CN117451896A - 一种抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc特征图谱的构建方法 - Google Patents

一种抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒hplc特征图谱的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈‑0.1％的磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，建立了抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量进行控制。

Description

一种抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱 的构建方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法。
背景技术
抽葫芦为葫芦科植物瓢葫芦Lagenaria siceraria(Molina)Standl.var.depressa(Ser.)Hara的近成熟果实的干燥果皮，具有利尿，消肿，通淋的功效。标准汤剂是由药材经炮制后按固定的制备工艺而成的冻干粉。
为了确保抽葫芦药材、饮片及其标准汤剂质量的均一、稳定，有必要建立一种针对葫芦药材、饮片及其标准汤剂的特征图谱方法对其质量进行把控。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，本发明构建的抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱方法稳定，可靠，可以对葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量进行控制。
本发明提供了一种抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
A)将含有抽葫芦的原料用溶剂处理后，得到供试品溶液；
所述含有抽葫芦的原料选自抽葫芦药材、饮片、标准汤剂或其配方颗粒；
B)将供试品溶液采用高效液相色谱法测定，得到含有抽葫芦的原料的HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的磷酸水溶液，梯度洗脱。
优选的，所述的构建方法中，抽葫芦药材特征图谱供试品溶液的制备方法为：取抽葫芦药材粉末与水混合，加热回流，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，滤过，取续滤液，得到抽葫芦药材特征图谱供试品溶液；
抽葫芦饮片特征图谱供试品溶液的制备方法为：取抽葫芦饮片粉末与水混合，加热回流，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，滤过，取续滤液，得到抽葫芦药材特征图谱供试品溶液；
抽葫芦标准汤剂特征图谱供试品溶液的制备方法为：取抽葫芦标准汤剂的冻干粉末与甲醇混合，超声处理，冷却，滤过，取续滤液，得到抽葫芦标准汤剂特征图谱供试品溶液；
抽葫芦配方颗粒特征图谱供试品溶液的制备方法为：取抽葫芦配方颗粒与甲醇混合进行超声处理，冷却，滤过，取续滤液，得到抽葫芦配方颗粒特征图谱供试品溶液。
优选的，还包括对照品参照物溶液的制备和对照药材参照物溶液的制备：
所述对照品参照物溶液的制备：取香草酸对照品，加甲醇溶解，得到对照品参照物溶液，所述对照品参照物溶液中香草酸的浓度为20μg/mL；
所述对照药材参照物溶液的制备：取抽葫芦对照药材，加水，加热回流提取，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；
将所述对照品参照物溶液和对照药材参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到对照品参照物和对照药材参照物的色谱图；并根据对照品参照物和对照药材参照物的色谱图对抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的成分进行分析。
优选的，所述梯度洗脱程序具体为：
0～25min，A相：12％，B相：88％；
25～28min，A相：12％～14％，B相88％～86％；
28～35min，A相：14％，B相86％；
35～40min，A相14％～25％，B相86％～75％；
40～60min，A相25％，B相75％。
优选的，所述色谱柱为C18柱，柱温为35℃。
优选的，所述流动相的流速为1.0ml/min；进样量为5μL。
优选的，所述检测波长264nm。
优选的，在抽葫芦标准汤剂HPLC特征图谱中，以香草酸参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6和峰7与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值分别为0.22(峰1)0.80(峰2)、1.64(峰4)、2.34(峰5)、2.38(峰6)、2.98(峰7)；
在抽葫芦药材或饮片HPLC特征图谱中，以香草酸参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6和峰7与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值分别为0.220(峰1)、0.802(峰2)、1.633(峰4)、2.392(峰5)、2.437(峰6)、3.035(峰7)；
在抽葫芦配方颗粒HPLC特征图谱中，以香草酸参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6和峰7与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值分别为0.22(峰1)、0.80(峰2)、1.64(峰4)、2.44(峰5)、2.49(峰6)、3.09(峰7)。
与现有技术相比，本发明提供了一种抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：A)将含有抽葫芦的原料用溶剂处理后，得到供试品溶液；所述含有抽葫芦的原料选自抽葫芦药材、饮片、标准汤剂或其配方颗粒；B)将供试品溶液采用高效液相色谱法测定，得到含有抽葫芦的原料的HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的磷酸水溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈-0.1％的磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，建立了抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量进行控制。
附图说明
图1为供试品不同波长色谱图；
图2为柱温考察结果；
图3为流速考察结果；
图4为延迟性考察结果；
图5为提取方式考察结果；
图6为提取溶剂考察结果；
图7为提取时间考察结果；
图8为提取溶剂加入量考察结果；
图9为抽葫芦标汤特征图谱色谱峰指认；
图10为香草酸紫外吸收图；
图11为抽葫芦标汤不同仪器考察结果；
图12为抽葫芦标汤不同色谱柱考察结果；
图13抽葫芦标准汤剂特征图谱；
图14为本发明得到的抽葫芦标准汤剂特征图谱的对照图谱；
图15香草酸紫外吸收光谱图；
图16供试品紫外吸收光谱图；
图17抽葫芦药材不同波长色谱图；
图18为柱温考察色谱图；
图19为流速考察色谱图；
图20为抽葫芦成品延迟性考察图；
图21为提取方法考察结果；
图22为提取溶剂考察结果；
图23为提取时间考察结果；
图24为溶剂加入量考察结果；
图25为抽葫芦药材特征图谱色谱峰指认；
图26为不同仪器考察图；
图27为色谱柱耐用性考察；
图28为20批抽葫芦药材特征图谱验证图；
