性颗粒溶液的色谱图；
图31是本发明实验例1中4专属性试验中盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒供试品色谱图；
图32是本发明实验例1中5稳定性考察试验中色谱图；
图33是本发明实验例1中6.1不同流速考察试验中流速为0.27ml/min条件下色谱图；
图34是本发明实验例1中6.1不同流速考察试验中流速为0.30ml/min条件下色谱图；
图35是本发明实验例1中6.1不同流速考察试验中流速为0.33ml/min条件下色谱图；
图36是本发明实验例1中6.2不同柱温考察试验中柱温为23℃条件下色谱图；
图37是本发明实验例1中6.2不同柱温考察试验中柱温为25℃条件下色谱图；
图38是本发明实验例1中6.2不同柱温考察试验中柱温为27℃条件下色谱图；
图39是本发明实验例1中6.3不同流动相的考察试验中磷酸浓度为0.08％条件下色谱图；
图40是本发明实验例1中6.3不同流动相的考察试验中磷酸浓度为0.10％条件下色谱图；
图41是本发明实验例1中6.3不同流动相的考察试验中磷酸浓度为0.12％条件下色谱图；
图42是本发明实验例2中不同色谱柱的考察试验中色谱柱Waters ACQUITY BEHC18条件下色谱图；
图43是本发明实验例2中不同色谱柱的考察试验中色谱柱phenomenex KinetexC18条件下色谱图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例或实验例中涉及的仪器与试药如下：
仪器设备：
色谱仪：Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS色谱系统，包括四元溶剂管理器(ACQ-QSM)、自动进样器(ACQ-FTN)、原装进口色谱柱温箱(ACQ-CM)、二极管阵列紫外检测器(ACQ-PDA)、Empower色谱管理系统；
电子天平：METTLER TOLEDO(瑞士梅特勒)ME36S、XS204、XSE205、XS205(十万分之一)
超声仪：昆山市超声波仪器有限公司KQ-500DE型数控超声波器色谱柱：
Waters ACQUITY BEH C18，2.1×150mm，1.7μm
试剂：
乙腈(赛默飞世尔科技有限公司，色谱纯)，水为纯化水，甲醇、磷酸等其它试剂均为分析纯。
试药：
23-乙酰泽泻醇B对照品(批号:111846-202006，购买于中国食品药品检定研究院，纯度98.3％)；
23-乙酰泽泻醇A对照品(批号:112062-202102，购买于中国食品药品检定研究院，纯度以99.2％)
16-氧代泽泻醇A对照品(批号:250254-202112，购买于上海鸿永生物科技有限公司，纯度98.0％)
泽泻醇A对照品(批号:CFS202002，购买于武汉天植生物技术有限公司，纯度98.0％)；
泽泻醇B对照品(批号:260010-202107，购买于上海鸿永生物科技有限公司，纯度98.0％)；
泽泻药材为市售产品；
下述实施例或实验例中涉及的原料制备方法如下：
泽泻饮片炮制方法：取原药材，除去杂质，稍浸，润透，切厚片，干燥。
盐泽泻饮片炮制方法：取泽泻片，照盐水炙法(中国药典通则0213)炒干。
泽泻饮片标准汤剂：取泽泻饮片100g，加水900ml，浸泡30分钟，武火煮沸后文火煎煮30分钟，滤过，水煎液待用，药渣加水700ml，武火煮沸后文火煎煮25分钟，滤过，合并滤液，减压浓缩，冷冻干燥，即得。
盐泽泻饮片标准汤剂：取盐泽泻饮片100g，加水900ml，浸泡30分钟，武火煮沸后文火煎煮30分钟，滤过，水煎液待用，药渣加水700ml，武火煮沸后文火煎煮25分钟，滤过，合并滤液，减压浓缩，冷冻干燥，即得。
泽泻配方颗粒：取泽泻，加热回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少10min，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.05-1.10，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的颗粒剂。
盐泽泻配方颗粒：取盐泽泻饮片，加热回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少10min，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.05-1.10，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的颗粒剂。
实施例1一种泽泻或其药物制剂的特征图谱的检测方法
本实施例提供了一种泽泻或其药物制剂的特征图谱的检测方法，包括如下步骤：
色谱条件与系统适应性，照高效液相色谱法测定，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Waters ACQUITY BEH C18，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm；以乙腈为流动相A，以0.1％(v/v)磷酸水溶液为流动相B，按如下表1的梯度洗脱程序进行洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温25℃；检测波长为：0～22min为246nm，22min～40min为208nm；理论板数理论板数按23-乙酰泽泻醇B计算应不低于5000；
表1
