CN117054567A - 一种炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的hplc特征图谱构建方法 - Google Patents
一种炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的hplc特征图谱构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将楮实子原料采用溶剂溶解，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到楮实子原料的HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用甲醇‑水为流动相进行梯度洗脱，以色氨酸、原儿茶酸、香草酸‑4‑O‑β‑D‑葡萄糖苷为参照物，建立了炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量进行控制。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其是涉及一种炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱构建方法。
背景技术
楮实子为桑科植物构树Broussonetia papyrifera(L.)Vent.的干燥成熟果实。微苦、涩，平。归肝、肾经。
现有的检测方法难以有效对比和分析炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒特征图谱的差异与变化，难以深入认识炒楮实子药效物质基础在从饮片到配方颗粒的工艺过程的传递情况，难以整体评价和控制从炒楮实子饮片到炒楮实子配方颗粒成品的工艺过程。
因此，有必要建立一种快速鉴别楮实子及其标准汤剂的HPLC特征图谱方法，为有效控制和较全面评价楮实子标准汤剂的质量提供依据。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱构建方法，本发明构建的炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱方法稳定，可靠，可以对炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量进行控制。
一种炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱构建方法，包括：
A)将楮实子原料采用溶剂溶解，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到楮实子原料的HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱。
本发明提供的一种炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱构建方法首先取楮实子原料，溶剂溶解，得到待测液。所述溶剂优选为50％甲醇。
本发明采用上述提取溶剂色谱峰信息量大，效果好。
具体为将楮实子原料采用溶剂溶解，提取，放冷，摇匀，滤过，即得。
本发明所述提取方法为超声提取或加热回流提取；优选为超声提取；所述超声功率优选为600W，频率优选为40kHz；所述提取时间优选为30～40min；更优选为30min。
提取时间为30min时，色谱图峰形与分离度较好。
其中，所述楮实子原料的质量g和溶剂的体积mL的比优选为(0.5～1)：(20～30)；更优选为(0.5～1)：25；最优选为饮片1：25、标汤和配方颗粒0.5：25。
其中所述溶剂为50％甲醇。提取溶剂为50％甲醇时，各特征峰峰形好，分离度适中。
所述楮实子原料为楮实子汤剂、楮实子饮片或汤剂。本发明对其不进行限定，上述原料皆可通过本发明的方法进行质量控制和定性检测。
还包括制备对照品参照物溶液的制备和对照药材溶液的制备；
对照品参照物溶液的制备：分别取色氨酸、原儿茶酸、香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷，采用50％甲醇溶解，得到参照物溶液；所述参照物溶液中色氨酸的浓度为12μg/mL；所述参照物溶液中原儿茶酸的浓度为12μg/mL；所述参照物溶液中香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷的浓度为12μg/mL。
对照药材溶液的制备：采用楮实子对照药材加水回流，过滤，得到对照药材溶液；
将所述对照品参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱的成分进行定性测定。
本发明所述流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的甲酸水溶液溶液，梯度洗脱。
本发明所述梯度洗脱优选具体为：
0～30min，A相：0～15％、B相：100～85％。
本发明在上述洗脱梯度下基线分离好，各个峰分离度好，基线平稳。
C18柱，规格为5μm，4.6×250mm；柱温30℃。
本发明在柱温为30℃时，色谱图峰形较为对称，分离度较好，出峰较完全。
流动相流速优选为1ml/min。
本发明发现流速1ml/min下各色谱峰分离较好，峰形较对称，作为最优选方案。
本发明检测波长优选为218nm。
本发明人发现，在218nm处色谱信息丰富，各成分均有较好吸收，响应值适中，色谱峰信息量较大，各峰分离度较好，基线平稳。
本发明进样量为10～15μL；优选为10μL。
本发明的有益效果是，一个液相色谱条件下，以指纹图谱控制炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的物质群，以色氨酸、原儿茶酸、香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷对指纹图谱进行定位；能够大大降低检测的成本，实现定性检测。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC标准特征图谱，其中峰4(S)：色氨酸；峰5：原儿茶酸；峰7：香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷。
在所述炒楮实子配方颗粒标准特征图谱中，以色氨酸为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：0.42(峰1)、0.55(峰2)、0.90(峰3)、1.00(峰4，S)、1.25(峰5)、1.31(峰6)、1.50(峰7)、1.65(峰8)；
在所述炒楮实子标准汤剂标准特征图谱中，以色氨酸为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：0.422(峰1)、0.543(峰2)、0.897(峰3)、1.000(峰4，S)、1.230(峰5)、1.288(峰6)、1.444(峰7)、1.572(峰8)；