图29为抽葫芦药材对照特征图谱；
图30为抽葫芦饮片特征图谱；
图31为饮片对照特征图谱；
图32为香草酸紫外吸收光谱图；
图33为供试品紫外吸收光谱图；
图34为抽葫芦配方颗粒不同波长色谱图；
图35为柱温考察色谱图；
图36为流速考察色谱图；
图37为抽葫芦成品延迟性考察图；
图38为提取方法考察结果；
图39为提取溶剂考察结果；
图40为提取时间考察结果；
图41为溶剂加入量考察结果；
图42为抽葫芦成品特征图谱色谱峰指认；
图43为不同仪器考察结果；
图44为色谱柱耐用性考察结果；
图45为3批抽葫芦配方颗粒特征图谱验证图；
图46为抽葫芦配方颗粒对照特征图谱；
图47为改变流动相后的色谱图；
图48为改变洗脱程序后的色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
A)将含有抽葫芦的原料用溶剂处理后，得到供试品溶液；
所述含有抽葫芦的原料选自抽葫芦药材、饮片、标准汤剂或其配方颗粒；
B)将供试品溶液采用高效液相色谱法测定，得到含有抽葫芦的原料的HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的磷酸水溶液，梯度洗脱。
本发明首先制备供试品溶液，根据原料种类不同，供试品溶液分别按照如下方法进行制备：
抽葫芦药材特征图谱供试品溶液的制备方法为：取抽葫芦药材粉末与水混合，加热回流，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，滤过，取续滤液，得到抽葫芦药材特征图谱供试品溶液；
其中，所述抽葫芦药材粉末与水的质量体积比为1g：(50～100)ml，优选为1:50ml。并且，以水作为提取溶剂，色谱峰信息量大。
所述加热回流的时间为30～60min，优选为30min。
抽葫芦饮片特征图谱供试品溶液的制备方法为：取抽葫芦饮片粉末与水混合，加热回流，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，滤过，取续滤液，得到抽葫芦药材特征图谱供试品溶液；
其中，所述抽葫芦饮片粉末与水的质量体积比为1g：(50～100)ml，优选为1:50ml。并且，以水作为提取溶剂，色谱峰信息量大。
所述加热回流的时间为30～60min，优选为30min。
抽葫芦标准汤剂特征图谱供试品溶液的制备方法为：取抽葫芦标准汤剂的冻干粉末与甲醇混合，超声处理，冷却，滤过，取续滤液，得到抽葫芦标准汤剂特征图谱供试品溶液。
其中，抽葫芦标准汤剂的冻干粉末与甲醇的质量体积比为0.1g：(10～45)ml，优选为0.1g：20ml，在该比例条件下，各个色谱峰峰形与分离度较好。并且，提取溶剂为甲醇时，色谱图峰形与分离度较好。
所述超声处理的条件优选为功率600W、频率40kHz、时间10～30分钟，优选20分钟，提取时间为20min时，色谱图峰形与分离度较好。
抽葫芦配方颗粒特征图谱供试品溶液的制备方法为：取抽葫芦配方颗粒与甲醇混合进行超声处理，冷却，滤过，取续滤液，得到抽葫芦配方颗粒特征图谱供试品溶液。
其中，抽葫芦配方颗粒与甲醇的质量体积比为0.1g：(10～45)ml，优选为0.1g：20ml，并且，提取溶剂为甲醇时，所得的色谱图峰型较好，基线较为平整，色谱峰信息量大。
所述超声处理的条件优选为功率600W、频率40kHz、时间10～30分钟，优选20分钟。
本发明提供的色谱构建方法还包括对照品参照物溶液的制备和对照药材参照物溶液的制备：
所述对照品参照物溶液的制备：取香草酸对照品，加甲醇溶解，得到对照品参照物溶液，所述对照品参照物溶液中香草酸的浓度为20μg/mL；
所述对照药材参照物溶液的制备：取抽葫芦对照药材，加水，加热回流提取，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；
将所述对照品参照物溶液和对照药材参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到对照品参照物和对照药材参照物的色谱图；并根据对照品参照物和对照药材参照物的色谱图对抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的成分进行分析。
在本发明中，所述流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的磷酸水溶液，梯度洗脱。
所述梯度洗脱程序具体为：
0～25min，A相：12％，B相：88％；
25～28min，A相：12％～14％，B相88％～86％；
28～35min，A相：14％，B相86％；
35～40min，A相14％～25％，B相86％～75％；
40～60min，A相25％，B相75％。
本发明在上述洗脱梯度下基线分离好，各个峰分离度好，基线平稳。
所述色谱柱为C18柱，柱温为35℃，在柱温为35℃时，色谱图峰形较为对称，分离度较好，出峰较完全。
所述流动相的流速为1.0ml/min；流速为1.0ml/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。
进样量为5μL。
所述检测波长264nm，在检测波长为264nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳。
在抽葫芦标准汤剂HPLC特征图谱中，以香草酸参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6和峰7与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值分别为0.22(峰1)0.80(峰2)、1.64(峰4)、2.34(峰5)、2.38(峰6)、2.98(峰7)；
在抽葫芦药材或饮片HPLC特征图谱中，以香草酸参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6和峰7与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值分别为0.220(峰1)、0.802(峰2)、1.633(峰4)、2.392(峰5)、2.437(峰6)、3.035(峰7)；
在抽葫芦配方颗粒HPLC特征图谱中，以香草酸参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6和峰7与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值分别为0.22(峰1)、0.80(峰2)、1.64(峰4)、2.44(峰5)、2.49(峰6)、3.09(峰7)。
本发明建立抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及配方颗粒HPLC特征图谱方法，为鉴别抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及配方颗粒提供更为科学的鉴别依据。
本发明采用高效液相色谱法，选用乙腈-0.1％的磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，以香草酸对照品作为对照品，建立了抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒的质量进行控制。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
抽葫芦标准汤剂HPLC特征图谱测定
1实验仪器及材料
高效液相色谱仪：安捷伦高效液相色谱仪、岛津高效液相色谱仪、Waters高效液相色谱仪；
电子天平：ME-04E、ME204E、XPE26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ-600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
电子恒温水浴锅：DK-98-Ⅱ型(北京中兴伟业仪器有限公司)
电子恒温水浴锅：DZKW-4型(北京中兴伟业仪器有限公司)