参照物溶液的制备：取泽泻(东方泽泻)或泽泻(泽泻)对照药材3g，置具塞锥形瓶中，加水100ml，加热回流45分钟，滤过，滤液蒸干，放冷，加入70％甲醇25ml，超声处理(功率250W，频率35kHz)45分钟，放冷，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取23-乙酰泽泻醇B对照品，23-乙酰泽泻醇C对照品，加70％甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取供试品适量，研细，取0.7g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率250W，频率35kHz)45分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图；
当供试品为泽泻(东方泽泻)或其药物制剂时，以泽泻(东方泽泻)对照药材制备对照药材参照物溶液；
当供试品为泽泻(泽泻)或其药物制剂时，以泽泻(泽泻)对照药材制备对照药材参照物溶液。
供试品的特征图谱中应包括11个特征峰，峰1为16-氧代泽泻醇A，峰4为泽泻醇C，峰5为11-脱羟基-16-氧代泽泻醇A，7为23-乙酰泽泻醇C，峰8为泽泻醇A，峰9为泽泻醇A-24-醋酸酯，峰10为泽泻醇B，峰11为23-乙酰泽泻醇B；以峰7为S1峰，峰1～6与S1峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为峰1：0.37、峰2：0.43、峰3：0.56、峰4：0.65、峰5：0.76、峰6：0.93；以峰11为S2峰，峰8～10与S2峰的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为峰8：0.67、峰9：0.81、峰10：0.90。
在本实施例中采用18批盐泽泻(东方泽泻)药物制剂生成特征图谱，对生成的特征图谱进行分析，采用药典委员会编制的指纹图谱相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，采用Mark峰拟合方式生成对照特征图谱；色谱匹配之后，得到11个响应值(峰面积)较合适、分离度较好、纯度较高的共有特征峰，按照色谱峰的顺序重新排列色谱峰序号为峰1～峰11，如图1所示。其中，该对照特征图谱的相对保留时间和相对峰面积如下表2和表3所示。
表2、盐泽泻(东方泽泻)药物制剂对照特征图谱相对保留时间
表2续、盐泽泻(东方泽泻)药物制剂对照特征图谱相对保留时间
表3、盐泽泻(东方泽泻)药物制剂对照特征图谱相对峰面积
表3续、盐泽泻(东方泽泻)药物制剂对照特征图谱相对峰面积
18批盐泽泻(东方泽泻)药物制剂的特征图谱如图3和图4所示，其相对保留时间和相对峰面积如下表4和表5所示，泽泻(东方泽泻)对照药材的特征图谱如图2所示，其相对保留时间和相对峰面积如下表6和表7所示。
表4、18批盐泽泻(东方泽泻)药物制剂特征图谱相对保留时间测定结果
表4续、18批盐泽泻(东方泽泻)药物制剂特征图谱相对保留时间测定结果
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表5、18批盐泽泻(东方泽泻)药物制剂特征图谱相对峰面积测定结果
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表5续、18批盐泽泻(东方泽泻)药物制剂特征图谱相对峰面积测定结果
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表6、泽泻(东方泽泻)对照药材特征图谱相对保留时间
表6续、泽泻(东方泽泻)对照药材特征图谱相对保留时间
表7、泽泻(东方泽泻)对照药材特征图谱相对峰面积
表7续、泽泻(东方泽泻)对照药材特征图谱相对峰面积
通过HPLC和LC/MS/MS对特征峰的识别和指认，确定峰1为16-氧代泽泻醇B；峰4为泽泻醇C；峰5为11-脱羟基-16-氧代泽泻醇A；峰7为23-乙酰泽泻醇C；峰8为泽泻醇A；峰9为泽泻醇A-24-醋酸酯；峰10为泽泻醇B；峰11为23-乙酰泽泻醇B。通过HPLC进行对照品定位的色谱图见图5。
由于对照品易得的色谱峰为23-乙酰泽泻醇C及23-乙酰泽泻醇B，在泽泻(东方泽泻)对照药材的特征图谱中，23-乙酰泽泻醇C及23-乙酰泽泻醇B响应适中，药典中泽泻药材含量测定的指标成分为23-乙酰泽泻醇C及23-乙酰泽泻醇B，同时也是盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂含量测定的含量指标成分，且方法中需要转换波长，因此将23-乙酰泽泻醇C及23-乙酰泽泻醇B作为该特征图谱的S峰。与乙酰泽泻醇C参照物峰相应的峰为S1峰，计算峰1～峰6与S1峰的相对保留时间。与23-乙酰泽泻醇B参照物峰相应的峰为S2峰，计算峰8～峰10的相对保留时间。
实施例2一种区分不同基源泽泻的方法
本实施例提供了一种区分不同基源泽泻的方法，包括如下步骤：
色谱条件与系统适应性，照高效液相色谱法测定，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Waters ACQUITY BEH C18，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm；以乙腈为流动相A，以0.1％(v/v)磷酸水溶液为流动相B，按如下表8的梯度洗脱程序进行洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温25℃；检测波长为：0～22min为246nm，22min～40min为208nm；理论板数理论板数按23-乙酰泽泻醇B计算应不低于5000。
表8