在所述炒楮实子饮片标准特征图谱中，以色氨酸为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：0.427(峰1)、0.546(峰2)、0.896(峰3)、1.229(峰5)、1.287(峰6)、1.443(峰7)、1.571(峰8)。
质量判断标准：取炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的样品，按上述同法操作，得到炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版对炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的标准特征图谱和样品特征图谱进行分析，相似度大于0.90。
采用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量，使其质量稳定，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。
本发明建立的炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱以尿苷、鸟苷、色氨酸、腺苷，为参照物，注重各个特征峰的顺序和与药材及中间产品的相关性，能全面评价产品的整体质量面貌特征，方法科学可靠。
本发明新建的特征图谱方法，可以检测楮实子及其标准汤剂中极性较大的成分。且供试品制备方法简单容易操作，指认特征峰相对较多。可对甘遂、楮实子及其制剂进行准确、可靠的特征图谱检测。对楮实子及其制剂的真实性和质量的一致性以及稳定性均可有效地加以检测和控制。为有效控制和较全面评价楮实子标准汤剂的质量提供依据。确保楮实子及其标准汤剂质量的均一、稳定。
本发明适用于炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒高效液相特征图谱的检测方法，能整体控制炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分，确保炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒质量的整体稳定，且方法操作简单，精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高。
本发明提供了一种炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱构建方法，包括：A)将楮实子原料采用溶剂溶解，得到待测液；B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到楮实子原料的HPLC特征图谱；所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱。本发明采用高效液相色谱法，选用甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，以色氨酸、原儿茶酸、香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷为参照物，建立了炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱，重复性、精密度好，方法稳定，可靠，可以对炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的质量进行控制。
附图说明
图1炒楮实子配方颗粒不同波长色谱图；
图2炒楮实子配方颗粒3D图；
图3柱温考察；
图4流速考察；
图5提取溶剂考察；
图6提取方法考察；
图7提取时间考察；
图8溶剂加入量考察；
图9色谱峰指认；
图10原儿茶酸光谱图；
图11色氨酸光谱图；
图12香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷光谱图；
图13不同仪器考察结果图；
图14 3批炒楮实子配方颗粒特征图谱验证图；
图15炒楮实子配方颗粒对照特征图谱；
图16炒楮实子标准汤剂对照特征图谱；
图17炒楮实子饮片对照特征图谱；
图18炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒对照特征图谱对比图；
图19为本发明对比例1梯度1色谱图；
图20为本发明对比例1梯度2色谱图；
图21本发明对比例1梯度2色谱图；
图22为本发明对比例2的色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱构建方法进行详细描述。
3台不同品牌高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DΜ、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ600DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
3种不同型号色谱柱；
乙腈、甲酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
色氨酸(中国食品药品检定研究院，批号：140686-201904，含量以99.9％计)
香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷(成都德思特生物技术有限公司，批号：DST220829-240)；
原儿茶酸(中国食品药品检定研究院，批号：110809-201906，含量以97.7％计)
楮实子对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121720-201501)
20批炒楮实子饮片(CCSZ1～CZSZ20)、20批炒楮实子标准汤剂(CCSZBT1～CCSZBT20)、3批炒楮实子配方颗粒(S1、S2、S3)。
实施例1
1.1色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为218nm。
1.2参照物溶液的制备
取楮实子对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取色氨酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含色氨酸12μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
1.3供试品溶液的制备
取本品适量，研细，取0.5g，置具塞锥形瓶中，加50％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.4测定法
精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