色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18。
甲醇(诺尔施，色谱纯)；磷酸、乙腈(色谱纯)；水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
香草酸(中国食品药品检定研究院，批号：110776-201503，含量以99.8％计)；
抽葫芦对照药材(上海鸿永生物科技有限公司，批号：230090-202301)；
抽葫芦标准汤剂冻干粉(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：CHL-BT-230301、CHL-BT-230302、CHL-BT-230303、CHL-BT-230304、CHL-BT-230305、CHL-BT-230306、CHL-BT-230307、CHL-BT-230308、CHL-BT-230309、CHL-BT-230310、CHL-BT-230311、CHL-BT-230312、CHL-BT-230313、CHL-BT-230314、CHL-BT-230315、CHL-BT-230316、CHL-BT-230318、CHL-BT-230319、CHL-BT-230320、CHL-BT-230321)
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱，检测波长为264nm；流速1.0mL/min，柱温为35℃。流动相梯度见下表1。
表1
参照物溶液的制备取抽葫芦对照药材1g，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇溶解，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取香草酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含香草酸20μg的溶液，作为对照品参照溶液。
供试品溶液的制备取本品粉末约0.1g，置具塞锥形瓶中，加甲醇20ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)20min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2色谱条件与系统适用性试验
2.1波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品(批号CHL-BT-230301)溶液在下的色谱图。见图1，图1为供试品不同波长色谱图。
结果表明，在检测波长为264nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为264nm。
2.2柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察。见图2，图2为柱温考察结果。
结果表明，在柱温为35℃时，色谱图峰形较为对称，分离度较好，出峰较完全。故柱温确定为35℃。
2.3流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察。见图3，图3为流速考察结果。
结果表明，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察，流速为1.0ml/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。故流速确定为1.0ml/min。
2.4延迟性考察
在以上拟定的实验条件基础上，进行延迟性试验。结果见图4，图4为延迟性考察结果。
结果表明，样品在60min后基本无有用色谱峰，故样品检测时间定为60min。
综上所述，抽葫芦标准汤剂特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为264nm。
3供试品溶液的制备考察
3.1提取方式
取本品(批号：CHL-BT-230321)约0.1g，置具塞锥形瓶中，加甲醇20mL，密塞，分别对供试品提取方法为回流、超声(功率600W，频率40kHz)时进行考察，提取时间20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图5，图5为提取方式考察结果。
结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果一致。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。
3.2提取溶剂考察
取本品(批号：CHL-BT-230321)约0.1g，置具塞锥形瓶中，分别加水、30％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇各20mL，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图6，图6为提取溶剂考察结果。
结果表明，提取溶剂为甲醇时，色谱图峰形与分离度较好。故提取溶剂暂定为甲醇。
3.3提取时间考察
取本品(批号：CHL-BT-230321)约0.1g，置具塞锥形瓶中，加甲醇20mL，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)，分别对供试品提取时间为10分钟、20分钟、30分钟时进行考察，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图7，图7为提取时间考察结果。
结果表明，提取时间为20min时，色谱图峰形与分离度较好。故提取时间确定为20min。
3.4提取溶剂加入量考察
取本品(批号：CHL-BT-230321)约0.1g，置具塞锥形瓶中，分别加甲醇10ml、20mL、45ml，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图8，图8为提取溶剂加入量考察结果。
结果表明，提取溶剂为20ml时，各个色谱峰峰形与分离度较好，故溶剂量选择20ml。
综上所述，抽葫芦标准汤剂特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品粉末约0.1g，置锥形瓶中，加甲醇20ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4方法学考察
4.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备抽葫芦标准汤剂供试品溶液。
参照物溶液的制备：取抽葫芦对照药材1g，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。另取香草酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含香草酸20μg的溶液，作为对照品参照溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺抽葫芦标准汤剂阴性对照溶液即为甲醇(空白溶液)。
对抽葫芦标准汤剂特征图谱峰进行定位。见图9-10，图9为抽葫芦标汤特征图谱色谱峰指认。图10为香草酸紫外吸收图。
结果表明，峰3为香草酸。在以下方法学考中，对样品中的7个特征峰进行考察。
4.2精密度试验
精密称取抽葫芦标准汤剂冻干粉(批号：CHL-BT-230321)1份，按拟定实验方法进行制备样品，连续进样6次。见表2
表2精密度考察-保留时间
结果表明，各峰保留时间的RSD值为0.06％～0.46％，该仪器精密度良好。
4.3重复性考察
精密称取抽葫芦标准汤剂冻干粉(批号：CHL-BT-230321)6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表3。
表3重复性考察—特征峰相对保留时间比值
结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD在0.14％～0.82％，表明本方法重复性良好。