参照物溶液的制备：取泽泻(东方泽泻)对照药材3g，置具塞锥形瓶中，加水100ml，加热回流45分钟，滤过，滤液蒸干，放冷，加入70％甲醇25ml，超声处理(功率250W，频率35kHz)45分钟，放冷，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取23-乙酰泽泻醇B对照品，23-乙酰泽泻醇C对照品，加70％甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取供试品适量，研细，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率250W，频率35kHz)45分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，其中泽泻(东方泽泻)基源的供试品的峰1相对峰面积≤0.6，泽泻(泽泻)基源的供试品的峰1相对峰面积＞0.6。
在本实施例中，供试品选取6批泽泻(泽泻)药材，6批盐泽泻(泽泻)饮片，6批泽泻(泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)，6批盐泽泻(泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)，以及15批泽泻(东方泽泻)药材，15批盐泽泻(东方泽泻)饮片，15批盐泽泻(东方泽泻)标准汤剂(冻干粉)和3批盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒。上述供试品的特征图谱的相对保留时间和相对峰面积如下表9-21。15批盐泽泻(东方泽泻)标准汤剂(冻干粉)和3批盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒的特征图谱的相对保留时间和相对峰面积见实施例1，泽泻(东方泽泻)标准汤剂(冻干粉)见实施例3。
表9、15批泽泻(东方泽泻)药材特征图谱相对保留时间测定结果
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表9续、15批泽泻(东方泽泻)药材特征图谱相对保留时间测定结果
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表10、15批泽泻(东方泽泻)药材特征图谱相对峰面积测定结果
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表10续、15批泽泻(东方泽泻)药材特征图谱相对峰面积测定结果
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表11、15批盐泽泻(东方泽泻)饮片特征图谱相对保留时间测定结果
表11续、15批盐泽泻(东方泽泻)饮片特征图谱相对保留时间测定结果
表12、15批盐泽泻(东方泽泻)饮片特征图谱相对峰面积测定结果
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表12续、15批盐泽泻(东方泽泻)饮片特征图谱相对峰面积测定结果
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表13、6批泽泻(泽泻)药材特征图谱相对保留时间测定结果
表13续、6批泽泻(泽泻)药材特征图谱相对保留时间测定结果
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表14、6批泽泻(泽泻)药材特征图谱相对峰面积测定结果
表14续、6批泽泻(泽泻)药材特征图谱相对峰面积测定结果
表15、6批盐泽泻(泽泻)饮片特征图谱相对保留时间测定结果
表15续、6批盐泽泻(泽泻)饮片特征图谱相对保留时间测定结果
表16、6批盐泽泻(泽泻)饮片特征图谱相对峰面积测定结果
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表16续、6批盐泽泻(泽泻)饮片特征图谱相对峰面积测定结果
表17、6批泽泻(泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱相对保留时间测定结果
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表18、6批泽泻(泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱相对保留时间测定结果
表19、6批泽泻(泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱相对峰面积测定结果
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表19续、6批泽泻(泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱相对峰面积测定结果
表20、6批盐泽泻(泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱相对保留时间测定结果
表20续、6批盐泽泻(泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱相对保留时间测定结果
表21、6批盐泽泻(泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱相对峰面积测定结果
表21续、6批盐泽泻(泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱相对峰面积测定结果