1.5色谱条件与系统适用性试验
1.5.1波长选择
在以上拟定的实验条件基础上，利用二极管阵列检测器对供试品溶液进行全波段扫描，并分别提取供试品溶液在218nm、230nm、260nm、280nm、300nm、330nm、360nm波长下的色谱图。见图1-图2。图1炒楮实子配方颗粒不同波长色谱图；图2炒楮实子配方颗粒3D图。
结果表明，在检测波长为218nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，故检测波长确定为218nm。
1.5.2柱温考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对柱温为20℃、25℃、30℃时进行考察。见图3。图3柱温考察。结果表明，在柱温为30℃时，色谱图峰形较为对称，分离度较好，出峰较完全。故柱温确定为30℃。
1.5.3流速考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别对流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min时进行了考察。见图4。图4流速考察。结果表明，流速为1.0mL/min时，色谱图峰形较好，分离度适中。故流速确定为1.0ml/min。
综上所述，炒楮实子配方颗粒特征图谱色谱条件与系统适应性试验确定为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为218nm。
1.6供试品溶液的制备考察
1.6.1提取溶剂考察
取本品适量(批号：S1)，研细，取0.5g，置具塞锥形瓶中，分别对供试品提取溶剂为甲醇、50％甲醇、20％甲醇、50％乙醇、乙醇、水各25ml进行考察，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图5。图5提取溶剂考察。结果表明，提取溶剂为50％甲醇时，各特征峰峰形好，分离度适中，提取溶剂暂定为50％甲醇。
1.6.2提取方法考察
取本品适量(批号：S1)，研细，取0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇25ml，分别对供试品提取方法为回流、超声时进行考察，提取时间30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图6。图6提取方法考察。
结果表明，对供试品进行回流和超声提取时效果差异不大，且超声方法快速简便，故供试品提取方法确定为超声提取。
1.6.3提取时间考察
取本品适量(批号：S1)，研细，取0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50％甲醇25ml，超声处理，分别对供试品提取时间为20min、30min、40min时进行考察，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图7。图7提取时间考察。结果表明，提取时间为30min时，色谱图峰形与分离度较好。故提取时间确定为30min。
1.6.4溶剂加入量考察
取本品适量(批号：S1)，研细，取0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入50％甲醇15ml、25ml、40ml进行考察，超声处理30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。见图8。图8溶剂加入量考察。结果表明，提取溶剂加入量为25ml时，各个色谱峰峰形与分离度较好，故溶剂量选择25ml。
综上所述，炒楮实子配方颗粒供试品溶液的制备方法确定为：取本品，研细，取0.5g，置具塞锥形瓶中，加50％甲醇25ml，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.7方法学考察
1.7.1色谱峰指认
供试品溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备炒楮实子配方颗粒供试品溶液。
参照物溶液的制备：取楮实子对照药材1g，置具塞锥形瓶中，加水25ml，加热回流30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液
另取色氨酸对照品、原儿茶酸对照品、香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含12μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺炒楮实子标准汤剂阴性对照溶液。
对炒楮实子配方颗粒特征图谱峰进行定位。见图9-12。图9色谱峰指认注：S1阴性，S2成品，S3色氨酸，S4香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷，S5原茶酸；图10原儿茶酸光谱图；图11色氨酸光谱图；图12香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷光谱图。结果表明，峰4为色氨酸、峰5为原儿茶酸、峰7为香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷。在以下方法学考察中，对样品中的8个特征峰进行考察。
1.7.2精密度试验
取炒楮实子配方颗粒供试品溶液，按拟定实验方法连续进样6次，每次10μl，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。见表1和表2。
表1精密度考察-保留时间
表2精密度考察-峰面积
结果显示各特征峰保留时间RSD为0.07％～1.50％，说明该仪器精密度良好。
1.7.3重复性考察
称取炒楮实子配方颗粒6份，按拟定实验方法进行制备及测定。见表3、4。
表3重复性考察-相对保留时间
表4重复性考察-相对峰面积
结果显示，6份样品的相对保留时间RSD为0.07％～1.20％，说明该方法重复性良好。
1.7.4中间精密度考察
1.7.4.1不同仪器考察
在以上拟定的实验条件基础上，分别称取炒楮实子配方颗粒一份，制备供试品溶液，分别在3台不同品牌高效液相色谱仪上进行测定。见表5、表6，图13。图13不同仪器考察结果图。
表5仪器耐用性考察-相对保留时间
表6仪器耐用性考察-相对峰面积
结果表明，用上述3仪器对供试品进行检测时，各特征峰相对保留时间的RSD为0.33％～0.97％，表明仪器耐用性良好。
1.7.4.2不同人员和时间考察
在以上拟定的实验条件基础上，由不同人员(A、B)在不同时间(T1、T2)分别称取炒楮实子配方颗粒各两份，制备供试品，进行测定。见表7、8。
表7人员和时间考察-相对保留时间
表8人员和时间考察-相对峰面积
结果表明，由不同的人员在不同的时间对同一个样品进行测定，各特征峰相对保留时间的RSD为0.03％～0.93％，方法稳定性良好。
1.7.5稳定性