4.4中间精密度考察
4.4.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别精密称取抽葫芦标准汤剂冻干粉(批号：CHL-BT-230321)两份，制备供试品溶液，分别在安捷伦、Waters、岛津高效液相色谱仪上进行测定。见图11，表4。图11为抽葫芦标汤不同仪器考察结果。
表4不同仪器考察—特征峰相对保留时间比值
结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.73％～4.63％。
4.4.2不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别精密称取抽葫芦标准汤剂冻干粉(批号：CHL-BT-230321)各两份，制备供试品，进行测定。见表5。
表5不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间比值
结果表明，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.12％～0.29％。
4.5耐用性考察
4.5.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对不同品牌色谱柱岛津Shim-pack GISTC18、Agilent ZORBAXSB、Waters色谱柱进行考察。结果见图12，表6。图12为抽葫芦标汤不同色谱柱考察结果。
表6色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间比值
结果表明，不同品牌色谱柱各特征峰相对保留时间的RSD在1.9～17.07％。
4.5.2稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、16h、24h时测定。见表7。
表7稳定性考察—保留时间
结果表明，其相对应的特征峰保留时间的RSD在0.06％～0.32％。样品溶液在24小时内较稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述7个特征峰纳入后续考察。
5特征峰的确定及对照图谱的建立
5.1 20批抽葫芦标准汤剂验证结果
采用此方法，在20批样品进行特征图谱分析，计算相对保留时间。见图13，表8。图13抽葫芦标准汤剂特征图谱。图13中，S1～S20分别为：CHL-BT-230301、CHL-BT-230302、CHL-BT-230303、CHL-BT-230304、CHL-BT-230305、CHL-BT-230306、CHL-BT-230307、CHL-BT-230308、CHL-BT-230309、CHL-BT-230310、CHL-BT-230311、CHL-BT-230312、CHL-BT-230313、CHL-BT-230314、CHL-BT-230315、CHL-BT-230316、CHL-BT-230318、CHL-BT-230319、CHL-BT-230320、CHL-BT-230321；R为抽葫芦标准汤剂对照图谱。
表8抽葫芦标汤相对保留时间比值
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰。峰1～峰7特征峰相对保留时间的RSD为0.04％～0.17％。
5.2相对保留时间规定值限度的制定
方法学各考察项目及验证结果汇总见表9：
表9方法学各项目结果RSD(％)汇总标准—相对保留时间
由上表可知，各特征相对保留时间稳定，且在平均值±10％范围内，故将各峰的相对保留时间规定值范围暂定位±10％。
最终规定：暂定供试品色谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中峰3应与对照品参照物色谱保留时间相对应。计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为0.22(峰1)0.80(峰2)、1.64(峰4)、2.34(峰5)、2.38(峰6)、2.98(峰7)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对20批抽葫芦标准汤剂进行合成，建立了抽葫芦标准汤剂特征图谱的对照图谱。参见图14，图14为本发明得到的抽葫芦标准汤剂特征图谱的对照图谱。
6抽葫芦标准汤剂特征图谱方法确定
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长为264nm；流速1.0mL/min，柱温为35℃；理论板数按香草酸峰计不低于5000；流动相梯度见表1。
参照物溶液的制备取抽葫芦对照药材1g，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇溶解，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取香草酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含香草酸20μg的溶液，作为对照品参照溶液。
供试品溶液的制备取本品粉末约0.1g，置具塞锥形瓶中，加甲醇20ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)20min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例2
抽葫芦药材、饮片HPLC特征图谱
1实验仪器及材料
高效液相色谱仪：安捷伦高效液相色谱仪、岛津高效液相色谱仪、Waters高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18、Agilent ZORBAX C18、Waters
2试剂及试药
乙腈(色谱纯，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)、磷酸(色谱纯，成都市诺尔施科技有限公司)、甲醇(分析纯、成都市科隆化学试剂有限公司)，流动相用水为实验室自制超纯水，其余均为实验室自制纯水。
抽葫芦对照药材(上海鸿永生物科技有限公司，批号：230090-202301)；
香草酸(中国食品药品检定研究院，批号：110776-201503，含量以99.8％计)；
抽葫芦药材(批号：XLS202109264、XLS202109265、XLS202109266、XLS202109267、XLS202109268、XLS202109269、XLS202109270、XLS202109271、XLS202109272、XLS202109273、XLS202109274、XLS202109275、XLS202109276、XLS202109277、XLS202109278、XLS202109279、XLS202109281、XLS202109282、XLS202109283、010606-2210001)。
3色谱条件
照高效液相色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0512)测定。
色谱条件与系统适应性以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为264nm。
表10
参照物溶液的制备取香草酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含20μg的溶液，即得。
对照药材溶液的制备取抽葫芦对照药材1g，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇溶解，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品(过三号筛)，约1.0g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。