将上述测定结果进行汇总，泽泻(东方泽泻)药材与泽泻(泽泻)药材对照特征图谱见图6，盐泽泻(东方泽泻)饮片与盐泽泻(泽泻)饮片对照特征图谱见图7，泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂与泽泻(泽泻)饮片标准汤剂对照特征图谱见图8，盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂与盐泽泻(泽泻)饮片标准汤剂对照特征图谱见图9，从上述对照特征图谱中可以看出，两种基源的供试品的峰1、峰4、峰8、峰10相对峰面积有明显区分。具体相对峰面积范围如下表22。通过对泽泻(东方泽泻)、泽泻(泽泻)2个基源供试品的峰1(16-氧代泽泻醇A)、峰4、峰8(泽泻醇A)、峰10(泽泻醇B)可发现两者具有明显差异，可通过峰面积的规定直接区分两者。但综合来看，峰1相对峰面积区分更加明显，故规定峰1相对峰面积用以区分两者基源。峰1相对峰面积以15批泽泻(东方泽泻)原料及15批盐泽泻(东方泽泻)的峰1相对峰面积最大值(0.467)上浮30％确定为不得大于0.61，取整为0.60，即泽泻(东方泽泻)基源的供试品的峰1相对峰面积为不得大于0.60。
表22、泽泻(东方泽泻)冻干粉及泽泻(泽泻)冻干粉特征图谱相对峰面积测定结果
实施例3泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)和盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)的区分
本实施例提供了一种区分泽泻(东方泽泻)生药和炮制产品的方法，包括如下步骤：
色谱条件与系统适应性，照高效液相色谱法测定，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Waters ACQUITY BEH C18，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm；以乙腈为流动相A，以0.1％(v/v)磷酸水溶液为流动相B，按如下表23的梯度洗脱程序进行洗脱；流速为每分钟0.3ml；柱温25℃；检测波长为：0～22min为246nm，22min～40min为208nm；理论板数按23-乙酰泽泻醇B计算应不低于5000；
表23
参照物溶液的制备：取泽泻(东方泽泻)对照药材3g，置具塞锥形瓶中，加水100ml，加热回流45分钟，滤过，滤液蒸干，放冷，加入70％甲醇25ml，超声处理(功率250W，频率35kHz)45分钟，放冷，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取23-乙酰泽泻醇B对照品，23-乙酰泽泻醇C对照品，加70％甲醇制成每1ml各含50μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取供试品适量，研细，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率250W，频率35kHz)45分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，其中，以S1峰/(峰4峰面积+峰10峰面积)为＜4.6，供试品为泽泻生药，以S1峰/(峰4峰面积+峰10峰面积)为≥4.6，供试品为盐泽泻炮制品。
在本实施例中，供试品选择盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)和泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)。盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)的特征图谱的相对保留时间和相对峰面积见实施例1。泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)的特征图谱的相对保留时间和相对峰面积见下表24-25。泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)与盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱见图10所示。根据结果可知，泽泻(东方泽泻)炮制成盐泽泻(东方泽泻)的过程中，峰4、峰10(泽泻醇B)下降明显。而峰4与峰10峰面积较小，以其计算与S1峰的相对峰面积，规定值较小。故，以分析S1峰/(峰4峰面积+峰10峰面积)的比值，S1峰/(峰4峰面积+峰10峰面积)为1.85-4.52，供试品为泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)，S1峰/(峰4峰面积+峰10峰面积)为5.46-8.81，供试品为盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)。规定盐泽泻(东方泽泻)S1峰/(峰4峰面积+峰10峰面积)不得低于4.6。以S1峰/(峰4峰面积+峰10峰面积)为＜4.6，为泽泻(东方泽泻)生药。
表24、15批泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱相对保留时间测定结果
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表24续、15批泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱相对保留时间测定结果
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表25、15批泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)相对峰面积测定结果