在以上拟定的实验条件基础上，取同一供试品溶液，分别于0h，4h，6h，9h，12h，24h时测定。见表9、10。
表9稳定性考察-保留时间
表10稳定性考察-峰面积
结果表明，特征峰保留时间的RSD在0.25％～1.71％，样品溶液在24小时内稳定。
综上所述，各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好。将上述8个特征峰纳入后续考察。
1.7.6特征峰的确定及对照图谱的建立
1.7.7.1 3批炒楮实子配方颗粒验证结果
采用拟定的方法对本品3批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积。见图14，表11。图14 3批炒楮实子配方颗粒特征图谱验证图。
表11 3批炒楮实子配方颗粒相对保留时间
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8合计8个耐用性较好的峰作为特征峰。根据方法学考察结果和3批颗粒验证结果，暂定理论塔板数按色氨酸计算应不低于5000。
1.7.7.2相对保留时间规定值限度的制定
方法学各考察项目及验证结果汇总见表12：
表12方法学各项目结果RSD％汇总标准—相对保留时间
各特征峰相对保留时间稳定，且在平均值±10％范围内，故将各峰的相对保留时间规定值范围暂定为±10％，各批次相对峰面积差异太大，无法进行规定，故相对峰面积不列入正文。
最终规定：供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰的保留时间相对应。与色氨酸参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.42(峰1)、0.55(峰2)、0.90(峰3)、1.00(峰4，S)、1.25(峰5)、1.31(峰6)、1.50(峰7)、1.65(峰8)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对3批炒楮实子配方颗粒进行合成，建立了炒楮实子配方颗粒特征图谱的对照图谱。见图15。图16炒楮实子配方颗粒对照特征图谱；峰4(S)：色氨酸；峰5：原儿茶酸；峰7：香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷。
实施例2
2.1标准汤剂特征图谱拟定方法
色谱条件与系统适用性试验：同实施例1。
参照物溶液的制备：同实施例1。
供试品溶液制备取本品粉末0.5g，置具塞锥形瓶中，加50％甲醇25ml，超声处理(功率600W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：同实施例1。
2.2标准汤剂特征图谱验证
采用拟定的方法对本品20批样品进行特征图谱的测定，计算相对保留时间、相对峰面积，见表13-14。
表13 20批炒楮实子标准汤剂相对保留时间
表14 20批炒楮实子标准汤剂相对峰面积
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了8个重复性较好的峰作为特征峰。最终规定：供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰保留时间相对应。与色氨酸参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.422(峰1)、0.543(峰21)、0.897(峰3)、1.000(峰4，S)、1.230(峰5)、1.288(峰6)、1.444(峰7)、1.572(峰8)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对20批炒楮实子标准汤剂进行合成，建立了炒楮实子标准汤剂特征图谱的对照图谱。见图16。图17炒楮实子标准汤剂对照特征图谱；峰4(S)：色氨酸；峰5：原儿茶酸；峰7：香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷。
实施例3炒楮实子饮片特征图谱的建立
3.1色谱条件与系统适用性试验同实施例1。
参照物溶液的制备同实施例1。
供试品溶液制备取本品粉末约1g，同对照药材参照物溶液制备方法，制成供试品溶液，即得。
测定法同实施例1。
3.2饮片特征图谱验证
按照以上方法对20批样品进行测定，计算相对保留时间、相对峰面积的比值。结果见表15和表16。
表15 20批四川炒楮实子饮片特征图谱相对保留时间比值
/>
表16 20批炒楮实子饮片特征图谱相对峰面积
/>
根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了8个重复性较好的峰作为特征峰。结果表明，饮片特征峰相对峰面积RSD差异太大，无法规定相对峰面积，因此不列入质量标准正文，20批次炒楮实子8个特征峰相对保留时间RSD均小于2.0％。根据方法学和验证结果，拟定理论板数按色氨酸峰计算应不低于5000。
最终规定：供试品色谱中应呈现8个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的8个特征峰的保留时间相对应。与色氨酸参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.427(峰1)、0.546(峰2)、0.896(峰3)、1.229(峰5)、1.287(峰6)、1.443(峰7)、1.571(峰8)。
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对20批炒楮实子饮片进行合成，建立了炒楮实子饮片特征图谱的对照特征图谱。见图17。图17炒楮实子饮片对照特征图谱；峰4(S)：色氨酸；峰5：原儿茶酸；峰7：香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷。
实施例4
炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒相关性结果
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)分别将20批炒楮实子饮片特征图谱合成一张饮片对照图谱，20批炒楮实子标准汤剂特征图谱合成一张标准汤剂对照图谱，3批炒楮实子配方颗粒特征图谱合成一张配方颗粒对照图谱。将以上炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒对照图谱进行对比，结果见图18。图18炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒对照特征图谱对比图；峰4(S)：色氨酸；峰5：原儿茶酸；峰7：香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷。