测定法精密吸取以上溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
4色谱条件与系统适用性试验
4.1波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器分别对香草酸、供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在254nm、264nm、280nm、300nm、320nm波长下的色谱图，见图15～17。图15香草酸紫外吸收光谱图，图16供试品紫外吸收光谱图，图17抽葫芦药材不同波长色谱图。
结果表明，在检测波长为264nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为264nm。
4.2柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察，见图18。图18为柱温考察色谱图。
结果表明，柱温在35℃时，色谱图峰形均较为对称，分离度均好，故确定抽葫芦药材特征图谱的柱温为35℃。
4.3流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察。见图19，图19为流速考察色谱图。
结果表明，流速为1.0ml/min时，各特征峰峰形均较好，分离度适中。故确定抽葫芦药材特征图谱的流速为1.0ml/min。
4.4延迟性试验
在以上拟定的实验条件基础上，将色谱图采集时间延长至120min。如图20所示。图20为抽葫芦成品延迟性考察图。
结果表明，在色谱图采集到60分钟时，已将色谱峰采集完全。故将色谱图采集时间确定为60分钟。
综上所述，抽葫芦药材特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，流速为每分钟1.0ml，柱温为35℃；检测波长为264nm。按下表11中的规定进行梯度洗脱；
表11
5供试品溶液的制备考察
5.1提取方法考察
取本品(批号：010303-2210001，过三号筛)约1.0g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，分别回流、超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图21，图21为提取方法考察结果。
结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时加热回流提取效果较好。故供试品提取方法确定为加热回流。
5.2提取溶剂考察
取本品(批号：010303-2210001，过三号筛)约1.0g，分别加水、30％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇各20ml，分别加热回流30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图22，图22为提取溶剂考察结果。
结果表明，水提效果最佳，色谱峰信息量大，故供试品提取溶剂确定为水。
5.3提取时间考察
取本品(批号：010303-2210001，过三号筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50ml，分别加热回流30分钟、60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。见图23，图23为提取时间考察结果。
结果表明，对供试品分别提取时间为30分钟、60分钟时效果一致。综合考虑供试品提取时间选择30分钟。
5.4溶剂加入量考察
取本品(批号：010303-2210001，过三号筛)约1.0g，置具塞锥形瓶中，分别加水50ml、100ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。见图24，图24为溶剂加入量考察结果。
结果表明，提取溶剂在50ml和100ml时，提取效果一致，综合考虑选择加入50ml溶剂。
综上所述，抽葫芦药材特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品(过三号筛)约1.0g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。
6方法学考察
6.1色谱峰指认
阴性样品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备抽葫芦药材阴性样品溶液即为甲醇(空白溶液)。
对照溶液的制备：取香草酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含20μg的溶液，即得。
对照药材制备：取抽葫芦对照药材1g，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇溶解，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品(过三号筛)约1.0g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。
对抽葫芦药材特征图谱峰进行定位。见图25，图25为抽葫芦药材特征图谱色谱峰指认。
在以下方法学考察中，将香草酸设为S峰，对样品图谱中的7个特征峰进行考察。
6.2精密度试验
取本品(批号：010606-2210001，过三号筛)约1.0g，按照“7.2.8.6”制备抽葫芦药材供试品溶液，按拟定检测方法连续进样6次，每次5μl，计算各特征峰的保留时间。见表12。
表12精密度考察—特征峰保留时间
结果表明，精密度考察中各特征峰保留时间的RSD在0.02％～0.13％，精密度良好。
6.3重复性考察
取本品(批号：010606-2210001，过三号筛)约1.0g，6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表13。
表13重复性考察—特征峰相对保留时间
结果表明，特征峰相对保留时间的RSD在0.14％～0.39％，重复性良好。
6.4中间精密度考察
6.4.1不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别称取本品(批号：010606-2210001，过三号筛)约1.0g，各两份，制备供试品，进行测定。见表14。
表14不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间比值
结果表明，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.14％～0.39％。
6.4.2不同仪器考察
取本品(批号：010606-2210001，过三号筛)约1.0g，制备供试品溶液，分别在安捷伦、岛津、Waters高效液相色谱仪上进行测定。见表15，图26，图26为不同仪器考察图。
表15仪器考察—特征峰相对保留时间
结果表明，用上述三种仪器检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.57％～1.26％。
6.5耐用性考察
6.5.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为岛津Shim-pack GIST C18、Agilent ZORBAX SB、Waters进行考察。见表16，图27，图27为色谱柱耐用性考察。
表16色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间
结果表明，用上述3种色谱柱对样品进行检测时，岛津Shim-pack GIST C18柱各色谱峰峰型及分离度较好，故特征图谱测定推荐使用岛津Shim-pack GIST C18色谱柱。
6.5.2稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、18h、24h时测定。见表17。
表17 24小时稳定性考察—特征峰保留时间