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表25续、15批泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)相对峰面积测定结果
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实施例4
本实施例与实施例1的区别在于，色谱条件中的流速为0.25ml/min，供试品为盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)；测定结果如图11所示，当流速为0.25ml/min，8分钟的峰与前面的小峰未完全分离开。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于，色谱条件中柱温为20℃，供试品为盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)；测定结果如图12所示，结果表明柱温对于各特征峰的分离无明显改变。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于，色谱条件中柱温为30℃，供试品为盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)；测定结果如图13所示，结果表明柱温对于各特征峰的分离无明显改变。
实施例7
本实施例与实施例1的区别在于，供试品溶液制备方法中，提取溶剂分别为甲醇、乙醇、30％甲醇、50％甲醇、85％甲醇；供试品为盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)；测定结果见下表26以及图14-18，表明甲醇、乙醇出现的色谱峰较少，峰型较差，30％甲醇提取时，峰缺少，50％甲醇、85％甲醇，峰信息以及分离度无显著差别。
表26、提取溶剂考察系统适应性参数
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对比例1
本实施例与实施例1的区别在于，供试品溶液制备方法中，提取溶剂为乙腈；供试品为盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)；测定结果见实施例7中表26以及图19，表明采用乙腈提取出现的色谱峰少，峰型较差。
实施例8
本实施例与实施例1的区别在于，供试品溶液制备方法中，供试品溶液制备方法中取样量分别为0.2、0.5、1g。供试品为盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)；测定结果如下表27以及图20-22，表明，取样量0.2g～1.0g，随着取样量增高，特征峰的总峰面积呈现相应比例上升，说明在该范围内，各特征成分能被完全提取。
表27、取样量考察系统适应性参数
实施例9
本实施例与实施例1的区别在于，测定法中，供试品溶液进样量分别为1、3、7、10μL；供试品为盐泽泻(东方泽泻)饮片标准汤剂(冻干粉)；测定结果如下表28以及图23-26所示，结果表明，不同进样量下，色谱峰的系统适用性无明显差别。
表28、进样量考察系统适应性参数
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实验例1方法学验证
1精密度试验
取同一份盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒供试品溶液(2009001Y)，按实施例1的方法实施，重复进样6次，测定各共有峰的相对保留时间及相对峰面积。各特征峰与参照物S峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值较小。测定结果如下表29-30以及图27，表明仪器精密度良好。
表29、仪器精密度相对保留时间试验结果
表29续、仪器精密度相对保留时间试验结果
表30、仪器精密度相对峰面积试验结果
表30续、仪器精密度相对峰面积试验结果
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2方法重复性试验
取同一份盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒供试品溶液(2009001Y)，按实施例1供试品溶液制备方法重复制备6份，并按照实施例1的方法实施，按照色谱条件测定各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。各特征峰与参照物S峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值较小。测定结果如下表31-32以及图28所示，结果表明重复性良好。
表31、重复性相对保留时间试验结果
表31续、重复性相对保留时间试验结果
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表32、重复性相对峰面积试验结果
表32续、重复性相对峰面积试验结果
3中间精密度(不同操作人员)
分别由两名检验员在不同的时间，取同一份盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒(2009001Y)，按实施例1的方法实施，且用同一台设备测定各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。各特征峰与参照物S峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值较小。结果如下表33-34以及图29所示，结果表明中间精密度良好。
表33、中间精密度相对保留时间试验结果
表33续、中间精密度相对保留时间试验结果