结果表明，炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒中均能检出8个特征峰，其物质基础一致，本发明方法可以准确高效地检测出炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒中的特征成分，实现整体控制炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒质量的目的。
对比例1
梯度1以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为218nm。
结果如图19所示，图19为本发明对比例1梯度1色谱图；由图19可以看出，以乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相，以上梯度洗脱方法呈现的色谱图峰较少，且峰形较差。
梯度2：以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为218nm。
结果如图20所示，图20为本发明对比例1梯度2色谱图；由图20可以看出，以乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相，以上梯度洗脱方法呈现的色谱图峰较少，且峰形较差。
梯度3：以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为218nm。
结果如图21所示，图21为本发明对比例1梯度2色谱图；由图21可以看出，以乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相，以上梯度洗脱方法呈现的色谱峰保留时间不合适，且分离度较差。
结果表明，以乙腈-0.1％甲酸溶液为流动相，其他洗脱梯度呈现的色谱图峰形较差，峰个数较少，分离度较差，本发明洗脱梯度呈现的色谱图峰形较好。
对比例2
以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B的色谱图见图22所述，图22为本发明对比例2的色谱图。
结果表明，以乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相，80:20等度洗脱，其余与本发明实施例1条件一致，结果如图所示，由图22可以看出，色谱峰形较差。本发明流动相呈现的色谱图峰形更好，峰分离度较好，色谱峰更丰富。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱构建方法，包括：
A)将楮实子原料采用溶剂溶解，得到待测液；
B)将待测液采用高效液相色谱法测定，得到楮实子原料的HPLC特征图谱；
所述高效液相色谱法色谱条件为：色谱柱为C18柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括制备对照品参照物溶液的制备和对照药材溶液的制备；
对照品参照物溶液的制备：分别取色氨酸、原儿茶酸、香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷，采用50％甲醇溶解，得到参照物溶液；所述参照物溶液中色氨酸的浓度为12μg/mL；所述参照物溶液中原儿茶酸的浓度为12μg/mL；所述参照物溶液中香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷的浓度为12μg/mL；
对照药材溶液的制备：采用楮实子对照药材加水回流，过滤，得到对照药材溶液；
将所述对照品参照物溶液采用高效液相色谱法测定，得到参照物的色谱图；并根据参照物的色谱图对炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱的成分进行定性测定。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：
0～30min，A相：0～15％、B相：100～85％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为C18柱，规格为5μm，4.6×250mm；柱温30℃。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述流动相流速为0.8ml/min～1.0ml/min；检测波长为218nm～360nm；进样量为10μL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱的相似度进行评价，得到由8个特征峰构成的炒楮实子饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC标准特征图谱，其中峰4(S)：色氨酸；峰5：原儿茶酸；峰7：香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述炒楮实子配方颗粒标准特征图谱中，以色氨酸为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：0.42(峰1)、0.55(峰2)、0.90(峰3)、1.00(峰4，S)、1.25(峰5)、1.31(峰6)、1.50(峰7)、1.65(峰8)；
在所述炒楮实子标准汤剂标准特征图谱中，以色氨酸为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：0.422(峰1)、0.543(峰2)、0.897(峰3)、1.000(峰4，S)、1.230(峰5)、1.288(峰6)、1.444(峰7)、1.572(峰8)；
在所述炒楮实子饮片标准特征图谱中，以色氨酸为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的±10％之内，所述规定值分别为：0.427(峰1)、0.546(峰2)、0.896(峰3)、1.229(峰5)、1.287(峰6)、1.443(峰7)、1.571(峰8)。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A)所述溶剂为50％甲醇；所述提取方法为超声提取或加热回流提取；所述超声功率为600W，频率为40kHz；所述提取时间为30～40min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A)所述楮实子原料的质量g和溶剂的体积mL的比为(0.5～1)：(20～30)。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A)所述楮实子原料为楮实子颗粒、楮实子饮片或汤剂。
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2023
- 2023-09-07 CN CN202311158072.4A patent/CN117054567A/zh active Pending
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