结果表明，各特征峰保留时间的RSD在0.08％～0.75％。供试品溶液在24小时内稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述7个特征峰纳入后续考察。
7特征峰的确定及对照图谱的建立
7.1 20批抽葫芦药材验证结果
采用拟定的方法对本品20批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间。见图28，表18。图28为20批抽葫芦药材特征图谱验证图。图28中，S1～S20分别为：XLS202109264、XLS202109265、XLS202109266、XLS202109267、XLS202109268、XLS202109269、XLS202109270、XLS202109271、XLS202109272、XLS202109273、XLS202109274、XLS202109275、XLS202109276、XLS202109277、XLS202109278、XLS202109279、XLS202109281、XLS202109282、XLS202109283、010606-2210001；R为抽葫芦药材对照图谱。
表18 20批抽葫芦药材相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰。
7.2相对保留时间规定值限度的制定
方法学各考察项目及验证结果汇总见表31：
表19方法学各项目结果RSD％汇总标准—相对保留时间(保留时间)
故将各峰的相对保留时间规定值暂定为±10％。
供试品色谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中峰3应与香草酸对照品参照物保留时间相对应，与峰3相对应的峰为S峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6、峰7与S峰的相对保留时间。其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.220(峰1)、0.802(峰2)、1.633(峰4)、2.392(峰5)、2.437(峰6)、3.035(峰7)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对21批抽葫芦药材特征图谱进行合成，建立了抽葫芦药材特征图谱的对照图谱。见图29，图29为抽葫芦药材对照特征图谱。
7.3抽葫芦饮片特征图谱验证
按“5供试品溶液的制备考察”结果制备20批饮片的供试品溶液，并按“3色谱条件与系统适用性试验”结果进样测定分析，计算相对保留时间。结果见图30，表20。图30为抽葫芦饮片特征图谱，图30中，各图谱代表批次为S1～S20：CHL-230301、CHL-230302、CHL-230303、CHL-230304、CHL-230305、CHL-230306、CHL-230307、CHL-230308、CHL-230309、CHL-230310、CHL-230311、CHL-230312、CHL-230313、CHL-230314、CHL-230315、CHL-230316、CHL-230318、CHL-230319、CHL-230320、CHL-230321、R为饮片对照图谱。
表20抽葫芦饮片特征峰相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，当峰3作为S峰时，20批次抽葫芦饮片7个特征峰相对保留时间RSD范围在0.22％～3.05％。
最终规定：供试品特征图谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中峰3应与香草酸参照物色谱峰的保留时间相对应。与香草酸参照物相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值为：0.222(峰1)、0.799(峰2)、1.642(峰4)、2.410(峰5)、2.456(峰6)、3.051(峰7)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对21批抽葫芦饮片特征图谱进行合成，建立了抽葫芦饮片特征图谱的对照图谱。见图31，图31为饮片对照特征图谱。
8抽葫芦药材、饮片特征图谱方法确定
色谱条件与系统适应性以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为264nm。理论板数按香草酸峰计不低于5000。
参照物溶液的制备取香草酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含20μg的溶液，即得。
对照药材溶液的制备取抽葫芦对照药材1g，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇溶解，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品(过三号筛)1g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。
测定法精密吸取以上溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例3
抽葫芦配方颗粒HPLC特征图谱
1实验仪器及材料
高效液相色谱仪：安捷伦高效液相色谱仪、岛津高效液相色谱仪、Waters高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18、Agilent ZORBAX；Waters
2试剂及试药
乙腈(色谱纯，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)、磷酸(色谱纯，成都市诺尔施科技有限公司)、甲醇(分析纯、成都市科隆化学试剂有限公司)，流动相用水为实验室自制超纯水，其余均为实验室自制纯水。
抽葫芦对照药材(上海鸿永生物科技有限公司，批号：230090-202301)；
香草酸(中国食品药品检定研究院，批号：110776-201503，含量以99.8％计)；
抽葫芦配方颗粒(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：2303215、2303216、2303217)。
3色谱条件
根据抽葫芦标准汤剂特征图谱色谱条件确定抽葫芦配方颗粒条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，按下表21中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为264nm。
表21
参照物溶液的制备取香草酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含20μg的溶液，即得。
对照药材溶液的制备取抽葫芦对照药材1g，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇溶解，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取1.0g，置具塞锥形瓶中，加甲醇20ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法精密吸取以上溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
4色谱条件与系统适用性试验
4.1波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器分别对香草酸、供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在254nm、264nm、280nm、300nm、320nm波长下的色谱图，见图32～34。图32为香草酸紫外吸收光谱图，图33为供试品紫外吸收光谱图，图34为抽葫芦配方颗粒不同波长色谱图。