表34、中间精密度相对峰面积试验结果
表34续、中间精密度相对峰面积试验结果
4专属性
阴性颗粒溶液制备：取空白辅料1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率250W，频率35kHz)45分钟，摇匀，滤过，取续滤液，即得。将盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒(2009001Y)按照实施例1的方法制备成供试品溶液。将上述阴性颗粒溶液和供试品溶液分别采用实施例1的方法测定。测定结果如图30-31所示，结果表明阴性颗粒溶液对特征图谱无干扰，可以作为盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒特征图谱的检测方法。
5稳定性考察
取同一份盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒(2009001Y)，按实施例1的方法实施，色谱条件分别在0、3、9、12、18、24小时进样，测定各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。测定结果如下表35-36以及图32所示，结果表明各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD较小。表明供试品溶液在24小时内稳定，符合测定要求。
表35、稳定性相对保留时间试验结果
表35续、稳定性相对保留时间试验结果
表36、中间精密度相对峰面积试验结果
表36续、中间精密度相对峰面积试验结果
6耐用性试验
6.1不同流速的考察
取同一批盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒(2009001Y)，按实施例1的方法实施，设置流速分别为0.27ml/min、0.30ml/min、0.33ml/min，考察在流速发生变化时各特征峰的相对保留时间、相对峰面积，结果如下表37-38以及图33-35，当流速发生变化时会影响峰6的分离，因此，本方法建议固定流速(0.30ml/min)为最佳条件进行测定。
表37、不同流速测定结果的比较
表37续、不同流速测定结果的比较
表38、不同流速相对峰面积结果
表38续、不同流速相对峰面积结果
6.2不同柱温的考察
取同一批盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒(2009001Y)，按实施例1的方法实施，设置柱温分别为23℃、25℃、27℃，考察在柱温发生变化时各特征峰的相对保留时间、相对峰面积，结果如下表39-40以及图36-38所示，当柱温发生变化时会影响峰1的分离。因此，本方法建议固定柱温(25℃)为最佳条件进行测定
表39、不同柱温相对保留时间结果
表39续、不同柱温相对保留时间结果
表40、不同柱温相对峰面积结果
表40续、不同柱温相对峰面积结果
6.3不同流动相的考察
取同一批盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒(2009001Y)，按实施例1的方法实施，设置流动相B中磷酸浓度分别为0.08％、0.1％、0.12％，考察在磷酸发生变化时各特征峰的相对保留时间、相对峰面积，结果如下表41-42以及图39-41所示，当磷酸浓度发生变化时会影响峰1的分离。因此，本方法建议固定磷酸浓度(0.1％磷酸)为最佳条件进行测定。
表41、不同磷酸浓度相对保留时间结果
表41续、不同磷酸浓度相对保留时间结果
表42、不同磷酸浓度相对峰面积结果
表42续、不同磷酸浓度相对峰面积结果
6.4不同色谱柱的考察
取同一批盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒(2009001Y)，按实施例1的方法实施，设置色谱柱Waters ACQUITY BEH C18(2.1×150mm，1.7μm)、Phenomenex Kinetex C18 100A(2.1×150mm，1.7μm)色谱柱。结果如下表43-44以及图42-43所示，各色谱柱对盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒各色谱峰出峰时间有较大区别，对特征峰的分离有一定影响，本方法建议固定Waters ACQUITY BEH C18(2.1×150mm，1.7μm)色谱柱为最佳条件进行盐泽泻(东方泽泻)配方颗粒特征图谱的测定。
表43、不同色谱柱测定结果的比较
表43续、不同色谱柱测定结果的比较
表44、不同色谱柱相对峰面积结果
表44续、不同色谱柱相对峰面积结果
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，包括：
色谱条件为：照高效液相色谱法测定，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.08%-0.12%v/v磷酸水溶液为流动相B，按如下梯度洗脱程序进行洗脱：0～4min，流动相A的体积比百分比为34%；4～18min，流动相A的体积比百分比为34%→48%；18～22min，流动相A的体积比百分比为48%；22～40min, 流动相A的体积比百分比为48%→90%；流速为每分钟0.25-0.33ml；柱温20-30℃；检测波长为：0～22min为246nm，22min～40min为208nm；理论板数按23-乙酰泽泻醇B计算应不低于5000；色谱柱选择WatersACQUITY UPLC BEH C18，柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.7µm；