结果表明，在检测波长为264nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为264nm。
4.2柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为25℃、30℃、35℃时进行考察，见图35。图35为柱温考察色谱图。
结果表明，柱温在35℃时，色谱图峰形均较为对称，分离度均好，故确定抽葫芦特征图谱的柱温为35℃。
4.3流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察。见图36。图36为流速考察色谱图。
结果表明，流速为1.0ml/min时，各特征峰峰形均较好，分离度适中。故确定抽葫芦特征图谱的流速为1.0ml/min。
4.4延迟性试验
在以上拟定的实验条件基础上，将色谱图采集时间延长至120min。如图37所示。图37为抽葫芦成品延迟性考察图。
结果表明，在色谱图采集到60分钟时，已将色谱峰采集完全。故将色谱图采集时间确定为60分钟。
综上所述，抽葫芦配方颗粒特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B；流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为264nm；按下表22中的规定进行梯度洗脱。
表22
5供试品溶液的制备考察
5.1提取方法考察
取本品(批号：18080082)适量，研细，约1.0g，置具塞锥形瓶中，加甲醇20ml，分别回流、超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图38，图38为提取方法考察结果。
结果表明，对供试品分别进行超声提取与回流提取时效果一致。因超声提取操作更为简便，故供试品提取方法确定为超声提取。
5.2提取溶剂考察
取本品(批号：18080082)适量，研细，取1.0g，分别加水、30％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇各20ml，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图39，图39为提取溶剂考察结果。
结果表明，在提取溶剂为甲醇时，所得的色谱图峰型较好，基线较为平整，色谱峰信息量大，故供试品提取溶剂确定为甲醇。
5.3提取时间考察
取本品(批号：18080082)适量，研细，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇20ml，分别超声处理(功率600W，频率40kHz)10分钟、20分钟、30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图40，图40为提取时间考察结果。
结果表明，对供试品分别提取时间为10分钟、20分钟、30分钟时效果一致。综合考虑供试品提取时间选择20分钟。
5.4溶剂加入量考察
取本品(批号：18080082)适量，研细，取1.0g，置具塞锥形瓶中，分别加甲醇10ml、20ml、45ml进行考察，密塞，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图41，图41为溶剂加入量考察结果。
结果表明，提取溶剂为20ml时，各个色谱峰大小合适，故溶剂加入量选择20ml。
综上所述，抽葫芦配方颗粒特征图谱供试品溶液的制备方法确定为：取本品适量，研细，取1.0g，置具塞锥形瓶中，加甲醇20ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6方法学考察
6.1色谱峰指认
阴性样品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备抽葫芦颗粒阴性样品溶液，即为甲醇(空白溶液)。
对照溶液的制备：取香草酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含20μg的溶液，即得。
对照药材制备：取抽葫芦对照药材1g，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇溶解，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取1.0g，置具塞锥形瓶中，加甲醇20ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
对抽葫芦配方颗粒特征图谱峰进行定位。见图42，图42为抽葫芦成品特征图谱色谱峰指认，峰3(S)：香草酸。
在以下方法学考察中，将香草酸设为S峰，对样品图谱中的7个特征峰进行考察。
6.2精密度试验
取本品适量(批号：18080082)，研细，取1.0g，按照“7.2.8.6”制备抽葫芦配方颗粒供试品溶液，按拟定检测方法连续进样6次，每次5μl，计算各特征峰的保留时间。见表23。
表23精密度考察—特征峰保留时间
结果表明，精密度考察中各特征峰保留时间的RSD在0.04％～0.36％
6.3重复性考察
取本品适量(批号：18080082)，研细，取1.0g，6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表24。
表24重复性考察—特征峰相对保留时间
结果表明，特征峰相对保留时间的RSD在0.02％～0.08％，重复性良好。
6.4中间精密度考察
6.4.1不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别称取抽葫芦配方颗粒(批号：18080082)，研细，取1.0g，各两份，制备供试品，进行测定。见表25。
表25不同人员与时间考察—特征峰相对保留时间比值
结果表明，不同样品制备人员和不同样品制备时间条件下，各特征峰相对保留时间的RSD在0.09％～0.26％。
6.4.2不同仪器考察
取本品适量(批号：18080082)，研细，取1.0g，制备供试品溶液，分别在安捷伦1260、岛津LC-20AD、Waters 2695型高效液相色谱仪上进行测定。见表26，图43。图43为不同仪器考察结果。
表26仪器考察—特征峰相对保留时间
结果表明，用上述两种仪器检测时，各特征峰相对保留时间的RSD在0.75％～4.50％，不同仪器耐用性良好。
6.5耐用性考察
6.5.1色谱柱耐用性考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对色谱柱为岛津Shim-pack GIST C18、Agilent ZORBAX SB、Waters进行考察。见表27，图44。图44为色谱柱耐用性考察结果。
表27色谱柱耐用性考察—特征峰相对保留时间
结果表明，用上述3种色谱柱对样品进行检测时，岛津Shim-pack GIST C18柱各色谱峰峰型及分离度较好，故特征图谱测定推荐使用岛津Shim-pack GIST C18色谱柱。
6.5.2稳定性考察
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、18h、24h时测定。见表28。
表28稳定性考察—特征峰保留时间
结果表明，各特征峰保留时间的RSD在0.05％～0.51％。供试品溶液在24小时内稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述7个特征峰纳入后续考察。
7特征峰的确定及对照图谱的建立
7.1 3批抽葫芦配方颗粒验证结果
采用拟定的方法对本品3批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间。见图45，表29。图45为3批抽葫芦配方颗粒特征图谱验证图。图45中，S1～S3分别对应批号2303215、2303216和2303217抽葫芦配方颗粒。
表29 3批抽葫芦配方颗粒相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了7个重复性较好的峰作为特征峰。
7.2相对保留时间规定值限度的制定
方法学各考察项目及验证结果汇总见表48：
表30方法学各项目结果RSD％汇总标准—相对保留时间
故将各峰的相对保留时间规定值暂定为±10％。
供试品色谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中峰3应与香草酸对照品参照物保留时间相对应，与峰3相对应的峰为S峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6、峰7与S峰的相对保留时间。其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.22(峰1)、0.80(峰2)、1.64(峰4)、2.44(峰5)、2.49(峰6)、3.09(峰7)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批抽葫芦配方颗粒特征图谱进行合成，建立了抽葫芦配方颗粒特征图谱的对照图谱。见图46，图46为抽葫芦配方颗粒对照特征图谱。
8抽葫芦配方颗粒特征图谱方法确定
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为264nm；按下表31规定梯度进行洗脱，理论板数按香草酸峰计不低于5000。
表31
参照物溶液的制备取香草酸对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含20μg的溶液，即得。
对照药材溶液的制备取抽葫芦对照药材1g，加水50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇溶解，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品适量，研细，取1.0g，置具塞锥形瓶中，加甲醇20ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法精密吸取以上溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
对比例1
在实施例3的基础上，改变流动相为流动相A为乙腈，流动相B为磷酸，其他条件不变，测试结果见图47，图47为改变流动相后的色谱图。
对比例2
在实施例3的基础上，改变流动相为流动相A为乙腈，流动相B为甲酸，其他条件不变，测试结果见图47。
由图47可知，供试品溶液在以乙腈-磷酸为流动相的条件下，各组分能更好的分离，基线较为平整。
对比例3
在实施例3的基础上，仅改变洗脱程序，具体参见表32，其他条件不变，测试结果见图48。
表32对比例3的洗脱程序(方法1)
对比例4
在实施例3的基础上，仅改变洗脱程序，具体参见表33，其他条件不变，测试结果见图48，图48为改变洗脱程序后的色谱图。
表33对比例4的洗脱程序(方法2)
对比例5
在实施例3的基础上，仅改变洗脱程序，具体参见表34，其他条件不变，测试结果见图48。
表34对比例5的洗脱程序(方法3)
其中，图48中，方法4即为实施例3所述的方法。
表35实施例3的洗脱程序(方法4)
由图48可知，按方法4表中梯度洗脱更有效的分离化合物，基线较平，各色谱峰大小合适。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)将含有抽葫芦的原料用溶剂处理后，得到供试品溶液；
所述含有抽葫芦的原料选自抽葫芦药材、饮片、标准汤剂或其配方颗粒；
B)将供试品溶液采用高效液相色谱法测定，得到含有抽葫芦的原料的HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的磷酸水溶液，梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，
抽葫芦药材特征图谱供试品溶液的制备方法为：取抽葫芦药材粉末与水混合，加热回流，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，滤过，取续滤液，得到抽葫芦药材特征图谱供试品溶液；
抽葫芦饮片特征图谱供试品溶液的制备方法为：取抽葫芦饮片粉末与水混合，加热回流，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，滤过，取续滤液，得到抽葫芦药材特征图谱供试品溶液；
抽葫芦标准汤剂特征图谱供试品溶液的制备方法为：取抽葫芦标准汤剂的冻干粉末与甲醇混合，超声处理，冷却，滤过，取续滤液，得到抽葫芦标准汤剂特征图谱供试品溶液；
抽葫芦配方颗粒特征图谱供试品溶液的制备方法为：取抽葫芦配方颗粒与甲醇混合进行超声处理，冷却，滤过，取续滤液，得到抽葫芦配方颗粒特征图谱供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括对照品参照物溶液的制备和对照药材参照物溶液的制备：
所述对照品参照物溶液的制备：取香草酸对照品，加甲醇溶解，得到对照品参照物溶液，所述对照品参照物溶液中香草酸的浓度为20μg/mL；
所述对照药材参照物溶液的制备：取抽葫芦对照药材，加水，加热回流提取，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液；
将所述对照品参照物溶液和对照药材参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到对照品参照物和对照药材参照物的色谱图；并根据对照品参照物和对照药材参照物的色谱图对抽葫芦药材、饮片、标准汤剂及其配方颗粒HPLC特征图谱的成分进行分析。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序具体为：
0～25min，A相：12％，B相：88％；
25～28min，A相：12％～14％，B相88％～86％；
28～35min，A相：14％，B相86％；
35～40min，A相14％～25％，B相86％～75％；
40～60min，A相25％，B相75％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为C18柱，柱温为35℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为1.0ml/min；进样量为5μL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测波长264nm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
在抽葫芦标准汤剂HPLC特征图谱中，以香草酸参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6和峰7与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值分别为0.22(峰1)0.80(峰2)、1.64(峰4)、2.34(峰5)、2.38(峰6)、2.98(峰7)；
在抽葫芦药材或饮片HPLC特征图谱中，以香草酸参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6和峰7与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值分别为0.220(峰1)、0.802(峰2)、1.633(峰4)、2.392(峰5)、2.437(峰6)、3.035(峰7)；
在抽葫芦配方颗粒HPLC特征图谱中，以香草酸参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6和峰7与S1峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值分别为0.22(峰1)、0.80(峰2)、1.64(峰4)、2.44(峰5)、2.49(峰6)、3.09(峰7)。
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