参照物溶液的制备：取泽泻对照药材制备对照药材参照物溶液，所述对照药材参照物溶液的制备方法：取对照药材3g，置具塞锥形瓶中，加水100ml，加热回流45分钟 ，滤过，滤液蒸干，放冷，加入70%v/v甲醇25ml，超声处理45分钟，功率250W，频率35kHz，放冷，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；以23-乙酰泽泻醇B对照品，23-乙酰泽泻醇C对照品制备的对照品参照物溶液，所述对照品参照物溶液的制备方法：取23-乙酰泽泻醇B对照品，乙酰泽泻醇C对照品，加70%v/v甲醇制成每1ml各含50µg的混合溶液；
供试品溶液的制备：取供试品，加入醇溶剂或醇溶液进行提取，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；醇溶剂或醇溶液选自甲醇、乙醇、30%v/v甲醇溶液、50%v/v甲醇溶液、70%v/v甲醇溶液或85%v/v甲醇溶液；
测定法：精密吸取参照物溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图；
所述泽泻包括东方泽泻Alisma orientale（Sam.）Juzep或泽泻Alisma plantago- aquatica Linn。
2.根据权利要求1所述的泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，
所述流动相B为0.08%v/v、0.1%v/v或0.12%v/v磷酸水溶液；和/或
所述柱温为20、23、25、27或30℃；和/或
所述流速为0.25 ml/min 0.27ml/min、0.30ml/min、0.33ml/min。
3.根据权利要求2所述的泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，
流动相B为0.1%v/v磷酸水溶液；和/或
所述柱温为25℃；和/或
所述流速为0.30 ml/min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，
取供试品0.2-1.0重量份，置具塞锥形瓶中，加入醇溶剂或醇溶液25体积份，密塞，超声处理30分钟，功率250W，频率35kHz，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所述重量份和体积份的比例关系为g/ml；和/或
所述测定法中，精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1-10微升。
5.根据权利要求4所述的泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，
取供试品0.7重量份，置具塞锥形瓶中，加入醇70%v/v甲醇溶液25体积份，密塞，超声处理30分钟，功率250W，频率35kHz，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；所述重量份和体积份的比例关系为g/ml；和/或
所述测定法中，精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5微升。
6.根据权利要求1-3任一项所述的泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，所述泽泻或其药物制剂包括泽泻药材、泽泻饮片、盐泽泻饮片、泽泻饮片标准汤剂、盐泽泻饮片标准汤剂、泽泻配方颗粒或盐泽泻配方颗粒。
7.采用权利要求1-6任一项所述的泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法构建的特征图谱进行质量检测的方法，其特征在于，供试品的特征图谱中包括11个特征峰，峰1为16-氧代泽泻醇A，峰4为泽泻醇C，峰5为11-脱羟基-16-氧代泽泻醇A，峰7为23-乙酰泽泻醇C，峰8为泽泻醇A，峰9为泽泻醇A-24-醋酸酯，峰10为泽泻醇B，峰11为23-乙酰泽泻醇B；以峰7为S1峰，峰1～6与S1峰的相对保留时间在规定值的±10%范围之内，规定值为峰1：0.37、峰2：0.43、峰3：0.56、峰4：0.65、峰5：0.76、峰6：0.93；以峰11为S2峰，峰8～10与S2峰的相对保留时间在规定值的±10%范围之内，规定值为峰8：0.67、峰9：0.81、峰10：0.90；
所述供试品包括泽泻药材、泽泻饮片、盐泽泻饮片、泽泻饮片标准汤剂、盐泽泻饮片标准汤剂、泽泻配方颗粒或盐泽泻配方颗粒。
8.一种区分不同基源的泽泻或其药物制剂的方法，其特征在于，利用权利要求1-6任一项所述的泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，获得供试品的特征图谱；
当峰1与S1峰的相对峰面积≤0.6时，供试品的基源为东方泽泻Alisma orientale （Sam.）Juzep；
当峰1与S1峰的相对峰面积＞0.6时，供试品的基源为泽泻Alisma plantago-aquatica Linn。
9.一种区分泽泻生药和炮制品的方法，其特征在于，利用权利要求1-6任一项所述泽泻或其药物制剂的特征图谱的构建方法，获得供试品的特征图谱；
当S1峰面积/（峰4峰面积+峰10峰面积）＜4.6，供试品为泽泻生药；
当S1峰面积/（峰4峰面积+峰10峰面积）≥4.6，供试品为盐泽泻炮制品；
泽泻包括东方泽泻Alisma orientale（Sam.）Juzep或泽泻Alisma plantago-aquatica Linn。
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